Unknown Primary Tumors Are serum markers helpful?

Cosa dicono le evidenze? Linee guida valutate: 580 Linee guida selezionate 43 ACCP, ACN ACOG, AIOM, ASCO, ATA, ESMO, NACB NCCN, NICE, SIGN Tipi di neoplasia: 18 Marcatori: 20

Cosa dicono le evidenze? Raccomandazioni identificate relative all’uso dei marcatori nelle metastasi a partenza ignota: - Nessuna

Verdetto definitivo dalle evidenze? In realtà mancano studi primari di qualità adeguata per consentire la produzione di raccomandazioni Quale è lo stato dell’arte?

Marcatori Tumorali: definizione Ogni segnale biologico, misurabile nei liquidi corporei, correlato alla presenza di una neoplasia

Fattori influenti sui livelli ematici dei marcatori tumorali

I marcatori cosiddetti “tumorali” nel siero danno informazioni che sono la somma di numerose variabili fra le quali è compreso anche il tumore.

Marcatori o biomarcatori in oncologia Marcatori tumorali ? Marcatori o biomarcatori in oncologia

2010 – Di quali marcatori disponiamo? Marcatori quantitativamente modificati Marcatori qualitativamente modificati Marcatori di meccanismo Marcatori di risposta immunologica Marcatori associati ad acidi nucleici

Marcatori quantitativamente modificati Molecole a struttura chimica nota (marcatori classici, es. CEA, AFP, citocheratine, ormoni,….) Glicoproteine immunologicamente identificabili (epitopi noti, CA125, CA15.3, CA19.9, …) Biomarcatori di presenza e/o estensione

Marcatori qualitativamente modificati AFP isoforme 3 different glycoforms according to the binding to lectin (AFP-L1, AFP-L2, AFP-L3). AFP-L3 major glycoform in HCC Haptoglobulin isoforme alpha-2,6-sialylated HP and alpha-1,6-fucosylated HP. 18 glycoforms identified. Unique pattern of HP glycoforms found in HCC (IL Ang et al, 2006) Gamma-glutamyl transferase (GGT) isoenzimi 11 isoforms identified. Bands I’, II and II’ detected in HCC

Marcatori di meccanismo Cytokines/GF VEGF IL8 IL6 IL10 IL18 TGFb1 HGF/SF & c-Met …. Markers of genetic imbalance erbB2 erbB1 erbB1R Adhesion molecules E-caderin ICAM-1 Laminin-5 Osteopontin … Proteinases MMPs uPA system SCCA …..

Biomarcatori di meccanismo Razionale biologico “a priori” Sono espressione di meccanismi biologici conosciuti (attivazione oncogeni, angiogenesi, apoptosi, attivazione proteasi, …) Sono associati a variazioni del fenotipo tumorale correlate a comportamenti biologico-clinici (es.: aggressività, sensibilità ai farmaci, ...)

Marcatori di risposta immunologica Autoanticorpi HSP70 Peroxiredoxin Mn-superoxide dismutase P53 Immmunocomplessi SCCA-IgM AFP-IgM DCP-IgM

Marcatori associati ad acidi nucleici mRNA Specific marker mRNA (PSA, AFP, CEA, …) Telomerase reverse transcriptase mRNA TGF-b1 mRNA IGF-II mRNA …. DNA Circulating cell-free DNA Epigenetic changes promoter hypermethylation of p16, p15, RASSF1A, …

2010 – Di quali marcatori disponiamo? Marcatori quantitativamente modificati Marcatori qualitativamente modificati Marcatori di meccanismo Marcatori di risposta immunologica Marcatori associati ad acidi nucleici Di uso routinario Uso di nicchia, metodi non standardizzati Di grande interesse; in attesa di validazione Di grande interesse; in attesa di validazione Di grande interesse; in attesa di validazione

2010 – Di quali marcatori disponiamo? Marcatori quantitativamente modificati Di uso routinario

Che ruoli possono avere i biomarcatori quantitativamente modificati (marcatori tumorali classici) nei pazienti con metastasi a partenza ignota accertate o sospette?

