UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI TRIESTE Dipartimento di Scienze della Riproduzione e dello Sviluppo U.C.O. di Ginecologia ed Ostetricia Direttore: Prof. Secondo Guaschino FATTORI GENETICI COINVOLTI NEL PARTO PRETERMINE , NELLA PREECLAMPSIA E NEL RITARDO DI CRESCITA INTRAUTERINO: ANALISI DEI POLIMORFISMI GENICI CHE CARATTERIZZANO LA RISPOSTA IMMUNITARIA INNATA I disturbi vasomotori rappresentano, classicamente, l’espressione più emblematica della menopausa e spesso diventano responsabili di un drastico peggioramento della qualità di vita della donna. L’associazione delle vampate ad un background ormonale ipoestrogenico e la rapida, pressocchè totale, remissione della sintomatologia con la terapia ormonale sostitutiva hanno contribuito, storicamente, alla genesi del binomio eziopatogenetico estrogeni-vampate. È interessante notare, tuttavia, che non esiste alcuna correlazione tra i livelli di estrogeni e l’intensità della sintomatologia vasomotoria. A fronte di tale evidenza, è legittimo presupporre l’interposizione di altri fattori che rendono tale rapporto causa-effetto non lineare. È ipotizzabile, infatti, che l’ipoestrogenismo possa costituire un fattore indirettamente responsabile di questa sintomatologia, mentre il ruolo della serotonina sull’omeostasi termoregolatoria e l’influenza degli estrogeni sul sistema serotoninergico i meccanismi patogenetici intermedi. Inoltre la grande variabilità di espressione clinica della sintomatologia suggerisce che alcuni fattori individuali incidano sulla severità dei sintomi, rendendo alcune donne più predisposte alle vampate Dottoranda Dott. ssa STEFANIA INGLESE Tutor: Dott.ssa MONICA PICCOLI

IL SISTEMA IMMUNITARIO INNATO: ACQUISITO: LINFOCITI T ATTIVATI LINFOCITI T PEPTIDI via alternativa del COMPLEMENTO FAGOCITI LINFOCITI B ATTIVATI LINFOCITI B

IL SISTEMA IMMUNITARIO E LA GRAVIDANZA prostaglandine In tabella 4 è rappresentata la distribuzione dei diversi polimorfismi nelò campione in esame. Le frequenze dei tre genotipi per il polimorfismo 5-HTTLPR sono risultate: short/short ("s/s"): 9 (28.1%); long/short ("l/s"): 11 (34.4%); long/long ("l/l"): 12 (37.5%). Per quanto concerne, invece, il polimorfismo VNTR-MAO, le percentuali relative ai tre genotipi sono risultate: 3 ripetizioni (3): 4 (12.4%); 3-4 ripetizioni (3/4): 14 (43.8%); 4 ripetizioni (4):14 (43.8%). TAB. 4 PARTO PRETERMINE

IL SISTEMA IMMUNITARIO E LA GRAVIDANZA LA GRAVIDANZA COMPORTA L’INTERAZIONE TRA TESSUTI ANTIGENETICAMENTE DIFFERENTI È NECESSARIA UN’ADEGUATA OMEOSTASI IMMUNOLOGICA PER CONSENTIRE L’IMPIANTO E UN’ADEGUATA PLACENTAZIONE PREECLAMPSIA ABORTO IUGR

IL SISTEMA IMMUNITARIO INNATO E LA GRAVIDANZA ATTIVAZIONE DEI GRANULOCITI MBL (140%) ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO OPSONIZZAIONE L’ evidenza: Il deficit di MBL è associato ad aborto ricorrente

ATTIVAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO INNATO PREECLAMPSIA ABORTO PARTO PRETERMINE IUGR

METODI DISEGNO DELLO STUDIO: STUDIO CASO-CONTROLLO ANNIDATO IN STUDI DI COORTE IN CORSO PRESSO L’ISTITUTO POPOLAZIONE: TUTTE LE DONNE CHE AFFERISCONO AL SERVIZIO DI DIAGNOSI PRENATALE IN OCCASIONE DELL’ECOGRAFIA DEL PRIMO TRIMESTRE E CHE PARTORIANNO PRESSO QUESTO ISTITUTO (3000 pz)

METODI CASI: Parto pretermine spontaneo (<34 settimane) Aborto spontaneo tardivo (12-24 settimane); morte endouterina (>24 settimanane Preeclampsia (PA >140-90 mmHg + proteinuria >300 mg/24h) Ritardo di crescita (peso alla nascita < 10° centile; deflessione ecografica della curva di crescita > 50 centili) Pazienti inviate da ospedali periferici al momento di esordio di patologia ostetrica: preeclampsia, minaccia di parto pretermine, IUGR CASI: (100 pz) (15 pz) (150 pz) (300 pz) CONTROLLI: Soggetti con decorso fisiologico della gravidanza fino al termine

