Corso di preparazione per gli Esami di Stato per Biologi Campi di applicazione della Biologia Molecolare UNICAL 18 Maggio 2015 Dr.ssa. Elena Falcone

Campi di applicazione della genetica molecolare La Genetica Molecolare studia il DNA e i suoi prodotti RNA e proteine, le cui alterazioni o variazioni possono essere correlate o responsabili di un particolare fenotipo oppure essere caratteristiche di uno specifico individuo. La genetica molecolare ha diversi ambiti di applicazione: Ricerca di base (ad es. l’individuazione e lo studio dei geni coinvolti nello sviluppo e nella manifestazione dei caratteri dell’organismo umano) Ricerca applicata (ad es. individuazione di mutazioni a livello di specifici geni responsabili di alcune patologie) Diagnostica di malattie genetiche ereditarie, diagnostica e follow up di malattie oncologiche , di malattie infettive (ad es HIV, HBV, HCV, HPV).

Campi di applicazione genetica molecolare In Genetica forense (test di paternità, test di identificazione biologica in ambito criminalistico) Analisi del DNA estratto da resti umani antichi con varie applicazioni: per studiare la storia evolutiva dell’uomo, per identificare persone, di particolare interesse attraverso la comparazione del profilo genetico con altri membri della famiglia contemporanei o con discendenti. In ambito agroalimentare per identificare alimenti contenenti OGM. Test farmacogenetici. Riguardano le analisi finalizzate alla identificazione di variazioni a livello di specifici geni, in grado di predire la risposta individuale ai farmaci, in termini di efficacia e di rischio relativo di eventi avversi.

I test genetici Una delle principali applicazioni della genetica molecolare riguarda i test genetici Per test genetici si intendono le analisi di specifici geni, del loro prodotto o delle loro funzioni, dell’RNA o dei cromosomi, finalizzate ad evidenziare o ad escludere specifiche mutazioni associate a patologie genetiche. I test possono anche essere utilizzati per definire la variabilità genetica interindividuale con lo scopo di risolvere quesiti legali. Per la complessità tecnologica, l’alta professionalità richiesta e le ricadute sul piano psicologico, sociale ed etico i test genetici sono riconosciuti come prestazioni specialistiche di 3° livello.

I test genetici I test genetici sono classificati, in rapporto alle loro finalità come segue: Test diagnostici. Consentono di effettuare una diagnosi o di confermare, in una persona affetta, un sospetto clinico. Possono essere eseguiti nel periodo prenatale o nel corso della vita. (Ad esempio l’esame della fibrosi cistica in bambini con infezioni polmonari ricorrenti e problemi digestivi, Test X fragili nei maschi con ritardo mentale) Test di identificazione dei portatori sani. Consentono di identificare mutazioni relativamente frequenti in alcuni geni in specifici gruppi etnici (ad es test per le talassemie, test per la fibrosi cistica), attraverso screening di popolazione oppure attraverso indagini sui familiari di persone affette da malattie genetiche.

I test genetici Test presintomici o preclinici. Permettono di individuare il gene responsabile di malattie genetiche, i cui sintomi non sono presenti alla nascita ma possono comparire successivamente, anche in età avanzata. Ad es. il test per la malattia di Huntington. Tali test possono fornire informazioni utili a pianificare scelte individuali e familiari. La consulenza genetica è particolarmente complessa e necessita di supporto psicologico durante l’iter che precede e segue l’eventuale esecuzione del test. Test di suscettibilità. Consentono di individuare i genotipi che di per se non causano malattia, ma comportano un aumento del rischio di svilupparla in seguito all’esposizione a fattori ambientali favorenti e/o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti. Rientra in questo ambito la maggior parte delle malattie genetiche dell’adulto. Spesso l’identificazione delle persone non affette ma ad alto rischio genetico può giustificare l’eventuale attivazione di misure preventive, variabili in rapporto alla patologia

I test genetici Test per lo studio della variabilità individuale. Si basano sull’analisi di una serie di regioni del DNA polimorfiche (cioè differenti tra gli individui) finalizzate a definire un rapporto di consanguineità o ad attribuire una traccia biologica ad una specifica persona. Test farmacogenetici. Riguardano le analisi finalizzate alla identificazione di variazioni a livello di specifici geni, in grado di predire la risposta individuale ai farmaci, in termini di efficacia e di rischio relativo di eventi avversi.

