Corso di formazione all’Esame di Stato Professione Biologo Campi di applicazione della genetica molecolare nella professione del biologo 19 Maggio 2014 Dott. Elena Falcone

Campi di applicazione della genetica molecolare La Genetica Molecolare studia il DNA e i suoi prodotti RNA e proteine, le cui alterazioni o variazioni possono essere correlate o responsabili di un particolare fenotipo oppure essere caratteristiche di uno specifico individuo. La genetica molecolare ha diversi ambiti di applicazione: Ricerca di base (ad es. l’individuazione e lo studio dei geni coinvolti nello sviluppo e nella manifestazione dei caratteri dell’organismo umano) Ricerca applicata (ad es. individuazione di mutazioni a livello di specifici geni responsabili di alcune patologie) Diagnostica di malattie genetiche ereditarie, diagnostica e follow up di malattie oncologiche , di malattie infettive (ad es HIV, HBV, HCV, HPV).

Campi di applicazione genetica molecolare In Genetica forense (test di paternità, test di identificazione biologica in ambito criminalistico) Analisi del DNA estratto da resti umani antichi con varie applicazioni: per studiare la storia evolutiva dell’uomo, per identificare persone, di particolare interesse attraverso la comparazione del profilo genetico con altri membri della famiglia contemporanei o con discendenti. In ambito agroalimentare per identificare alimenti contenenti OGM. Test farmacogenetici. Riguardano le analisi finalizzate alla identificazione di variazioni a livello di specifici geni, in grado di predire la risposta individuale ai farmaci, in termini di efficacia e di rischio relativo di eventi avversi.

I test genetici Una delle principali applicazioni della genetica molecolare riguarda i test genetici Per test genetici si intendono le analisi di specifici geni, del loro prodotto o delle loro funzioni, dell’RNA o dei cromosomi, finalizzate ad evidenziare o ad escludere specifiche mutazioni associate a patologie genetiche. I test possono anche essere utilizzati per definire la variabilità genetica interindividuale con lo scopo di risolvere quesiti legali. Per la complessità tecnologica, l’alta professionalità richiesta e le ricadute sul piano psicologico, sociale ed etico i test genetici sono riconosciuti come prestazioni specialistiche di 3° livello.

I test genetici I test genetici sono classificati, in rapporto alle loro finalità come segue: Test diagnostici. Consentono di effettuare una diagnosi o di confermare, in una persona affetta, un sospetto clinico. Possono essere eseguiti nel periodo prenatale o nel corso della vita. (Ad esempio l’esame della fibrosi cistica in bambini con infezioni polmonari ricorrenti e problemi digestivi, Test X fragili nei maschi con ritardo mentale) Test di identificazione dei portatori sani. Consentono di identificare mutazioni relativamente frequenti in alcuni geni in specifici gruppi etnici (ad es test per le talassemie, test per la fibrosi cistica), attraverso screening di popolazione oppure attraverso indagini sui familiari di persone affette da malattie genetiche.

I test genetici Test presintomici o preclinici. Permettono di individuare il gene responsabile di malattie genetiche, i cui sintomi non sono presenti alla nascita ma possono comparire successivamente, anche in età avanzata. Ad es. il test per la malattia di Huntigton. Tali test possono fornire informazioni utili a pianificare scelte individuali e familiari. La consulenza genetica è particolarmente complessa e necessita di supporto psicologico durante l’iter che precede e segue l’eventuale esecuzione del test. Test di suscettibilità. Consentono di individuare i genotipi che di per se non causano malattia, ma comportano un aumento del rischio di svilupparla in seguito all’esposizione a fattori ambientali favorenti e/o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti. Rientra in questo ambito la maggior parte delle malattie genetiche dell’adulto. Spesso l’identificazione delle persone non affette ma ad alto rischio genetico può giustificare l’eventuale attivazione di misure preventive, variabili in rapporto alla patologia

I test genetici Test per lo studio della variabilità individuale. Si basano sull’analisi di una serie di regioni del DNA polimorfiche (cioè differenti tra gli individui) finalizzate a definire un rapporto di consanguineità o ad attribuire una traccia biologica ad una specifica persona. Test farmacogenetici. Riguardano le analisi finalizzate alla identificazione di variazioni a livello di specifici geni, in grado di predire la risposta individuale ai farmaci, in termini di efficacia e di rischio relativo di eventi avversi.