Malformazioni fetali, anomalie cromosomiche METODI CRITERI DI ESCLUSIONE: Malformazioni fetali, anomalie cromosomiche RACCOLTA DATI: 1. Al reclutamento 2. Dopo il parto Tampone buccale neonatale Esame istologico della placenta Consenso informato Prelievo di sangue Tampone vaginale Scheda clinico-anamnestica Sebbene sia ben codificato a livello molecolare e funzionale, il significato di questo polimorfismo rimane ancora piuttosto controverso sul piano clinico: considerato il ruolo svolto dalla serotonina nella regolazione del tono dell’umore e del comportamento, è del tutto legittimo domandarsi se le diverse varianti genotipiche abbiano una qualche influenza nell’ambito della eziopatogenesi dei diversi disturbi psichiatrici. Gli studi condotti in tal senso, hanno fornito risultati piuttosto contrastanti. Diversi studi hanno riportato un’associazione tra l’allele "s" e una personalità ansiosa60; altri sembrano dimostrare una maggiore frequenza del genotipo "ss" nei pazienti con disturbi di tipo despressivo [i] [ii] [iii]. Inoltre è stato riportato, per pazienti con questo genotipo, un maggior rischio di disturbi bipolari a fronte di un moderato rischio di disturbi unipolari[iv]. I risultati di uno studio sull’interazione tra genetica del SERT ed ambiente indicano che gli individui con una o due copie dell’allele "s" manifestano più frequentemente sintomi depressivi, depressione clinicamente diagnosticabile e tendenza al suicidio in relazione ad eventi stressanti [v]. La maggiore prevalenza dell’allele “s” nelle diverse forme della patologia psichiatrica, risulta, in realtà concettualmente difficile da giustificare, se si considera che la più lenta trascrizione del trasportatore associata a tale polimorfismo dovrebbe comportare una maggiore disponibilità di 5HT a livello della sinapsi e, di conseguenza, un potenziamento della trasmissione serotoninergica: la sintomatologia, inaspettatamente in conflitto con un substrato funzionale potenzialmente “positivo” suggerisce che altri meccanismi, ancora non ben definiti e verosimilmente coinvolti nel complesso sistema di regolazione della serotonina, intervengono nella non lineare traduzione del background molecolare nel quadro clinico. Nonostante il ruolo dei polimorfismi sia piuttosto controverso dal punto di vista eziopatogenetico, l’influenza dei diversi genotipi nei confronti della responsività al trattamento con farmaci specificatamente attivi sul SERT risulta essere ben caratterizzata. Dal punto di vista farmacogenetico, infatti, numerosi studi testimoniano che la presenza dell’allele "l" è significativamente associata ad una migliore risposta al trattamento con farmaci inibitori del reuptake della serotonina (SSRI), quali la fluoxetina, paroxetina, fluvoxamina. [i] Belliver F et al. Serotonin transporter gene polymorphism in patients with unipolar or bipolar depression Neurosci Letter 1998:255:143-46 [ii] Ramassubbu R, Tobias R, Buchan AM, Bech-Hansen NT. Serotonin transporter gene transporter gene promoter region polymorphism associated with poststroke major depression J Neuropsychiatry Clin Neurosci 2006;18:96-99 [iii] Ogilivie AD, Battersby S, Bubb VJ, Fink G, Harmar AJ, Goodwin GM, Smith CAD. Polimorphism in serotonin transporter gene associated with susceptibility to major depression. Lancet 1996; 347:731-31 [iv] Pollock BG, Ferrel RE, Mulsant BH, Mazumdar S, Miller S, Sweet RA, Davis S, Kirshner MA, Houch PR, Stack JA, Reynolds CF, Kupfer DJ Allelic variation in serotonin transporter poromoter affects onset of paroxetine treatment response in late-life depression Neuropsycopharmachology 2000;23:587-90 [v] Caspi A, Sugden K, Moffitt TE, Taylor A, Craig IW, Harrington H et al. Influence of life stress on depression: moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene. Science 2003; 18:386-389