Peculiarità dei test genetici I test genetici differiscono per molti aspetti da altri test eseguiti nella pratica medica. Possono essere eseguiti anche per predire patologie future; in questo caso ci può essere un periodo di latenza anche molto lungo fra la comunicazione del risultato e la manifestazione della patologia. L’informazione derivante dal test genetico è permanente, in quanto non si modifica nell’arco della vita di un individuo. I test genetici forniscono informazioni non solo sull’individuo che vi si è sottoposto, ma anche sui consanguinei. L’informazione che deriva dal test genetico può avere implicazioni anche per i consanguinei futuri in quanto le malattie genetiche hanno una trasmissione verticale, da una generazione all’altra, influenzando direttamente le scelte riproduttive .

Consulenza genetica In considerazione della complessità dei test genetici essi devono essere offerti nell’ambito di un intervento integrato nel quale la fase diagnostica di laboratorio è preceduta da una preparazione, informazione, prelievo campione, consenso informato (cioè da un colloquio durante il quale l’utente deve comprendere chiaramente il significato, i limiti, e le implicazioni dei test genetici), ed è seguita da una fase che comprende l’elaborazione del risultato, la stesura del referto e la consulenza genetica per spiegare in modo esauriente il risultato e l’eventuale supporto psicologico al paziente ed alla sua famiglia.

Esempio di organizzazione per l’esecuzione e la refertazione di un esame molecolare: il test della Fibrosi Cistica Fase pre-analitica Consulenza genetica Prelievo di campione biologico (sangue o saliva) Fase analitica Estrazione del Dna PCR multiplex di diverse regioni del gene CFTR Reverse dot blot per testare la presenza o assenza delle mutazioni sul gene CFTR Fase post-analitica Refertazione Consulenza se vengono identificate delle mutazioni

Estrazione DNA - Lisi campione: - con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali coatropici - 56°C per 10 min. - Adsorbimento DNA al gel di silice contenuto in una colonnina - in presenza di etanolo e sali caotropici il DNA si lega alla silice - lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice - Eluizione DNA: con H2O o soluzioni a bassa concentrazione salina

Reverse dot blot Il DNA amplificato, biotinilato, viene denaturato chimicamente ed ibridato con sonde oligonucleotidiche specifiche per le mutazioni e per le corrispondenti sequenze wild-type, immobilizzate come linee parallele sulla membrana delle striscie di reazione. Segue un lavaggio stringente che rimuove l’amplificato legatosi in modo non specifico alla membrana Viene aggiunta streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina, che si lega ad ogni ibrido biotilinato (amplificato-sonda) formatosi con l’ibridazione Dopo lavaggi ripetuti, si aggiunge un substrato contenente un cromogeno che per azione della fosfatasi alcalina forma un precipitato di color viola.

RDB MULTIPLO analisi di 36 mutazioni della Fibrosi Cistica (gene CFTR)

Controlli di Qualità Interni e Verifica Esterna di Qualità Il CQI e la VEQ hanno finalità diverse e tempestività differenti nell'evidenziare possibili problemi analitici. I termini “controllo” e “valutazione” hanno un significato ben diverso. Il CQI implica sorveglianza puntuale per valutare la correttezza del risultato e qualità rispetto allo standard del proprio laboratorio, e possibilità di ripetere l’esame prima di rilasciare i risultati all'esterno. La VEQ è un processo più complesso. La correttezza del risultato e la qualità tecnica dell’esame viene valutata da una commissione esterna che valuta anche la fase post-analitica (qualità del referto), Essa inoltre consente di confrontare i propri risultati con quelli di altri laboratori.

Sono stati assegnati 5 punti per la genotipizzazione, 5 punti per l’interpretazione e 4 punti per il referto prendendo in considerazione la struttura e le voci riportate nei criteri sopracitati. La “performance” di un laboratorio è stata ritenuta insufficiente quando si è verificata una delle seguenti situazioni anche in un solo campione. Errore di Genotipizzazione: 1. Genotipo errato (comprende: mancata o errata identificazione della mutazione patogenetica, scambio di campioni, errore di trascrizione tra dato grezzo e referto) 2. Mancato raggiungimento dell’efficienza diagnostica richiesta per lo schema (75%) 3. Dati grezzi non interpretabili o assenza di dati grezzi relativi ad analisi dichiarate nel referto e utili al raggiungimento della diagnosi Errori di interpretazione: 4. Interpretazione errata del dato grezzo corretto 5. Assenza di interpretazione rispetto all’indicazione clinica al test genetico richiesto (è necessario riportare stato di portatore o affetto)

La genetica nelle scienze forensi La genetica forense è una delle molteplici discipline delle scienze forensi. L’importanza della genetica nelle scienze forensi si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie ai progressi nella conoscenza dei marcatori genetici polimorfici ed all’evoluzione degli strumenti utilizzati per analizzarli. I mass media hanno notevolmente contribuito all’interesse verso le indagini genetico forense….

