Elettroforesi su gel d’agarosio Istituto M. Montessori A.S. 2010/2011 Elettroforesi su gel d’agarosio Esperimento effettuato il 3/2/2011 dalla classe 4°As con la Prof.ssa Lucia Capasso Realizzazione grafica di Andrea D’Eusebi

ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E’ una tecnica fondamentale per: l’analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)

catodo anodo - + RNA e DNA sono carichi negativamente

Effetto “setaccio” in un gel uniforme - +

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO L’agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.

MATERIALI Celle elettroforetiche Coloranti Generatori di corrente- pile alcaline 9v Etidio bromuro Siringhe da 1 ml

PREPARAZIONE GEL D’AGAROSIO Dopo la solidificazione del Si scioglie l’agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100°C Dopo la solidificazione del gel si può rimuovere il Pettine. Alla soluzione d’agarosio si aggiunge Etidio Bromuro

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 45V 0,2A tampone elettroforetico Polo - Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2%

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 45V 0,2A Polo - Polo +

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 45V 0,2A Polo - Polo +

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 45V 0,2A Polo - Polo +

PROCEDIMENTO 1. Prelevare il colorante con la pipetta 2. Inserire il colorante in uno dei pozzetti 4. Cella pronta per elettroforesi 3. Colorazione dei pozzetti

PROCEDIMENTO 6. Inserire le lamine di carbonio nella fessura 5. Prendere delle lamine di carbonio 8. Verificare dopo pochi secondi la presenza delle bollicine vicino l’anodo 7. Attaccare i coccodrilli degli elettrodi sulle lamine di carbonio

Elettroforesi in corso, i colori migrano verso il polo positivo

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI NB Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. NB L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea

TUTTI AL LAVORO!