1) Isolamento e Purificazione dei Composti Organici IL LABORATORIO DI CHIMICA ORGANICA 1) Isolamento e Purificazione dei Composti Organici 2) Cromatografia

L’ESTRAZIONE liquido-liquido Principi Generali   Il principio che regola la distribuzione di una sostanza tra due solventi immiscibili è la legge di ripartizione o di distribuzione di Henry K = CB/CA K è il coefficiente di ripartizione o di distribuzione E se uso le solubilità: K = gB/gA x VA/VB Inoltre se: Va volume della soluzione da estrarre (fase di origine) g0 massa in grammi del soluto Vs volume del solvente che si usa per l’estrazione (fase estraente) gS massa del soluto che viene estratta C0 concentrazione del soluto dopo estrazione nella fase di origine CSOLV concentrazione del soluto nella fase estraente Dalla relazione K = CSOLV/C0 si ricava K = (gS/VS)/[ (g0 -gS)/ Va] da cui: gS = g0(K Vs)/ (K Vs + Va) e se g2 è la quantità che viene estratta con una seconda estrazione: g2 = gS(K Vs)/ (K Vs + Va) = g0[(K Vs)/ (K Vs + Va)]2 e per n estrazioni: gn = g0[(K Vs)/ (K Vs + Va)]n

gn = g0[(K Vs)/ (K Vs + Va)]n

ESTRAZIONE DISCONTINUA La scelta del solvente più adatto si basa su alcune considerazioni: ---- K deve essere il più alto possibile ---- L’estrazione deve essere selettiva ---- Il solvente deve essere facilmente allontanato ---- I due solventi devono avere densità diverse

ESTRAZIONE IN CONTINUO Estrattore per un solvente estraente a densità superiore Estrattore per un solvente estraente a densità inferiore Estrattore solido-liquido

PROBLEMI SPERIMENTALI NELL’ESECUZIONE DI ESTRAZIONI LIQUIDO-LIQUIDO Formazione di Emulsioni 1) Agitare con una bacchetta lentamente o far ruotare a vortice o centrifugare 2) Aumentare il volume di solvente estrattore 3) Aggiungere NaCl o una soluzione satura di Sali di Na o di ammonio 4) Filtrare la massa e senza agitare riversare nell’imbuto 5) Far gorgogliare un gas o riscaldare delicatamente 6) Aggiungere alcune gocce di alcool PROBLEMI SPERIMENTALI NELL’ESECUZIONE DI ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO PROBLEMI SPERIMENTALI NELL’ESECUZIONE DI ESTRAZIONI LIQUIDO-LIQUIDO

ESTRAZIONE DI COMPOSTI ORGANICI ACIDI E BASICI

ESSICCANTI

CRISTALLIZZAZIONE

Il processo di cristallizzazione   1)      scelta del solvente 2)      solubilizzazione della sostanza da purificare nella minima quantità di un opportuno solvente (o miscela di solventi) ad una temperatura vicina al punto di ebollizione 3)      filtrazione della soluzione calda per allontanare impurezze insolubili e polveri 4)      raffreddamento del filtrato per permettere la cristallizzazione del prodotto principale 5)      separazione dei cristalli mediante filtrazione 6)      essiccamento dei cristalli 7)      controllo del grado di purezza raggiunto

DISTILLAZIONE

DISTILLAZIONE A PRESSIONE RIDOTTA Evaporatore Rotante

CROMATOGRAFIA La cromatografia è una tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela basata sulla differente distribuzione delle speci da separare tra una fase mobile (liquido, gas o fluido supercritico) e una fase stazionaria immiscibile eventualmente posta su di un opportuno supporto Principi della separazione cromatografica Il coefficiente di distribuzione (K) è il rapporto tra la concentrazione di una sostanza in due fasi immiscibili: concentrazione nella fase stazionaria concentrazione nella fase mobile    I composti da separare hanno coefficienti di distribuzione diversi nelle due fasi. K =

TIPI DI CROMATOGRAFIE    Cromatografia su carta: la fase stazionaria liquida è legata alle fibre di cellulosa della carta. La fase mobile liquida sale, per capillarità, lungo la carta. Cromatografia su strato sottile (TLC): la fase stazionaria, legata ad una matrice, è stratificata su vetro, plastica o metallo. La fase mobile liquida sale, per capillarità, sullo strato sottile. Cromatografia su colonna: la fase stazionaria, attaccata ad una matrice, è impaccata in una colonna di vetro. La fase liquida mobile viene fatta passare per gravità o sotto pressione attraverso la colonna.