Metastasi a partenza ignota Possibili ruoli dei marcatori Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Diagnosi di sede di origine Monitoraggio terapia

Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Razionale I livelli circolanti dei marcatori correntemente utilizzati sono proporzionali alla quantità di tumore I marcatori sono frequentemente elevati negli stadi avanzati In caso di malattia metastatica sono attesi valori elevati di marcatore, non compatibili in genere con malattia benigna

Ca125 - Sensibilità in relazione allo stadio CA 125 pretrattamento - Rapporto con lo stadio Revisione di 21 lavori (1041 casi, cutoff 35 U/ml)

Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Il problema dei falsi positivi Il rischio dei falsi negativi

Falsi positivi Cause analitiche Cause cliniche

Cause analitiche di falsi positivi HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies) presenti in soggetti cui sono stati somministrati anticorpi monoclonali (MAb) (immunoscintigrafia, radio-immunoterapia) presenti (raramente ed in concentrazioni basse) anche in soggetti normali non trattati con MAb possono generare interferenze in vitro in dosaggi immunometrici che usano MAb

Interference by human anti iso- or allotypic Abs

Interferenze da anticorpi umani anti-immunoglobuline murine (HAMA)

Quando si prevedono interventi diagnostici o terapeutici con anticorpi monoclonali (MAb) è necessario: considerare il rischio di perdere l’informazione fornita dal marker per un periodo che va da pochi mesi ad oltre un anno dall’ultima somministrazione di MAb; utilizzare per il dosaggio dei marcatori kit protetti per gli HAMA (addizionati di immunoglobuline o siero murino) e con architettura a due steps; dosare il tasso di HAMA o conservare il sangue per questa indagine (il grado di interferenza è proporzionale alla concentrazione di HAMA).

Cause analitiche di falsi positivi L’emolisi del campione NSE

Falsi positivi Cause analitiche Cause cliniche

Condizioni non neoplastiche responsabili di incrementi dei biomarcatori Eventi fisiologici e abitudini voluttuarie Patologie non tumorali Manovre diagnostiche

Cause diverse di incrementi non specifici dei marcatori Eventi fisiologici ed abitudini di vita

Cause cliniche di incrementi non specifici del marcatori Malattie benigne (1)

Cause Cliniche di incrementi non specifici del marcatori Malattie benigne (2)

Variazioni non specifiche dei marcatori Cause iatrogene

Falsi positivi … ... quanto positivi ?

Marcatori che possono essere molto elevati anche per condizioni non tumorali PSA CgA

Marcatori che possono essere molto elevati anche per condizioni non tumorali Ittero Pancreatite Epatite acuta Epatopatie croniche Malattie reumatiche Diabete Fibrosi cistica

Relationship between bilirubin and CA19.9 levels BR Osswald et al, Disease Markers 1993; 11: 275-278

Marcatori che possono essere molto elevati anche per condizioni non tumorali Mestruazione Gravidanza Iperstimolaz. Ovarica Endometriosi Flogosi pelvica S. di Meigs Malattie pleuriche Epatopatia (ascite) Chirurgia sull’adome

Cause non tumorali di incremento del CA125

CA 125 e chirurgia addominale Variazioni postoperatorie (a 5-7 giorni) (Yedema CA et al., Eur J Cancer, 1993)

Clearance lenta ( emivita 6 gg) CA 125 Clearance lenta ( emivita 6 gg) La normalizzazione dei livelli di CA 125 può richiedere tempi lunghi nel caso di valori preoperatori elevati.

CA 125. Incremento spurio postoperatorio Possibile in percentuali variabili di casi Dipendente dal traumatismo sul peritoneo Indipendente dalla patologia (ginecologica o no, maligna o no) Valore massimo raggiunto a distanza variabile (5-28 gg) Ritorno a valori “basali” lento (da 3 settimane a > 3 mesi)

Marcatori che possono essere molto elevati anche per condizioni non tumorali PSA Prostatite Biopsia prostatica recente

Marcatori che possono essere molto elevati anche per condizioni non tumorali Cromogranina A Inibitori della pompa protonica

Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Il problema dei falsi positivi Il rischio dei falsi negativi

