ESERCITAZIONE 1: calcolo della massa teorica e sperimentale di mioglobina equina a) Calcolo massa teorica di mioglobina equina 1 Collegarsi al sito : http://www.uniprot.org/ e nella query inserire myoglobin horse

2. Copiare la sequenza escludendo il peptide segnale

3. Aprire il programma Molecular Weight Calculator, nella barra tools aprire il sottoprogramma peptide sequence fragmentation modelling e inseire la sequenza nell’apposito spazio. Annotare i valori della massa media e monoisotopica della forma monoprotonata

b) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante deconvoluzione 1. Aprire il programma Xcalibur e quindi il sottoprogramma Qual Browser 2. Aprire il file myoglobin e visualizzare lo spettro di massa

3. Cliccando con il tasto destro del mouse, selezionare clipboard e quindi export (exact mass)

4. Aprire il programma magtrans, con il tasto destro cliccare su paste data. In tal modo compare lo spettro di massa con le cariche assegnate

5. Andare su options, transform options e quindi impostare i parametri

6. Annotare la massa della proteina nello spettro deconvoluto

b) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante analisi pattern isotopico 1. Magnificare lo spettro di massa fino a visualizzare il pattern isotopico di un segnale multicarica (es. il pattern a 999.95)

2. Selezioanre il delta m/z di tue linee tra adiacenti e calcolare lo stato di carica [z=1/m/z)] (n.b. IMPORTANTE con il tasto destro selezionare display options quindi labels e digitare 5 cifre decimali 3. Calcolare la massa sulla base del rapporto m/z e dello stato di carica MW= [(m/z x z)-z]

c) Calcolo massa sperimentale di mioglobina equina mediante sistema a due variabili 1. A partire dallo spettro di massa, identificare due ioni multicarica tra loro adiacenti (es. m/z1133.27 e 1214.15) 1133.27= (Mr+z1)/z1 (1.1) 1214.15= [Mr+(z1-1)]/(z1-1) (1.2) p1= valore m/z del picco p1 p2= valore m/z del picco p2 z1= carica del picco p1 Mr= massa media della proteina Le equazioni 1.1 e 1.2 possono essere risolte mediante un sistema a due incognite (Mr e z1). 2. La risoluzione del’equazione sovra riportata permette di calcolare il valore z1 e quindi la massa 3. Calcolare l’accuratezza a partire dalla massa teorica e sperimentale

Risultati Riportare i valori di massa teorica e sperimentale (quest’ultima determinata nei tre differenti modi) e quindi calcolare l’accuratezza per ogni valore di massa sperimentale in ppm applicando la seguente formula: Accuratezza= [(massa teroica-massa sperimentale)/massa teroica]x1000000