Peculiarità dei test genetici I test genetici differiscono per molti aspetti da altri test eseguiti nella pratica medica. Possono essere eseguiti anche per predire patologie future; in questo caso ci può essere un periodo di latenza anche molto lungo fra la comunicazione del risultato e la manifestazione della patologia. L’informazione derivante dal test genetico è permanente, in quanto non si modifica nell’arco della vita di un individuo. I test genetici forniscono informazioni non solo sull’individuo che vi si è sottoposto, ma anche sui consanguinei. L’informazione che deriva dal test genetico può avere implicazioni anche per i consanguinei futuri in quanto le malattie genetiche hanno una trasmissione verticale, da una generazione all’altra, influenzando direttamente le scelte riproduttive .

Consulenza genetica In considerazione della complessità dei test genetici essi devono essere offerti nell’ambito di un intervento integrato nel quale la fase diagnostica di laboratorio è preceduta da una preparazione, informazione, prelievo campione, consenso informato (cioè da un colloquio durante il quale l’utente deve comprendere chiaramente il significato, i limiti, e le implicazioni dei test genetici), ed è seguita da una fase che comprende l’elaborazione del risultato, la stesura del referto e la consulenza genetica per spiegare in modo esauriente il risultato e l’eventuale supporto psicologico al paziente ed alla sua famiglia.

Esempio di organizzazione per l’esecuzione e la refertazione di un esame molecolare: il test della Fibrosi Cistica Fase pre-analitica Consulenza genetica Prelievo di sangue ( o di saliva) Fase analitica Estrazione del Dna PCR multiplex di diverse regioni del gene CFTR Reverse dot blot per testare la presenza o assenza delle mutazioni sul gene CFTR Fase post-analitica Refertazione Consulenza se vengono identificate delle mutazioni

Estrazione DNA - Lisi campione: - con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici - 56°C per 10 min. - Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina - in presenza di etanolo e sali caotropici il DNA si lega alla silice - lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice - Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina

Reverse dot blot Test basato sul principio della ibridazione inversa. •Il DNA amplificato, biotinilato, viene denaturato chimicamente ed ibridato con sonde oligonucleotidiche specifiche per le mutazioni e per le corrispondenti sequenze wild-type, immobilizzate come linee parallele sulla membrana delle striscie di reazione. Sulle striscie sono localizzate anche una banda di identificazione (per il corretto orientamento della striscia) ed una di controllo della procedura: si positivizza se è stata effettuata correttamente. •Segue un lavaggio stringente che rimuove l’amplificato legatosi in modo non specifico alla membrana •Viene aggiunta streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina, che si lega ad ogni ibrido biotilinato (amplificato-sonda) formatosi con l’ibridazione •Dopo lavaggi ripetuti, si aggiunge un substrato contenente un cromogeno che per azione della fosfatasi alcalina forma un precipitato di color viola.

RDB MULTIPLO analisi di 36 mutazioni della Fibrosi Cistica (gene CFTR)

La genetica nelle scienze forensi La genetica forense è una delle molteplici discipline delle scienze forensi. L’importanza della genetica nelle scienze forensi si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie ai progressi nella conoscenza dei marcatori genetici polimorfici ed all’evoluzione degli strumenti utilizzati per analizzarli. I mass media hanno notevolmente contribuito all’interesse verso le indagini genetico forense….

La genetica come «strumento» in ambito forense e investigativo A cosa serve? Identificare individui che abbiano commesso dei crimini Risolvere casi di paternità incerta Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Asiatico ecc.) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (sesso, colore occhi, colore capelli) Identificare e «ricostruire» cadaveri la cui identità sia ignota (vittime di catastrofi naturali, disastri aerei, guerre, genocidi) Investigazioni su persone scomparse Identificare tracce di sostanze illegali Identificare DNA appartenente a specie a rischio di estinzione in crimini legati al loro contrabbando ………………….

