Indagini ambientali e campionamenti d.ssa Maria Antonietta Bucci Sabattini d.ssa Francesca Giacobbi Seminario Legionellosi: Situazioni attuali e prospettive Bologna, 27 novembre 2003 © 2003 – ARPA - Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente – Regione Emilia Romagna – Sezione Provinciale di Bologna

Sommario Habitat naturale Habitat antropico Sistematica e caratteristiche colturali Indagine ambientale Campionamento Elaborazione statistica di alcuni dati relativi a controlli eseguiti negli anni 1999-2003.

1° Riferimento storico Pneumopatia acuta febbrile (16% letalità) che si verificò nel luglio 1976 al Bellevue Hotel di Philadelphia in occasione del raduno annuale dell'American Legion. Il C.D.C. identificò l'agente responsabile malattia e nel I° Simposio Internazionale del 1978 la chiamò Legionella pneumophila. Dall'esame di campioni di sieri e tessuti conservati dal CDC dal 1947 al 1957, in occasione di epidemie di origine sconosciuta, fu possibile risalire ai primi casi di legionellosi: - nel 1947, il caso più vecchio, un soldato deceduto a Fort Braff nel Nord della Carolina per polmonite non identificata, - nel 1957 tre casi in un impianto di confezionamento carne. Indagini epidemiologiche retrospettive permisero di chiarire altri episodi rimasti senza risposta: - nel 1965 casi in Ospedale Psichiatrico di Washington, - nel 1968 casi in uffici Sanità Pubblica di Pontiac, - nel 1973 casi in turisti in Spagna, - nel 1974 casi nello stesso albergo di Philadelphia.

Habitat È stato dimostrato che Legionella pneumophila è un batterio che ha il suo “reservoir” nell'ambiente naturale acquatico ed è capace di sopravvivere in un ampio range di condizioni. (Flaiermans, 1981).

Habitat naturale Flaiermans (Appl. En. Microbiol.) nel 1981 provò l'origine (habitat) ambientale di Legionella e per arrivare a dimostrare questo furono prelevati quasi 800 campioni di acqua da 67 diversi laghi e fiumi degli USA. Ogni campione era costituito da 20 litri di acqua, che fu concentrato 500 volte (concentrato fino a 49 ml), la concentrazione fu eseguita sul campo con centrifugazione continua 15.000 giri in ragione di 200 ml al minuto). Tutti i campioni, senza eccezioni, risultarono positivi al test in fluorescenza diretta al microscopio per Legionella pneumophila e confermati in cavia.

Habitat naturale Gli isolamenti derivavano da acque con grande variabilità di parametri chimici, fisici, biologici (anche sorgenti termali) con un maggior reperimento quantitativo del batterio nei mesi estivi. Le Legionelle trovate oscillavano in un ampio range da: 9,0×103 UFC/l fino a 3,3×107 UFC/l. I parametri fisici: - temperatura da 5,7 °C a 53 °C (con valori medi tra 20°- 30°C), - pH tra 5,5 e 8,1.

Habitat naturale Almeno 30 specie diverse di amebe e 2 di protozoi ciliati (Entamoeba hystolitica, Hartmannella vermiformis, Echinamebae spp., Saccameba spp., Acanthamaeba, Naegleria, Vanella, ecc.) consentono la moltiplicazione di Legionella pneumophila e sono ospiti ambientali di Legionella. Si parla non solo di ambienti naturali, ma anche di "ambiente idrico condottato", come è stato dimostrato in numerosi lavori (1998, App. En. Microbiol., Ute Rohr) in cui le amebe sono state isolate da campioni di acqua calda in 6 diversi ospedali USA. Gli autori ipotizzano anche una relazione tra Legionella pneumophila e organismi eucarioti (alghe e protozoi). Più o meno nello stesso periodo Rawbozan (J. Clinical Pathology) descrisse la capacità di Legionella pneumophila di moltiplicarsi dentro i protozoi, da allora è stato dimostrato che Legionella pneumophila si può moltiplicare in diverse specie di protozoi.

Sistematica La classificazione nel 1996. La famiglia Legionellaceae è formata dall’unico genere Legionella.

