DIAGNOSTICA DELL’EMOFILIA ACQUISITA Serena Torre Laboratorio di Emostasi e Trombosi Ospedale San Giovanni Bosco

SINDROMI “EMORRAGICHE” ACQUISITE da AUTOANTICORPI S. dell’emofilia acquisita Fattore VIII S. di von Willebrand acquisita Fattore von Willebrand Altri deficit acquisiti Fattore IX, V, VII, da autoanticorpi XI, XIII

EMOFILIA ACQUISITA Patologia emorragica “acquisita” rara Incidenza: 0.2 - 1.0 caso/milione/anno Distribuzione bifasica dell’età di insorgenza con picchi tra 20-30 e 60-80 anni Quadro clinico dominato spesso da emorragie gravi Mortalità fino al 22% in diverse casistiche

CONDIZIONI CLINICHE SPESSO ASSOCIATE A EMOFILIA ACQUISITA Tumori Solidi (prostata, polmone)/ Emopatie maligne (leucemia linfatica cronica, linfoma) Neoplasie Gravidanza/Periodo peri/post-partum Interventi chirurgici Penicillina/ Ampicillina/ Cloramfenicolo/ Fenintoina ed altri anticonvulsivanti / Sulfonamide/ Interferone α/Fludarabina Reazioni farmacologiche A. Reumatoide/ LES/ Arterite temporale/ Colite ulcerosa/ Dermatomiositi/ Polimiositi/ Miastenia grave /Sclerosi multipla/ Asma/ Penfigo/ Dermatosi aspecifica/GVHD/Sclerosi multipla Malattie autoimmuni/ Malattie a base immunologica

SPECIFICITÀ EPITOPICA DEGLI AUTOANTICORPI Più frequentemente gli autoanticorpi riconoscono epitopi localizzati tra gli aa 454-509 e 593 del dominio A2, 1804- 1819 del dominio A3, 2181-2243 del dominio C2

MECCANISMO D’ INIBIZIONE Anti-C2: inibiscono il legame del FVIII ai PL e possono interferire con il legame al vWF Anti-A2 e Anti-A3: impediscono il legame con il FIX e il FX

ALLOANTICORPI AUTOANTICORPI (Emofilia) (Emofilia Acquisita) Diretti contro più epitopi Inibizione FVIII con cinetica di Tipo I (lineare) AUTOANTICORPI (Emofilia Acquisita) Diretti contro un unico epitopo Inibizione FVIII con cinetica di Tipo II (complessa)

CINETICHE DI INATTIVAZIONE DEL FVIII Boggio NL. Rev Clin Exp Haematol 2001

CARDINI DIAGNOSTICI Anamnesi negativa per precedente diatesi emorragica PT normale Normale conta piastrinica aPTT allungato non corretto dall’aggiunta di un eguale volume di plasma normale (test di miscela) Bassi livelli di FVIII

aPTT: TEST di MISCELA miscela 1:1 incubazione a 37°C aPTT Plasma del paziente Plasma normale miscela 1:1 incubazione a 37°C aPTT

VALUTAZIONE DEL TEST DELLA MISCELA Secondi M- N < 5 s : corregge. M- N  5 s : non corregge. Ratio M/N < 1.20: corregge.  1.20: non corregge. Indice di Rosner (ICA) = (M - N/P) x 100 < 15% corregge.  15% non corregge. % di correzione = (P-M)/(P-N) x 100 > 70% corregge. < 58% non corregge. % di correzione = (P-M 4:1)/(P-N) x 100 Immediato:  50% corregge. < 50% non corregge. Incubato: > 10% corregge. (100% Sens. e Spec.) Chang S. Am J Clin Pathol 2002

Test aPTT della miscela DIAGNOSI DI LABORATORIO Test aPTT della miscela aPTT mix allungato: presenza di inibitori aPTT mix normale: carenza di fattori Dosaggio FVIII, FIX,FXI,FXII Dosaggio FVIII, FIX, FXI, FXII, Un fattore ridotto Più fattori ridotti Ricerca inibitore specifico (metodo Bethesda) Ricerca LAC Carenza di un fattore

DOSAGGIO DELL’INIBITORE: principio Il test viene eseguito creando miscele (in parti uguali) di un pool di plasma normale con il plasma del paziente (mix da testare) e di un pool di plasma normale con tampone imidazolo a pH 7.4 (mix di controllo) Dopo 2h di incubazione a 37°C, viene determinata la percentuale relativa di attività di FVIII della mix da testare che, rapportata a quella della mix di controllo, determina l’attività residua di FVIII. Si possono esaminare solo campioni privi di attività FVIII.