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: A QUALE LIVELLO? Diversità genetica tra individui Diversità genetica tra popolazioni Diversità genetica tra specie Applicazione in Ambito forense Nella maggior parte delle applicazioni la genetica forense sfrutta la diversità genetica tra individui (variabilità intra-popolazione). In un minor numero di casi sfrutta la variabilità genetica tra specie. In alcuni casi sfrutta «direttamente» la variabilità genetica tra popolazioni, della quale va tenuto comunque sempre conto (effetti della suddivisione della popolazione, ecc.)

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: IN QUALE PORZIONE DEL GENOMA? Autosomi DNA mitocondriale Cromosoma Y Cromosoma X Rilevanza in Ambito forense I marcatori più utilizzati in ambito forense sono localizzati sugli autosomi

La genetica forense si basa sulla presenza di diversità genetica DIVERSITA’ GENETICA: CHE TIPO DI VARIAZIONE? Microsatelliti (short tandem repeats, STRs) Sostituzioni nucleotidiche (~ SNPs) Minisatelliti (~ VNTR) Inserzione/delezione di basi (indels) Presenza/assenza di elementi trasponibili Copy number variants (CNVs) Polimorfismi «citogenetici» Rilevanza in ambito forense I marcatori più utilizzati in ambito forense sono i microsatelliti

Nomenclatura degli STR Se il marcatore è parte di un gene, il nome del gene è usato per la designazione (TH01) Se il marcatore si trova al di fuori di un gene, esso viene designato in base alla posizione cromosomica (D16S539): D: DNA 16: cromosoma 16 S: sito 539: 539mo locus descritto sul cromosoma 16

I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. Pannello di 13 microsatelliti «core» (in giallo) secondo il CODIS, USA CODIS (Combined DNA Index System) Programma dell’FBI in supporto alla giustizia attraverso l’utilizzazione di databases di profili genetici. In UK e alcuni altri stati Europei si utilizza un core di 10 STR, 8 dei quali in comune con il CODIS I 13 microsatelliti furono scelti nel 1997 a partire da 17 loci candidati, in base alla loro variabilità e facilità di interpretazione dei risultati. I 13 loci sono tutti «tetranuceotide repeats», sia semplici che composti. L’analisi dei 13 loci del CODIS porta a profili genetici la cui probabilità di random match media è minore di 1 su un milione di milioni (10-12) .

I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. I kit commerciali sviluppati da Applied Biosystems (a sinistra) e Promega (sotto) permettono di amplificare i 13 STR «core» del CODIS più alcuni altri STR. I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense (>loci, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc.) I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense ( maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR , STR ipervariabili ecc.)

Estrazione DNA - Lisi campione: - con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici - 56°C per 10 min. - Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina - in presenza di etanolo e sali cautropici il DNA si lega alla silice - lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice - Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina

Generare un profilo STR: 2. Amplificazione mediante PCR multiplex Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus. Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione: Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili Devono essere valutate e minimizzate le possibili interazioni tra primers, anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3’) Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli primers è sempre necessaria quando si mette a punto una nuova multiplex, così come una titolazione dei vari componenti della PCR.

MOLECOLE FLUORESCENTI JOE (Green) FAM (Blue) ROX (Red) TAMRA (Yellow)

J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing Printed 4/20/2017 Laser Inlet Buffer Capillary filled with polymer solution 5-20 kV - + Outlet Sample tray Detection window (cathode) (anode) Data Acquisition Sample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Figure 9.2 Schematic of capillary electrophoresis instruments used for DNA analysis. The capillary is a narrow glass tube approximately 50 cm long and 50 microns in diameter. It is filled with a viscous polymer solution that acts much like a gel in creating a sieving environment for DNA molecules. Samples are placed into a tray and injected onto the capillary by applying a voltage to each sample sequentially. A high voltage (e.g., 15,000 volts) is applied across the capillary after the injection in order to separate the DNA fragments in a matter of minutes. Fluorescent dye-labeled products are analyzed as they pass by the detection window and are excited by a laser beam. Computerized data acquisition enables rapid analysis and digital storage of separation results. Contribution of the National Institute of Standards and Technology, 2010