Falsi negativi Cause analitiche Cause cliniche

Cause analitiche di falsi negativi HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies) presenti in soggetti cui sono stati somministrati anticorpi monoclonali (MAb) (immunoscintigrafia, radio-immunoterapia) presenti (raramente ed in concentrazioni basse) anche in soggetti normali non trattati con MAb possono generare interferenze in vitro in dosaggi immunometrici che usano MAb

Interference by human anti idiotype Abs

Interferenze da anticorpi umani anti-immunoglobuline murine (HAMA)

L’effetto gancio: un’importante causa di falsi negativi In campioni con concentrazioni estremamente elevate di antigene possono essere riscontrati livelli falsamente bassi dello stesso Dovuto a meccanismi complessi non ancora del tutto chiariti (effetto prozona, macro-aggregati micellari, …) Si può verificare più frequentemente in metodi di dosaggio immunometrico tipo “sandwich” Meno probabile con metodi a due incubazioni (la fase di lavaggio elimina l’eccesso di antigene presente nel campione)

Potenziali cause di falsi negativi: l’effetto gancio valore vero valore apparente

L’effetto gancio: Strategia consigliata Utilizzare possibilmente metodi a due incubazioni Registrare sempre notizie cliniche essenziali alla valutazione della plausibilità clinica del dato Se un risultato è incongruente con la situazione clinica ridosare il campione dopo diluizione. (Se esiste un effetto gancio, diluendo si nota un incremento anziché un’ulteriore diluizione dei livelli di antigene)

Falsi negativi Cause analitiche Cause cliniche

Il rischio dei falsi negativi I marcatori non hanno un valore predittivo negativo assoluto Livelli normali di un marcatore non escludono la presenza della neoplasia che abitualemente esprime quel marcatore. Eccezione: PSA

Staging del tumore primitivo Scintigrafia ossea vs Staging del tumore primitivo Scintigrafia ossea vs. PSA (521 pazienti MO, 71 M1) (Chybowsky et al., 1991)

Ca prostatico avanzato con PSA nei limiti di norma 976 casi (stadio C e D) 8 casi (0.8%) con PSA nei limiti 6 adenoca. moderatamente differenziati 1 small cell 1 cribriforme tutti con IIC negativa con anticorpi monoclonali anti PSA (JE Oesterling et al., J Urol 1993)

Metastasi a partenza ignota Possibili ruoli dei marcatori Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Diagnosi di sede di origine Monitoraggio terapia

Ricerca sede di origine di metastasi Le metastasi multiple (in particolare quelle epatiche) sono spesso causa di elevazione dei livelli ematici di numerosi marcatori (mucine, CEA, citocheratine, ……) L’uso dei marcatori può essere utile solo nei tumori secernenti marcatori organo specifici

Classificazione secondo specificità tissutale Biomarcatori con elevata specificità d’organo Biomarcatori che sono espressione di un dato tipo cellulare, ma non necessariamente dell'organo dove quel tipo cellulare è prevalente Biomarcatori che sono espressi in modo quantitativamente prevalente da neoplasie di un dato tipo istologico

Marcatori con elevata specificità d’organo Biomarcatore TG PSA hCG Organo o tessuto Tiroide Prostata Sinciziotrofoblasto

Serotonina e metaboliti Catecolamine e metaboliti Biomarcatori espressi da un dato tipo cellulare, ma non solo dell'organo dove quel tipo cellulare è prevalente Calcitonina NSE Cromogranina A Serotonina e metaboliti Catecolamine e metaboliti

Calcitonina Carcinoma midollare della tiroide Carcinoidi Tumori endocrini del tubo digerente Tumore a piccole cellule del polmone

NSE Tumore a piccole cellule del polmone Tumori neuroendocrini Neuroblastoma Tumore di Wilms Melanoma Linfomi Teratomi Timoma

Cromogranina A Serotonina e metaboliti Catecolamine e metaboliti Tumori neuroendocrini

Marcatori associati in modo quantitativamente prevalente ad un dato tipo istologico Carcinomi di tipo squamoso SCC TPA Cyfra21.1 TPS TPAcyk

Marcatori associati in modo quantitativamente prevalente ad un dato tipo istologico Adenocarcinomi CEA CA19.9 CA15.3 CA27.29 MCA CA50 altri biomarcatori mucinici