DOSAGGIO DELL’INIBITORE: materiali Plasma citratato ( può essere congelato) Plasma normale di riferimento ( pool di plasma normale) Tampone Imidazolo 0.1M, pH 7.4 Reagenti per il dosaggio fattori, metodo ad un tempo

METODO BETHESDA-NIJMEGEN Limiti del metodo Bethesda: Numerosi falsi positivi per valori vicino al cut- off di consenso (BU < 0.5/ml)  bassa specificità Aumento del pH nella miscela da testare  Inattivazione del FVIII Diminuzione della concentrazione proteica nella miscela da testare  Inattivazione del FVIII

METODO BETHESDA-NIJMEGEN Plasma normale tamponato a pH 7.4 Plasma del paziente 50/50 mix Plasma carente di FVIII Incubare 2h 37°C Miscela da testare Miscela di controllo Dosaggio del FVIII Giles A.R. Thromb Haemost 1998

DEFINIZIONE DI UNITÀ NIJMEGEN-BETHESDA PNP FVIII 100% Miscela isovol. Paziente/PNP FVIII 50% Plasma del Paziente PNP pool 1 Unità Bethesda-Nijmegen è pari alla quantità di inibitore in grado di inattivare il 50 % di FVIII di un pool di riferimento, dopo 2 h di incubazione. FVIII miscela di controllo Attività residua = x 100 FVIII miscela da testare IN BASE ALLA DEFINIZIONE DI UNITA’ DI INIBITORE SI COSTRUISCE UNA TABELLA DI CONVERSIONE TRA: FVIII RESIDUO % e U. DI INIBITORE per mL di plasma

CURVA DI CONVERSIONE ESEMPIO 18% 1,5U/ml

ALGORITMO DIAGNOSTICO aPTT della miscela Positivo (interferenza) Negativo (carenza) FVIII (1 tempo) FVIII <<< FVIII < Bethesda positivo FVIII cromogenico normale LAC test LAC test Negativo Positivo Positivo Diagnosi EAA complicata da LAC Diagnosi EAA Diagnosi LAC

(studi di mixing) = esclusione eventuali carenze di fattori DIAGNOSI LUPUS ANTICOAGULANT Criteri per la diagnosi di LA proposti dai SSC della ISTH Prolungamento di un test PL dipendente (test di screening) Mancata correzione del prolungamento aggiungendo al plasma del paziente plasma normale (studi di mixing) = esclusione eventuali carenze di fattori Correzione del prolungamento aggiungendo al plasma del paziente un eccesso di fosfolipidi (test di conferma) = dimostrazione che l’inibitore presente è diretto contro i PL Brandt JT, Thromb Haemost 1995; 74: 1185-90

TESTs PER LA RICERCA DEL LA Test di screening: PTT-LA PTT-LA mix KCT (sec.) KCT mix DRVVTest DRVVT mix Test di conferma: SCT1 ratio (bassa conc. PL) SCT2 ratio (alta conc. PL) DRVVTest confirm

DIAGNOSI DIFFERENZIALE Test di screening PL dipendenti Studi di mixing 1:1 corregge non corregge Dosaggio fattori Test di conferma con eccesso di PL non corregge corregge Test per Ab anti fattori Diagnosi di LA

Diagnosi CONCLUSIONI Dati clinici anamnestici ed attuali Dati di laboratorio Diagnosi La diagnosi deriva dalla corretta valutazione delle informazioni cliniche e dei dati di laboratorio ottenuti mediante la esecuzione di tests mirati.