Generare un profilo STR: 3 Generare un profilo STR: 3. tipizzazione mediante elettroforesi capillare: Prodotto PCR fluorescente viene denaturato con formammide e posto nel campionatore Si applica voltaggio elettrico Il prodotto PCR viene elettroiniettato nel capillare Il DNA migra nel polimero contenuto nel capillare; tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento Detector Window Quando il frammento arriva in corrispondenza di una finestra nel capillare, una sorgente laser eccita il fluorocromo legato al prodotto PCR

Generare un profilo STR: 3 Generare un profilo STR: 3. tipizzazionemediante elettroforesi capillare (segue) CCD Panel (with virtual filters) Argon ion LASER (488 nm) Color Separation Fluorescence ABI Prism spectrograph Processing with GeneScan/Genotyper software Sample Interpretation Sample Detection Capillary (filled with polymer solution) Il fluorocromo eccitato dal laser emette luce nel visibile, in un determinato intervallo di lunghezze d’onda (vedi dia succ.) e con una intensità che è proporzionale alla quantità di molecole di fluorocromo eccitate. La luce emessa viene filtrata per determinati range di lunghezza d’onda e convertita in un segnale elettrico che viene misurato in RFUs (Relative Fluorescence Units). I segnali elettrici vengono tradotti nei tipici picchi colorati degli elettroferogrammi.

Normalized Fluorescent Intensity SPETTRO DI EMISSIONE 5-FAM JOE NED ROX ABI 310 100 80 60 Normalized Fluorescent Intensity 40 20 520 540 560 580 600 620 640 Lunghezza d’onda(nm) Laser (488, 514.5 nm)

RAW DATA PROCESSED DATA D3 vWA FGA D8 D21 D18 D5 D13 D7 Am Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore Blue Green Yellow Red RAW DATA Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare e ad un ladder allelico (vedi dia successive) D3 vWA FGA D8 D21 D18 D5 D13 D7 Am PROCESSED DATA

Figure 5.7 (da Butler 2012) Genotyping is performed through a comparison of sized peaks from PCR-amplified samples to allele size bins. These allele bins are defined with the genotyping software using size information from an allelic ladder run with each batch of samples. Any peak falling in a particular dye color and allele bin size range is designated as an allele for that locus. Peaks in both the allelic ladder and the PCR-amplified samples are sized using the same internal size standard so that they may be compared to one another.

Il confronto tra il profilo genetico della traccia e quello del sospettato può dare origine a tre diversi esiti: 1) Compatibilità genetica (match): il profilo genetico della traccia è identico a quello del sospettato. 2) Incompatibilità genetica: il profilo genetico della traccia è diverso rispetto a quello del sospettato, perché verosimilmente il materiale biologico proviene da individui differenti. 3) inconcludenza: non esistono sufficienti informazioni per trarre conclusioni.

La probabilità di match casuale “la regola del prodotto” Nel caso di una compatibilità genetica(match) bisogna dare una valutazione statistica al risultato. Infatti esiste la possibilità che il DNA del campione analizzato appartenga ad un’altra persona diversa rispetto a quella del sospettato e del quale, per pura coincidenza, ha lo stesso profilo genetico. La probalità che un altro individuo non imparentato con il sospettato , preso a caso dalla popolazione, abbia lo stesso genotipo (random match probability, RMP) può essere determinata dalla frequenza di quel particolare genotipo nella popolazione. Tale frequenza viene calcolata sulla base della legge di Hardy-Weinberg ed applicando la regola della probabilità composta. La frequenza genotipica per ogni locus viene calcolata a partire dalle frequenze alleliche p e q, quindi si moltiplicano tra di loro tutte le frequenze genotipiche dei loci esaminati. La random match probability è una stima della frequenza con cui quel particolare profilo ricorre nella popolazione. La RMP può essere considerata, come la probalità che prendendo a caso una persona della popolazione, essa abbia quel determinato profilo genetico. Nel caso di loci omozigoti la frequenza genotipica è data dal quadrato della frequenza allelica, nel caso di loci eterozigoti la frequenza genotipica è 2pq. Utilizzando i 15 marcatori STR presenti nei Kit commerciali si ottengono valori di RMP inferiori a 1 su 10 elevato a 17