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) Deposizione del campione su lastra per TLC

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE Eluizione

Fattore di Ritenzione Rf= A/S

CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI e) cromatografia di affinità in cui sulla fase stazionaria ci sono ligandi immobilizzati e si stabilisce un equilibrio tra una fase liquida mobile e il soluto che interagisce con queste molecole

CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO CROMATOGRAFIA SU COLONNA                      

CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO Cromatografia su colonna

CROMATOGRAFIA DI ASSORBIMENTO Cromatografia su colonna

CROMATOGRAFIA SU COLONNA A MEDIA-PRESSIONE

HPLC (high performance liquid chromatography

Schema di Cromatografia su colonna a media e alta pressione

Il sistema di pompe deve garantire una pressione in uscita di almeno 5 x 107 Pa, la capacità di flusso deve essere di almeno 10 ml/min per le separazioni preparative; non ci devono essere pulsazioni. Esistono 2 tipi di pompe: pompe a pressione costante: funzionano mediante l’introduzione nella pompa di un gas sotto pressione che spinge l’eluente in colonna. Questo tipo di pompa dà un flusso senza pulsazioni, ma non è in grado di compensare un’eventuale diminuzione della velocità di flusso dovuta a variazioni della permeabilità della colonna. pompe a portata costante: sono in grado di mantenere sempre una velocità di flusso costante in colonna, ma danno piccole pulsazioni. In queste pompe un volume fisso di solvente viene spinto in colonna da un pistone.

La valvola di iniezione il campione può essere iniettato direttamente in colonna oppure attraverso un iniettore a spirale (loop). L’iniezione può avvenire a flusso interrotto (a pressione atmosferica) oppure nel sistema sotto pressione. Spesso viene utilizzata una precolonna.

COLONNE PER HPLC Le colonne per HPLC sono in acciaio inossidabile e sostengono una velocità di flusso di 2 ml/min.(analitiche) Le colonne preparative sopportano una velocità di flusso di 100 ml/min. Misurano 5-25 cm Hanno un diametro di 4.6 mm Le particelle hanno dimensioni di 3-10m

Selettività a = k’B / k’A Risoluzione R = 2[tR(B) - tR(A)] / [Wh(A) + Wh(B)] Capacità k’ = (tR – tM) / tM Selettività a = k’B / k’A Efficienza N = 16(tR/Wb)2 oppure n = 5.54(tR/Wh)2

Eq. di Van Deemter: HEPT = A + B/u + Cu A = diffusione microvorticosa B = diffusione molecolare longitudinale C = resistenza al trasferimento di massa u = velocità lineare media del gas/liquido di trasporto HEPT (Height Equivalent of a Theoretical Plate) = L/N L = lunghezza della fase stazionaria N = numero di piatti teorici

La cromatografia di ripartizione può essere di due tipi:   cromatografia liquida in fase normale: la fase stazionaria è più polare della fase mobile (che è un solvente organico); gli analiti vengono eluiti in ordine di polarità crescente. cromatografia liquida in fase inversa: la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. La fase stazionaria è costituita da gruppi alchilsilanici legati chimicamente alla silice (butile, ottile, ottadecile). Come fase mobile si possono utilizzare solventi organici (metanolo, acetonitrile, tetraidrofurano), ma anche tamponi acquosi. L’eluizione degli analiti avviene in ordine di polarità decrescente.