METODI ESTRAZIONE DEL DNA: Sistema Custom Golden-Gate Genotyping: reazione di estrazione allele specifica iniziale seguita da una reazione di amplificazione mediante PCR Il sangue materno verrà in parte sottoposto all’estrazione del DNA, in parte conservato come banca di DNA genomico potenzialmente utilizzabile in ricerche future L’enzima chiave nel determinare la concentrazione extracellulare di HT è rappresentato, invece, dal SERT, un canale ionico appartenente alla famiglia dei cotrasportatori Na/Cl dipendenti, responsabile del reuptake della serotonina dallo spazio intersinaptico: tale trasportatore, infatti è localizzato prevalentemente a livello della membrana presinaptica delle terminazioni nervose, oltre che sul corpo cellulare e sui dendriti dei neuroni serotoninergici e rappresenta il bersaglio dei farmaci antidepressivi inibitori del reuptake della serotonina (SSRI). Come già descritto in precedenza, dopo il rilascio nel vallo intersinaptico, la serotonina è captata da un trasportatore (SERT) ad alta affinità localizzato a livello della membrana neuronale presinaptica: Sul piano funzionale, il SERT svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione serotoninergica: riciclando la 5HT nel pool neurotrasmettitoriale interno al neurone presinaptico, infatti, limita l’attività a livello della sinapsi. Tale trasportatore rappresenta il principale sito d’azione di molti farmaci antidepressivi oltre che degli effetti tossici conseguenti all’assunzione di cocaina ed anfetamine.

165 GENI implicati a vari livelli nella risposta immunitaria innata 1536 SNPs

ANALISI DEI DATI Suddivisione in gruppi per l’identificazione degli specifici SNPs eventualmente associati ai singoli esiti in studio (parto pretermine, preeclampsia, IUGR); In ciascun gruppo, esclusione di casi imputabili a cause note di quel determinato esito; 3. In ciascun gruppo, analisi multivariata in base alla presenza di fattori di rischio aggiuntivi, noti per quel determinato esito L’enzima chiave nel determinare la concentrazione extracellulare di HT è rappresentato, invece, dal SERT, un canale ionico appartenente alla famiglia dei cotrasportatori Na/Cl dipendenti, responsabile del reuptake della serotonina dallo spazio intersinaptico: tale trasportatore, infatti è localizzato prevalentemente a livello della membrana presinaptica delle terminazioni nervose, oltre che sul corpo cellulare e sui dendriti dei neuroni serotoninergici e rappresenta il bersaglio dei farmaci antidepressivi inibitori del reuptake della serotonina (SSRI). Come già descritto in precedenza, dopo il rilascio nel vallo intersinaptico, la serotonina è captata da un trasportatore (SERT) ad alta affinità localizzato a livello della membrana neuronale presinaptica: Sul piano funzionale, il SERT svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione serotoninergica: riciclando la 5HT nel pool neurotrasmettitoriale interno al neurone presinaptico, infatti, limita l’attività a livello della sinapsi. Tale trasportatore rappresenta il principale sito d’azione di molti farmaci antidepressivi oltre che degli effetti tossici conseguenti all’assunzione di cocaina ed anfetamine. Costruzione di modelli predittivi di outcome sfavorevole

ANALISI DEI DATI I GRUPPO: PARTO PRETERMINE Parto pretermine iatrogeno (indicazione materna o fetale, placenta previa) ESCLUSIONE FATTORI DI RISCHIO Gemellarità Polidramnios Fumo di sigaretta/sostanze d’abuso Precedente parto pretermine

ANALISI DEI DATI II GRUPPO: ABORTO SPONTANEO TARDIVO-MEU Anomalie cromosomiche Sindromi genetiche ESCLUSIONE FATTORI DI RISCHIO Diabete Preeclampsia Isoimmunizzazione Rh Distacco intempestivo di placenta

ANALISI DEI DATI ± IUGR III GRUPPO: PREECLAMPSIA precoce (< 34 settimane) a termine FATTORI DI RISCHIO Età, parità, familiarità, BMI Ipertensione, diabete, nefropatie pregestazionali LES, APLs gemellarità

ANALISI DEI DATI ± alterazioni flussimetriche placentari IV GRUPPO: IUGR ± alterazioni flussimetriche placentari Anomalie cromosomiche Sindromi genetiche ESCLUSIONE FATTORI DI RISCHIO Diabete pregestazionale Preeclampsia Fumo, alcol, sostanze d’abuso

CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO ANALISI DEI DATI CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO IDENTIFICAZIONE DI SPECIFICI POLIMORFISMI “A RISCHIO” CHE, IN ASSOCIAZIONE A PARAMETRI ANAMNESTICI, FLUSSIMETRICI E BIOCHIMICI, CONSENTA UNO SCREENING COMBINATO (MULTIPLE MARKERS) PREDITTIVO DI OUTCOME SFAVOREVOLE