Probabilità di match casuale 0.222 Locus D3S1358 x 0.222 x 2 = 0.1

Probabilità di match: la regola del prodotto 1 in 10 1 in 22,200 x 1 in 111 1 in 20 1 in 100 1 in 14 1 in 81 1 in 113,400 x 1 in 116 1 in 17 1 in 16 1 in 31,552 x 1 in 79,531,528,960,000,000

Marcatori “uniparentali” nelle scienze forensi Cromosoma Y si utilizzano principalmente Y-STR La variabilità del cromosoma Y viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di misture maschio-femmina (es. violenza sessuale), per ottenere un profilo STR maschio-specifico non contaminato dal DNA della vittima. Altre applicazioni interessano: test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (il profilo STR del cromosoma Y sarà identico in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza maschile) Misture con un numero elevato di maschi possono essere più facilmente interpretabili se si analizza il cromosoma Y. Maschi deficienti per amelogenina Problemi principali: Essendo un cromosoma non ricombinante ( a parte le PAR) la variabilità si accumula solo per mutazione. Minore informazione e impossibilità di ottenere probabilità di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell’intero aplotipo nella popolazione)

Marcatori “uniparentali” nelle scienze forensi mtDNA si “utilizza” principalmente la sequenza delle regioni ipervariabili (nel mtDNA umano non ci sono microsatelliti!!) La variabilità del mtDNA viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di DNA degradato o scarso , a causa dell’elevato numero di copie di mtDNA per cellula. Al pari del cromosoma Y, il mtDNA viene usato anche nei test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (la sequenza del mtDNA sarà identica in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza femminile). Problemi principali: Come il cromosoma Y, mtDNA è un sistema non ricombinante e quindi la variabilità si accumula solo per mutazione. Ne consegue minore informatività («minore» variabilità) e impossibilità di ottenere probabilità di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell’intero aplotipo nella popolazione per dare un peso alle compatibilità). Il DNA mitocondriale, per il tipo di genotyping cui è sottoposto (sequenziamento) non si presta facilmente nella risoluzione delle misture. La presenza frequente di eteroplasmia rappresenta un problema, soprattutto nel confronto di profili genetici provenienti da DNA estratto da tessuti diversi

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Sebbene gli STR autosomici siano i marcatori d’elezione della genetica forense, in alcuni casi si fa ricorso a marcatori differenti (SNPs) o situati su porzioni del genoma non autosomiche (mtDNA oppure cromosoma Y). Gli SNPs sono utilizzati principalmente quando il DNA da analizzare è fortemente degradato (prodotti PCR più piccoli, quindi maggiore probabilità di successo tecnico). Trovano tuttavia applicazione anche in: Predizione circa la popolazione di origine di un reperto biologico (AIMs, ancestry informartive markers) – Predizione di caratteristiche fenotipiche. Ad esempio il fenotipo «capelli rossi» può essere dedotto (in una certa misura) dall’analisi di polimorfismi nel gene «recettore della melanocortina 1» (MC1R).

Test di paternità Allele obbligato paterno L’allele (i) che il padre DEVE avere In base alle leggi dell’ereditarietà (1° legge Mendel ), considerando un locus autosomico e assumendo che “la madre sia certa”, se si conosce il genotipo di madre e figlio, è possibile dedurre (nella maggior parte dei casi) l’allele di origine paterna. Oppure (nei casi meno fortunati) due alleli di cui uno sia di origine paterna. Questo allele (o alleli) deve essere presente nel padre putativo (allele obbligato)altrimenti c’è incompatibilità per quel locus.

