il test ha valenza predittiva terapeutica e prognostica L’ iperespressione o l’ amplificazione oncogene HER2 è presente nel 20-25% tumori mammari .Esso è localizzato sul braccio corto del chr 17 e codifica una glicoproteina che promuove la moltiplicazione cellulare il test ha valenza predittiva terapeutica e prognostica IIC : risultati equivoci nel 12 - 15% Italian Network for Quality Assessment of Tumor Biomarkers (INQAT) Coinvolti 82 centri per complessive 24.000 pazienti Hercep Test 12% dei casi sono equivoci Carcinomi HER2+ sono il 20%

Test biologia molecolare ibridizzazione in situ FISH ibridizzazione fluorescente CISH ibridizzazione cromogenica SISH ibridizzazione argentica

Fig 1. Algorithm for immunohistochemistry (IHC) Wolff, A. C. et al. J Clin Oncol; 25:118-145 2007

Fig 2. Algorithm for fluorescent in situ hybridization (FISH) Wolff, A. C. et al. J Clin Oncol; 25:118-145 2007

La FISH valuta contemporaneamente sulla stessa sezione il numero di copie sia del HER2 che del Chr 17 su cui risiede il gene. Essa è considerata: più sensibile più oggettiva ma costi più elevati e difficile correlazione morfologica La determinazione dell’amplificazione dell’HER2 può essere migliorata con la nuova tecnica di ibridizzazione in situ che utilizza un sistema di rivelazione cromogenica (CISH) o l’argentica (SISH) che permettono il confronto con il dettaglio morfologico e consentono la conservazione materiale

Milestones Reporting significativo (FDA score o opzioni alternative?) Test HER2 di tutti i tumori primitivi della mammella per pianificare la terapia Rivaluazione della malattia metastatica (status differente in quasi 15% delle pazienti) Scelta del test Reporting significativo (FDA score o opzioni alternative?)

Arch Pathol Lab Med – ottobre 2009 PROTOCOLLO CAP IHC Score Criteri % casi % amplificazione FISH 0 negativo assente immunoreattività ≤ 10% ≈ 60 0 – 3 1+ negativo debole o parziale colorazione ≈ 10 0 - 7 membrana cit. > 10% cellule 2 + lieve o moderata colorazione ≈ 5 – 10 25 - 35 o “equivoci” circonferenziale membrana > 10 % o < 30% cell. tumorali con intensa colorazione circonferenziale 3 + positivo > 30% cell. tumorali con ≈ 15 -20 ≈ 95 (tale % è in intensa colorazione circonferenziale rapporto > 30%) membrana citoplasmatica

2 tecnologie riconosciute IHC e FISH Immunoreattività forte Requisiti minimi e standard di refertazione condivisi tra anatomopatologo e oncologo A.P. Dei Tos, C. Nisticò, A. Sapino 2 tecnologie riconosciute IHC e FISH Immunoreattività forte 3+ in > 30% cellule neoplastiche Amplificazione Gene con FISH o CISH FISH amplificato: copie geni HER2/segnali centromerici CEP17 > 2.2 dubbio: 1.8 – 2.2(ripetere conta o test) non amplificato: < 1.8 CISH > 6 segnali per cellule

L’aumento del cut-off a > 30% riduce la discordanza tra i IIC e FISH per ottenere migliori indicazioni terapeutiche ma quali implicazioni del <30%? sono amplificate? trattare o non trattare?

REFERTO COMPLETO E “TRASPARENTE”

Ancora oggi si rilevano problematiche nella standardizzazione delle procedure,legate sia a limiti strumentali/tecnici che a difficoltà di interpretazione di risultati Margine errore: IIC + ISH = 15-20% 7-10% pazienti potenzialmente eleggibili trattamento non ricevono terapia adeguata

CAUSE ERRORI TEST IIC HER2 FASE PREANALISI Tempo e tipo di fissazione Metodo di processazione FASE ANALISI Standardizzazione procedure Scelta del tipo di anticorpo e materiali Validazione test POST ANALISI Criteri di interpretazione accreditamento laboratorio appropriatezza test Uso imaging

USO IMAGING

Il ruolo del patologo Essere a conoscenza delle decisioni che l’oncologo deve prendere Costo/benefici favorevole Essere consapevole della rilevanza clinica delle valutazioni istologiche e biologiche

Cosa fare? Central Reference or large local laboratories high number of cases (>250 cases/year [UK] or >100 cases/months [NSABP]) quality assurance controls (internal and external) automated IHC high level of training (technique/interpretation) Small laboratories (<250 cases/yr or <100 cases/mos* do not do it send to larger laboratories *Ellis I, et al: J Clin Pathol 2004

Come affrontare queste questioni? Limiti degli studi retrospettivi sulle pazienti dei trials clinici “hypothesis generating” Nuovi trials clinici “mirati” Per popolazioni di pazienti accuratamente selezionate Valutazione prospettica di variabili biologiche predefinite Confermare o respingere ipotesi generate dagli studi retrospettivi Identificare nuovi fattori predittivi 25

Perché noi vogliamo (dovremmo volere): Dimostrare che sappiamo come prenderci la miglior cura possibile delle nostre pazienti, e che siamo pronti a farlo Aumentare il peso del nostro contributo alla ricerca clinica Acquisire una maggiore “visibilità” agli occhi delle pazienti, dei clinici e dell’industria del farmaco Rendere il nostro lavoro sempre più attraente per noi e per i nostri giovani 26

In cambio di cosa? Rimborso diretto dei costi aggiuntivi Un patologo “dedicato” in ogni Centro, per ogni trial Presente e pro-attivo nelle riunioni di pianificazione e di conduzione del trial, sia a livello locale che “centrale” (investigators’ meetings, Scientific, Steering e Executive Committees) Condivisione dei successi della ricerca clinica Pubblicazioni, presentazione a congressi,… 27

FISH Positiva: HER2 / Cr 17 ≥ 2 o se ci sono 4 copie del gene HER2 per cellula tumorale se non è utilizzato il cromosoma 17 come riferimento CISH Positiva > 5 copie del gene HER2 per nucleo presente in più 50% cellule tumorali

MODALITA’ INTERPRETAZIONE L’interpretazione dei risultati con metodica CISH e FISH (tenendo presente che l’amplificazione è il risultato del rapporto tra numero di coppie del gene HER2 e del cr. 17) si basa su esame sezione: tutta a 20X raffrontando le cellule neoplastiche con quelle normali (linfociti, endotelio,ecc.) per confrontare le dimensioni dei segnali e per il loro conteggio. a 40X in caso di sicura amplificazione (> 10 segnali o clusters) o non amplificazione (1-4 segnali) a 63X o 100X quando il numero dei segnali è tra 5 e 10 contando almeno 40 cell.