Marcatori di tipo mucinico: specificità d’organo

Metastasi a partenza ignota

Metastasi a partenza ignota Possibili ruoli dei marcatori Diagnosi di tumore (sono metastasi)? Diagnosi di sede di origine Monitoraggio terapia

Obiettivo Monitoraggio ed aggiustamento tempestivo della strategia terapeutica

Come monitorare attività ed efficacia con i biomarcatori ? Danno indicazioni generiche, indipendenti dal tipo di terapia instaurato Sono utili soprattutto nel caso di malattia non misurale Sono meglio associati alla non-risposta (85-90%) che alla risposta (70%) Esistono indicazioni all’utilizzo routinario solo per poche neoplasie

Monitoraggio terapia per la malattia avanzata Consenso Neoplasia Marcatori Alto Ca. a cellule germinali hCG, AFP Medio Ca. Prostata PSA Ca. Ovaio Ca125 Ca. Colon-retto CEA Ca. Mammella Ca15.3 Metastasi a partenza ignota Marker elevati all’esordio

Unknown Primary Tumors Are serum markers helpful?

Take-home message Le evidenze disponibili non sono sufficiente a formulare raccomandazioni evidence-based La diagnosi di malattia disseminata non si bsa sui biomarcatori. Alcuni biomarcatori possono essere di aiuto per orientare il percorso diagnostico Solo pochi marcatori, altamente specifici per organo, possono orientare verso la sede di origine (da questi sono esclusi i marcatori mucinici) Anche quando la sede di partenza rimane ignota, la determinazione di marcatori è utile per disporre di uno strumento di monitoraggio della risposta alla terapia

Situazioni fisiologiche in grado di modificare i livelli di Cromogranina A Stress Attività fisica intensa Gravidanza

Monitoraggio terapia per la malattia avanzata Consenso Neoplasia Marcatori Alto Ca. a cellule germinali hCG, AFP Medio Ca. Prostata PSA Ca. Ovaio Ca125 Ca. Colon-retto CEA Ca. Mammella Ca15.3 Metastasi a partenza ignota Marker elevati all’esordio

Situazioni non neoplastiche in grado di modificare i livelli di Cromogranina A Ipertensione essenziale Insufficienza renale cronica Morbo di Parkinson Gastrite cronica atrofica Malattie infiammatorie dell’intestino Epatopatia cronica

Farmaci in grado di modificare i livelli di Cromogranina A Diminuzione Antagonisti dei canali del calcio (verapramil) Agenti bloccanti gangliari (trimethaphan) . . . . Aumento Inibitori della pompa protonica Vasodilatatori (amilonitrito) Tiramina

Classificazione ad orientamento clinico Biomarcatori nei tumori neuroendocrini Classificazione ad orientamento clinico

Tumori neuroendocrini e biomarcatori Biomarcatori tipo-specifici (specifici di un dato tipo di neoplasia neuroendocrina) Sostanze (peptidi, ormoni, amine) che, in genere, danno origine a sindromi cliniche Biomarcatori non tipo-specifici (biomarcatori generici di neoplasia neuroendocrina) Sostanze in genere non correlate ad alcun quadro sintomatologico noto

Biomarcatori tipo-specifici Sono molto numerosi Produzione e rilascio variano in modo consistente in relazione al tipo cellulare (oltre 60) ed alla sede della neoplasia (oltre 15) La scelta del tipo di marcatore da cercare è guidata dalla sede e dalla sintomatologia Alcuni sono raccomandati per le specifiche neoplasie da linee guida internazionali

biomarcatori tipo-specifici insulina gastrina glucagone VIP somatostatina pancreatic polipeptide ACTH, GFR GEPs (insulinoma) GEPs (gastrinomas) GEPs (glucagonoma) GEPs (VIPomas) GEPs (somatostatinoma) GEPs (Ppomas) rare functioning NETs Nordic NE Tumour Group 2004, Consensus Report 2004, NACB 2005, UKNETwork 2005, ENETS 2006, NCCN 2007

Biomarcatori tipo-specifici Punti critici Le casistiche sono spesso troppo disomogenee per raggiungere un buon grado di evidenza per ciascun biomarcatore I metodi di dosaggio sono poco standardizzati ed eseguiti troppo sporadicamente per fornire risultati generalizzabili Circa 1/3 di tumori neuroendocrini non producono e/o rilasciano sostanze che inducono sintomi specifici (silenti)