Due possibili risultati Test di paternità Due possibili risultati (1) Compatibilità: Tutti* gli “alleli obbligati paterni” del figlio sono presenti nel padre putativo (2) Esclusione: Più* “alleli obbligati paterni” del figlio non sono presenti nel genotipo del padre putativo

Test di paternità Vengono analizzati i loci STR (generalmentie 15 STR autosomici + il locus dell’amelogenina) In caso di compatibilità, per tutti i loci analizzati è necessario stimare il peso dell’evidenza a favore dell’ipotesi di paternità. Si calcola quindi l’indice di paternità. P.I. = Indice di paternità (per un locus) C.P.I = Indice di paternità combinato (considerando più loci).

Indice di paternità Test di paternità PI=X/Y L’indice di paternità(PI) o rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio, LR) si calcola attraverso il rapporto di due probabilità: Numeratore: probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele obbligato essendo il vero padre (X). Tale probabilità viene calcolata sulla base delle leggi di Mendel e corrisponde alla probabilità che il presunto padre in esame sia il padre biologico del figlio analizzato (H1); Denominatore: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l’allele obbligato essendo il vero padre (Y). Tale probabilità viene calcolata sulla base della frequenza di quell’allele nella popolazione e corrisponde alla probabilità che il padre presunto non sia il padre biologico, e che quindi detta compatibilità sia solo casuale (H0). PI=X/Y

Test di paternità Indice di paternità: Esempio (semplice): Madre AB, Figlio AC, Padre AC Individuare l’allele/i paterno obbligato/i (allele C in questo esempio) Numeratore: Probabilità che il padre trasmetta l’allele obbligato = ½ (Mendel!!) Denominatore: Probabilità che un individuo a caso della popolazione trasmetta l’allele obbligato = Frequenza dell’allele nella popolazione (Hardy-Weinberg!!)  necessità di utilizzare database di frequenze alleliche. Se l’allele C ha frequenza nella popolazione (ad esempio) pC = 0,1, allora (in questo esempio): P.I. = 0,5/0,1 = 5

Indice di paternità Ad esempio X è uguale ad 1 se il padre è omozigote per l’allele obbligato ed è ½ se è eterozigote; a questo valore vanno apportate delle correzioni anche in funzione del genotipo materno. Esistono delle tabelle (Brenner , DNA view) nelle quali vengono riassunte le varie possibilità di genotipi del trio e le corrispondenti formule per calcolare il PI. Le frequenze alleliche sono consultabili on line sul sito STR database. L’indice di paternità viene calcolato per ogni locus (STR) analizato. I valori trovati vengono poi moltiplicati tra di loro (poiché sono indipendenti) e si ottiene l’Indice di Paternità Combinato (CPI) CPI = Indice di paternità combinato o LR (likelihood ratio,) Si ottiene come prodotto dei singoli P.I. CPI = 100 significa: « E’ 100 volte più probabile ottenere i risultati osservati (i profili genetici dei tre soggetti del trio) se il padre putativo (piuttosto che un uomo preso a caso dalla popolazione) è il vero padre Con i loci microsatelliti attualmente in uso in genetica forense, in caso di compatibilità si ottengono valori di CPI superiore a 10 elevato 9.

Interpretazione dei risultati I risultati della tipizzazione di marcatori polimorfici sono riassumibili in tre scenari: 1. esclusione 2. attribuzione 3. inconclusività

1. Esclusione Il Gruppo di Lavoro, per addivenire all’esclusione di compatibilità biologica, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza (LR) inferiore a 1:10.000 (Brenner C, 2004).

2. Attribuzione Il Gruppo di Lavoro, per definire l’attribuzione, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza (LR) superiore a 10.000:1.

3. Inconclusività Conseguentemente si definisce inconclusivo qualsiasi risultato che generi un rapporto di verosimiglianza (LR) compreso tra 1:10.000 e 10.000:1.

Test di paternità in presenza di mutazioni In caso di esclusione si osserva generalmente non compatibilità per più loci. Ma come considerare una situazione in cui solo uno (o “pochi”) dei loci analizzati non sono compatibili? Bisogna tener conto delle possibili mutazioni Tasso di mutazione? Come si tiene conto delle mutazioni