Cromatografia liquida in fase normale La separazione degli analiti dipende dalle interazioni con la fase stazionaria polare.

Cromatografia liquida in fase inversa Nella RPC l’idrofobicita’, che dipende dalla polarita’ e dalle dimensioni dell’analita, e’ cio’ su cui si basa questo metodo di separazione. Maggiore è l’idrofobicita’ di una molecola e piu’ a lungo rimarra’ sulla fase stazionaria.

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO   La separazione avviene sulla base della carica netta delle proteine (che dipende dal pKa della molecola e dal pH della soluzione). La fase stazionaria porta gruppi funzionali ionizzabili accoppiati ad una matrice inerte (scambiatore ionico). Queste cariche immobilizzate sono associate elettrostaticamente a controioni scambiabili della soluzione. Le molecole cariche da separare competono con i controioni per il legame ai gruppi carichi della fase stazionaria e vengono separate in base alla loro carica.

Cromatografia a scambio ionico

Cromatografia a scambio ionico

Cromatografia a scambio ionico

Il meccanismo di scambio ionico avviene in 5 passaggi: scambiatori cationici (carichi negativamente) scambiatori anionici (carichi positivamente).   Il meccanismo di scambio ionico avviene in 5 passaggi:   1. diffusione dello ione sulla superficie di scambio 2. diffusione dello ione all’interno della matrice fino al sito di scambio. E’ il passaggio limitante. 3. scambio degli ioni Scambiatore cationico: Scambiatore anionico: 4. diffusione dello ione scambiato sulla superficie 5. eluizione della molecola, mediante variazione del pH o della forza ionica RSO3- …Na+ + +NH3R’ RSO3-… NH3R’ + Na+   R4N+ …Cl- + -OOCR’ +R4N… -OOCR’ + Cl-  

Gli scambiatori forti, sono totalmente ionizzabili a tutti i valori di pH: sulfonato -SO-3 e l’ammonio quaternario -N+R3 Gli scambiatori deboli sono ionizzabili solo ad un ristretto intervallo di pH: ione carbossilato -COO- e il dietilammonio -H+N(CH2CH2)2

SIZE EXCLUSION (gel permeation) CROMATOGRAPHY

CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’   La cromatografia di affinità non sfrutta delle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole, ma si basa su interazioni biologiche specifiche. La specificità di queste interazioni spesso coinvolge tipi diversi di legame. E’ il tipo di cromatografia più selettivo, può essere utilizzato come primo passaggio, per la purificazione sia di proteine che di acidi nucleici.

La matrice: destrano, agarosio, poliacrilamide  La matrice ideale deve avere le seguenti caratteristiche: avere gruppi chimici adatti ed in numero sufficiente per il legame covalente con il ligando. essere stabile nelle condizioni di legame e nella successiva eluizione minimizzare l’adsorbimento aspecifico avere buone proprietà di flusso.

SEPARAZIONE CROMATOGRAFICA SU CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’   La matrice, accoppiata al ligando, viene impaccata in colonna. La colonna viene equilibrata. Dopo aver caricato il campione, la colonna viene lavata con il tampone di equilibramento, per rimuovere tutto ciò che non si è legato specificatamente. Si procede con l’eluizione

Non può essere troppo corto perché sarebbe ineffettivo Solitamente si usa un braccio spaziatore, fatto da 6-8 atomi di carbonio, che può essere idrofobico o idrofilico (gruppi metilenici, carbonilici, immidici) Non può essere troppo lungo perché potrebbe legare aspecificamente proteine Il braccio spaziatore deve possedere un secondo gruppo funzionale per il coupling al ligando Non è necessario per la purificazione di macromolecole, come le Ig  

L’eluizione L’Eluizione del composto di interesse può avvenire in modo specifico o non specifico: L’eluizione aspecifica viene condotta variando il pH o la forza ionica. L’eluizione specifica (per affinità): facendo passare in colonna un composto che ha un’affinità per la molecola di interesse maggiore di quella del ligando.

Gas Cromatografia