Biomarcatori “non” tipo specifici Associati genericamente alla origine “neuroendocrina” della neoplasia Associati spesso alla quantità di neoplasia presente Misurabili anche in neoplasie silenti

Biomarcatori “non” tipo specifici Punti critici non sono in grado di distinguere i diversi sottotipi di NETs i biomarcatori non sono specifici: valori elevati sono stati documentati in pazienti con patologie benigne o per cause iatrogene specificità e sensibilità molto variabili

Biomarcatori “non” tipo specifici Possibili candidati Cromogranina A PP hCG-a NSE

Distribuzione del PSA in soggetti con cancro prostatico (JF Myrtle,1986)

Biomarcatori di meccanismo Il problema dei falsi positivi

Expression and release by diverse body compartments – Clinical meaning Tumor bulk related biomakers vs Angiogenesis biomakers

Expression and release by diverse body compartments – Clinical meaning Tumor bulk related biomakers Expression and release by the tumour: Meaningful increase (signal) Expression and release by the other cells/tissues other that the tumour Spurious increases (noise)

Expression and release by diverse body compartments – Clinical meaning Angiogenesis biomakers Expression and release by the tumour: Meaningful increase (signal 1) Expression and release by the other cells/tissues other that the tumour Possible meaningful increases (signal 2)

Biomarcatori in oncologia Definizione Interpretazione del referto Indicazioni all’uso clinico

Biomarcatori in oncologia Interpretazione del referto Sono ugualmente efficaci in tutte le fasi della malattia? L’effetto della prevalenza

Situazione ideale Situazione reale VN FP FN VP VN FP FN VP Situazione reale Cut-off

Limiti di accuratezza diagnostica In uno scenario reale è importante distinguere fra … Sensibilità Valore predittivo … tenendo in considerazione la prevalenza della malattia

Sensibilità vs. Valore Predittivo Positivo Veri positivi SS = Veri positivi + Falsi negativi (totale dei malati)

Sensibilità Indica la probabilità che un paziente con tumore abbia il marker positivo dipende dalle performances diagnostiche del marker

Effetto della prevalenza sulla sensibilità VN FP FN VP VN FP FN VP Cut-off

Sensibilità vs. Valore Predittivo Positivo Veri positivi VPP = Veri positivi + Falsi positivi (totale dei positivi)

Valore Predittivo Positivo Indica la probabilità che una persona con marker positivo abbia effettivamente un tumore dipende dalle performances diagnostiche del marker dipende dalle caratteristiche della popolazione esaminata

VN FP FN VP VN FP Cut-off Effetto della prevalenza sul valore predittivo positivo VN FP FN VP VN FP FN VP Cut-off

Sensibilità vs. Valore Predittivo Situazione 1: Diagnosi di ricaduta dopo il trattamento del tumore primitivo sensibilità: 80% specificità: 90% soggetti esaminati: 100 probabilità di ricaduta: 50/100 malati attesi nel campione: 50

Diagnosi di ricaduta dopo la terapia primaria

Sensibilità vs. Valore Predittivo Situazione 2: Screening di tumore nella popolazione generale sensibilità: 80% specificità: 90% soggetti esaminati: 100.000 probabilità del tumore: 50/100.000 malati attesi nel campione: 50

Screening di popolazione asintomatica

Biomarcatori in oncologia Definizione Interpretazione del referto Indicazioni all’uso clinico

3. Interazioni di compartimenti tissutali diversi Significato clinico Biomarcatori tradizionali versus Biomarcatori di angiogenesi

3. Interazioni di compartimenti tissutali diversi Significato clinico Biomarcatori tradizionali Produzione da parte del tumore: incremento significativo (segnale) Produzione da parte di altre cellule/tessuti: incrementi spuri (rumore)

3. Interazioni di compartimenti tissutali diversi Significato clinico Biomarcatori di angiogenesi Produzione da parte del tumore: incremento significativo (segnale 1) Produzione da parte di altre cellule/tessuti: incremento significativo (segnale 2)