Le variazioni esistenti tra il DNA di individui differenti riguardano solo circa lo 0,9% del DNA totale. Queste regioni del DNA, presenti nella popolazione in tante forme alternative, sono quelle che vengono analizzate per l’elaborazione del profilo genetico e vengono chiamate marcatori genetici o polimorfismi genetici.

Ogni individuo, relativamente ad 1 solo STR può avere al massimo 2 varianti diverse una ereditata per via materna l’altra per via paterna. Analizzando più STR si ottiene una combinazione di varianti che costituisce il profilo genetico, una sorta di codice a barre costituito da una combinazione di 1 o 2 numeri per ogni marcatore genetico.

Generare un profilo STR: 2. Amplificazione mediante PCR multiplex Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus. Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione: Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili Devono essere valutate e minimizzate le possibili interazioni tra primers, anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3’) Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli primers è sempre necessaria quando si mette a punto una nuova multiplex, così come una titolazione dei vari componenti della PCR.

J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing Printed 4/20/2017 Laser Inlet Buffer Capillary filled with polymer solution 5-20 kV - + Outlet Sample tray Detection window (cathode) (anode) Data Acquisition Sample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Figure 9.2 Schematic of capillary electrophoresis instruments used for DNA analysis. The capillary is a narrow glass tube approximately 50 cm long and 50 microns in diameter. It is filled with a viscous polymer solution that acts much like a gel in creating a sieving environment for DNA molecules. Samples are placed into a tray and injected onto the capillary by applying a voltage to each sample sequentially. A high voltage (e.g., 15,000 volts) is applied across the capillary after the injection in order to separate the DNA fragments in a matter of minutes. Fluorescent dye-labeled products are analyzed as they pass by the detection window and are excited by a laser beam. Computerized data acquisition enables rapid analysis and digital storage of separation results. Contribution of the National Institute of Standards and Technology, 2010

Generare un profilo STR: 3 Generare un profilo STR: 3. tipizzazione mediante elettroforesi capillare: Prodotto PCR fluorescente viene denaturato con formammide e posto nel campionatore Si applica voltaggio elettrico Il prodotto PCR viene elettroiniettato nel capillare Il DNA migra nel polimero contenuto nel capillare; tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento Detector Window Quando il frammento arriva in corrispondenza di una finestra nel capillare, una sorgente laser eccita il fluorocromo legato al prodotto PCR

Generare un profilo STR: 3 Generare un profilo STR: 3. tipizzazionemediante elettroforesi capillare (segue) CCD Panel (with virtual filters) Argon ion LASER (488 nm) Color Separation Fluorescence ABI Prism spectrograph Processing with GeneScan/Genotyper software Sample Interpretation Sample Detection Capillary (filled with polymer solution) Il fluorocromo eccitato dal laser emette luce nel visibile, in un determinato intervallo di lunghezze d’onda (vedi dia succ.) e con una intensità che è proporzionale alla quantità di molecole di fluorocromo eccitate. La luce emessa viene filtrata per determinati range di lunghezza d’onda e convertita in un segnale elettrico che viene misurato in RFUs (Relative Fluorescence Units). I segnali elettrici vengono tradotti nei tipici picchi colorati degli elettroferogrammi.

Figure 5.7 (da Butler 2012) Genotyping is performed through a comparison of sized peaks from PCR-amplified samples to allele size bins. These allele bins are defined with the genotyping software using size information from an allelic ladder run with each batch of samples. Any peak falling in a particular dye color and allele bin size range is designated as an allele for that locus. Peaks in both the allelic ladder and the PCR-amplified samples are sized using the same internal size standard so that they may be compared to one another.

Il confronto tra il profilo genetico della traccia e quello del sospettato può dare origine a tre diversi esiti: 1) Compatibilità genetica (match): il profilo genetico della traccia è identico a quello del sospettato. 2) Incompatibilità genetica: il profilo genetico della traccia è diverso rispetto a quello del sospettato, perché verosimilmente il materiale biologico proviene da individui differenti. 3) inconcludenza: non esistono sufficienti informazioni per trarre conclusioni.

La probabilità di match casuale “la regola del prodotto” Nel caso di una compatibilità genetica(match) bisogna dare una valutazione statistica al risultato. Infatti esiste la possibilità che il DNA del campione analizzato appartenga ad un’altra persona diversa rispetto a quella del sospettato e del quale, per pura coincidenza, ha lo stesso profilo genetico. La probalità che un altro individuo non imparentato con il sospettato , preso a caso dalla popolazione, abbia lo stesso genotipo (random match probability, RMP) può essere determinata dalla frequenza di quel particolare genotipo nella popolazione. Tale frequenza viene calcolata sulla base della legge di Hardy-Weinberg ed applicando la regola della probabilità composta. La frequenza genotipica per ogni locus viene calcolata a partire dalle frequenze alleliche p e q, quindi si moltiplicano tra di loro tutte le frequenze genotipiche dei loci esaminati. La random match probability è una stima della frequenza con cui quel particolare profilo ricorre nella popolazione. La RMP può essere considerata, come la probalità che prendendo a caso una persona della popolazione, essa abbia quel determinato profilo genetico. Nel caso di loci omozigoti la frequenza genotipica è data dal quadrato della frequenza allelica, nel caso di loci eterozigoti la frequenza genotipica è 2pq. Utilizzando i 15 marcatori STR presenti nei Kit commerciali si ottengono valori di RMP inferiori a 1 su 10 elevato a 17

Probabilità di match casuale 0.222 Locus D3S1358 x 0.222 x 2 = 0.1

Probabilità di match: la regola del prodotto 1 in 10 1 in 22,200 x 1 in 111 1 in 20 1 in 100 1 in 14 1 in 81 1 in 113,400 x 1 in 116 1 in 17 1 in 16 1 in 31,552 x 1 in 79,531,528,960,000,000

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Le analisi del DNA per l’identificazione individuale, sono essenzialmente basate sul confronto del profilo genetico ottenuto da un campione biologico raccolto sulla scena del crimine ed il profilo di un sospettato, oppure dalla ricerca in banche dati (per i paesi che ne dispongono) o da screening di massa. In caso di compatibilità genetica, bisogna dare una valutazione statistica al risultato. In particolare si deve valutare quanto quel profilo genetico sia identificativo di quell’individuo. Ciò dipende dal numero di marcatori genetici analizzati e dalla frequenza di quel profilo nella popolazione. Ad esempio se da una traccia biologica si ottiene un profilo con solo 5 marcatori genetici la frequenza di quel profilo nella popolazione è di circa 1 su 10 elevato a 6 (1 su 1.000.000). Questo profilo è poco informativo perché in una città come Roma, che ha 2.700.000 abitanti, ci si aspetta di trovare almeno 2 persone con questo profilo. Se invece si ottiene un profilo con 10 marcatori genetici, la frequenza di quel profilo nella popolazione è di circa 1 su 10 elevato a 11 ( 1 su 100.000.000.000 cioè 1 su 100 miliardi). Considerando che la popolazione mondiale è di circa 7 miliardi, si può concludere che tale profilo è identificativo ed unico di quell’individuo.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Gli attuali sistemi di analisi, più utilizzati in genetica forense prevedono un minimo di 16 fino ai 22 marcatori STR più almeno 1 marcatore genetico (amelogenina) che da informazioni sul sesso dell’individuo. Pertanto per determinare l’identità genetica di un individuo non è necessario analizzare tutto il suo DNA (cosa che sarebbe difficoltosa da un punto di vista tecnico, costosa, ed inutile perché il 99,1% del DNA è identico tra i diversi individui), ma è sufficiente analizzare un numero limitato di regioni del DNA che sono variabili nell’ambito della popolazione, per ottenere un profilo genetico identificativo di quell’individuo.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Sebbene gli STR autosomici siano i marcatori d’elezione della genetica forense, in alcuni casi si fa ricorso a marcatori differenti (SNPs). Tali marcatori, aumentano la capacità di ottenere informazione su campioni in cattivo stato di conservazione, o caratterizzati da un contenuto minimo di DNA, inoltre alcuni di questi possono essere usati per fornir informazioni su caratteristiche antropometriche e sull’origine ancestrale. Con i marcatori classici, usati in genetica forense l’unica informazione sul fenotipo riguarda il sesso.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Uno degli orizzonti più affascinanti, ma anche dai contorni meno definiti della genetica forense riguarda la possibilità di ottenere informazioni sulle caratteristiche fisiognomiche di un individuo attraverso l’analisi del DNA. Ad esempio il colore della pelle, dei capelli, degli occhi, l’altezza. Sono stati identificate varianti nei geni che controllano la colorazione dei capelli, la pigmentazione della cute, il colore degli occhi, l’altezza. Tuttavia la loro applicazione pratica è complessa in quanto ogni caratteristica umana è determinata da tantissime varianti genetiche e dalla loro interazione con fattori ambientali. Questo complicato intreccio di interazioni è ancora sconosciuto e soprattutto di difficile comprensione e predizione. Recentemente sono stati sviluppati dei pannelli genetici in grado di predire (fornendo una stima statistica e non una certezza) il colore degli occhi dal blu al marrone, il colore dei capelli, e l’altezza.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Inoltre sono stati sviluppati dei pannelli che consentono di stimare, la probabile origine etnica di un campione (Africa, Europa, Asia e America). Dal momento che le popolazioni si mescolano, anche tale approccio può solo fornire solo una stima statistica e non può costituire carattere di certezza ma tuttavia può essere utile per orientare le indagini verso una certa linea investigativa.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi In Louisiana, si è riusciti ad individuare l’autore di 5 delitti, effettuando il test per predire l’origine ancestrale dei campioni trovati sulla scena del crimine, laddove le indagini investigative tradizionali non avevano dato risultati. Il test rivelò che le tracce biologiche appartenevano ad un soggetto che per l’85% era di origine Afro-Americana e per il restante 15% era originario degli Indiani D’ America. Dopo solo 2 mesi di indagine fu individuato un uomo con la pelle scura, di origine Afro-Americana, con numerosi precedenti penali. Le analisi con 13 marcatori STR , confermarono che il suo profilo genetico coincideva con quello presente sulla scena del crimine ed il caso fu risolto.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Studi recenti, ancora in fase di validazione, hanno evidenziato la possibilità di poter stimare (con un certo grado di approssimazione) l’età biologica di un individuo studiando i meccanismi che regolano la funzionalità del DNA (epigenetica), che cambiano con l’età di un individuo. Si spera che nei prossimi anni ciò possa consentire di stimare l’età biologica dell’ individuo che ha lasciato una traccia biologica.

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi La possibilità di arrivare all’identificazione di una persona attraverso un campione biologico ha avuto un forte impatto in ambito giudiziario per la possibilità di ricostruire dinamiche delittuose, di individuare colpevoli, scagionare innocenti. Oggi grazie ad una tecnologia che consente di creare in vitro milioni di copie del tratto genetico di interesse (PCR), basta una microscopica traccia di sangue, o la saliva su un mozzicone di sigarette, o le cellule che inconsapevolmente vengono lasciate su un oggetto quando è impugnato, per poter stabilire il profilo genetico della persona che è passata di lì, che ha lasciato il segno del suo passaggio. Nella pratica, tuttavia le indagini genetiche,in ambito penale hanno dei limiti oggettivi. Le principali criticità dell’esame del DNA sono: 1)l’eccessiva esiguità del DNA presente nella traccia che può non consentire la ripetizione dell’esame, oppure che può dare risultati non ripetibili. L’accettazione o meno di tali risultati, la loro interpretazione, la loro valutazione statistica può risultare complessa ed oggetto di discussione dei periti delle differenti parti 2)Il mancato rispetto delle procedure nel lungo percorso che va dalla raccolta del campione (la fase più critica perché poco standardizzabile), alla sua analisi che può portare alla contaminazione del campione o sollevare dubbi sulla possibile contaminazione

Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Pertanto accanto alle notevoli potenzialità, l’esame del DNA in ambito penale, resta una materia estremamente complessa, sia in fase analitica, per le eccezionalità che lo studio del DNA comporta, sia nella fase sussidiaria alle analisi, spesso fondamentale per una completa accettazione della prova del DNA in fase dibattimentale. La direzione del futuro per “la prova del DNA” è verso sistemi di determinazione del profilo che da una parte sono dotati di sempre maggiore sensibilità e quindi in grado di ottenere risultati affidabili da quantità di materiale biologico sempre più ridotte, e dall’altra siano in grado di predire anche le caratteristiche fisiche di un individuo, l’origine geografica, l’età biologica nella speranza di poter fornire un identikit virtuale della persona che ha lasciato una traccia biologica. Un obiettivo, tutto italiano per implementare le potenzialità insite nell’esame del DNA è la realizzazione della Banca Dati del DNA. L’Italia è rimasto uno dei pochi paesi al mondo a non esserne dotata. La sua realizzazione, consentirebbe infatti una maggiore efficienza e rapidità delle indagini.

Due possibili risultati Test di paternità Due possibili risultati (1) Compatibilità: Tutti* gli “alleli obbligati paterni” del figlio sono presenti nel padre putativo (2) Esclusione: Più* “alleli obbligati paterni” del figlio non sono presenti nel genotipo del padre putativo

Test di paternità Vengono analizzati i loci STR (generalmentie 15 STR autosomici + il locus dell’amelogenina) In caso di compatibilità, per tutti i loci analizzati è necessario stimare il peso dell’evidenza a favore dell’ipotesi di paternità. Si calcola quindi l’indice di paternità. P.I. = Indice di paternità (per un locus) C.P.I = Indice di paternità combinato (considerando più loci).

Indice di paternità Test di paternità PI=X/Y L’indice di paternità(PI) o rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio, LR) si calcola attraverso il rapporto di due probabilità: Numeratore: probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele obbligato essendo il vero padre (X). Tale probabilità viene calcolata sulla base delle leggi di Mendel e corrisponde alla probabilità che il presunto padre in esame sia il padre biologico del figlio analizzato (H1); Denominatore: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l’allele obbligato essendo il vero padre (Y). Tale probabilità viene calcolata sulla base della frequenza di quell’allele nella popolazione e corrisponde alla probabilità che il padre presunto non sia il padre biologico, e che quindi detta compatibilità sia solo casuale (H0). PI=X/Y

Test di paternità Indice di paternità: Esempio (semplice): Madre AB, Figlio AC, Padre AC Individuare l’allele/i paterno obbligato/i (allele C in questo esempio) Numeratore: Probabilità che il padre trasmetta l’allele obbligato = ½ (Mendel!!) Denominatore: Probabilità che un individuo a caso della popolazione trasmetta l’allele obbligato = Frequenza dell’allele nella popolazione (Hardy-Weinberg!!)  necessità di utilizzare database di frequenze alleliche. Se l’allele C ha frequenza nella popolazione (ad esempio) pC = 0,1, allora (in questo esempio): P.I. = 0,5/0,1 = 5

Indice di paternità Ad esempio X è uguale ad 1 se il padre è omozigote per l’allele obbligato ed è ½ se è eterozigote; a questo valore vanno apportate delle correzioni anche in funzione del genotipo materno. Esistono delle tabelle (Brenner , DNA view) nelle quali vengono riassunte le varie possibilità di genotipi del trio e le corrispondenti formule per calcolare il PI. Le frequenze alleliche sono consultabili on line sul sito STR database. L’indice di paternità viene calcolato per ogni locus (STR) analizato. I valori trovati vengono poi moltiplicati tra di loro (poiché sono indipendenti) e si ottiene l’Indice di Paternità Combinato (CPI) CPI = Indice di paternità combinato o LR (likelihood ratio,) Si ottiene come prodotto dei singoli P.I. CPI = 100 significa: « E’ 100 volte più probabile ottenere i risultati osservati (i profili genetici dei tre soggetti del trio) se il padre putativo (piuttosto che un uomo preso a caso dalla popolazione) è il vero padre Con i loci microsatelliti attualmente in uso in genetica forense, in caso di compatibilità si ottengono valori di CPI superiore a 10 elevato 9.

Interpretazione dei risultati I risultati della tipizzazione di marcatori polimorfici sono riassumibili in tre scenari: 1. esclusione 2. attribuzione 3. inconclusività

1. Esclusione Il Gruppo di Lavoro, per addivenire all’esclusione di compatibilità biologica, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza (LR) inferiore a 1:10.000 (Brenner C, 2004).

2. Attribuzione Il Gruppo di Lavoro, per definire l’attribuzione, suggerisce un valore di rapporto di verosimiglianza (LR) superiore a 10.000:1.

3. Inconclusività Conseguentemente si definisce inconclusivo qualsiasi risultato che generi un rapporto di verosimiglianza (LR) compreso tra 1:10.000 e 10.000:1.