Sistematica Attualmente si conoscono 48 specie di Legionella, comprendenti 70 distinti sierogruppi. Della specie L. pneumophila sono stati isolati 15 sierogruppi diversi. Circa la metà delle 48 specie isolate sono associate a casi di legionellosi nell’uomo. Il 79% dei casi, confermati dall’ esame colturale o dall’antigene urinario, sono stati causati da Legionella pneumophila, sierogruppo 1.

Caratteristiche colturali Le legionelle hanno le seguenti carartteristiche: batteri gram negativi, catalasi positivi, forma bastoncellare, di piccole dimensioni e mobili mediante un flagello che può assumere posizione polare o laterale. Non crescono sui terreni colturali di routine, ma necessitano di un terreno specifico contenente carbone ed un fattore di crescita essenziale rappresentato dall’aminoacido cisteina (BCYE-α). Caratteristiche colturali Fonte: “A Laboratory manual for Legionella” di T.G.Harrison, A.G. Taylor

Caratteristiche colturali Legionella-Like Amoebal Pathogens (LLAPs) Alcune Legionelle non sono in grado di crescere sui terreni colturali specifici, queste specie sono state chiamate: Legionella-Like Amoebal Pathogens (LLAPs) Recentemente tre ceppi LLAPs sono stati classificati come Legionella spp.

Le conoscenze sul batterio legionella sono aumentate negli ultimi 10 anni, in particolare per quanto concerne approfondimenti sul suo ciclo e sulla sua virulenza. La principale particolarità della patogenicità di Legionella è la sua capacità di moltiplicarsi all’interno della cellula. Il ciclo vitale di Legionella è caratteristico e si attua con gli stessi meccanismi sia nelle cellule dei protozoi che nei mammiferi. Patogenesi Fonte: Fields et Al. - Clin. Microbiol. Rev. - July 2002

Habitat antropico Legionella può essere presente anche negli acquedotti, in quanto è in grado di superare, senza eccessivi danni, i normali trattamenti di potabilizzazione. Tuttavia, la sola presenza di questi batteri non costituisce pericolo per le persone, diventano pericolosi solo quando sussistono contemporaneamente le seguenti condizioni: Temperatura ottimale di sviluppo (da 25°C a 42°C), Ambiente aerobico (presenza di ossigeno), Presenza di elementi nutritivi (biofilm, scorie, ioni di ferro e di calcare, altri microrganismi), Polverizzazione dell’acqua con formazione di microgocce aventi diametri variabili da 1 a 5 micron.

Biofilm Aggregato costituito da batteri, alghe, polimeri e sali naturali. Legionella sopravvive nel biofilm presente nei sistemi idrici degli edifici. Il batterio è stato ritrovato sia nei tamponi eseguiti su biofilm che nell’ acqua corrente a dimostrazione che Legionella spp è associata al biofilm.

Biofilm Scambi che normalmente avvengono fra superfici metalliche e biofilm. Evolversi dei biofilm quando avvengono fenomeni di corrosione Fonte: “Center of Biofilm Engineering” (CBE), Università del Montana – U.S.A.

Habitat antropico Impianti di condizionamento lavatori d’aria a spruzzo, nebulizzatori, separatori di gocce, filtri. Torri di raffreddamento torri ad umido a circuito aperto, torri a circuito chiuso, condensatori evaporativi. Impianti idrosanitari tubazioni, serbatoi di accumulo/scambiatori di calore, valvole e rubinetti soffini delle docce doccette delle vasche.

Habitat antropico Sistemi di emergenza docce di decontaminazione, stazioni di lavaggio occhi, sistemi antincendio a sprinkler. Fontane decorative Apparecchi di erogazione ossigeno Sistemi di raffreddamento macchine utensili Impianti in studi odontoiatrici “riuniti” Piscine e vasche piscine vasche di idromassaggio, vasche calde

Habitat antropico Le utenze e gli impianti più esposti a rischio sono: ospedali, cliniche, case di cura. Ambienti nosocomiali edifici con torri di raffreddamento, caserme, campeggi e strutture recettive in genere, impianti per attività sportive e scolastiche, stabilimenti termali, edifici con fontane decorative e cascate artificiali. Ambienti comunitari

Esempi di casi di legionellosi associati a “torri evaporative”

Esempi di eventi di legionellosi associati ad “impianti di condizionamento”

Esempi di eventi di legionellosi associati ad “impianti idrici” (doccia, vasca da bagno, lavandini)

Esempi di casi di legionellosi associati ad “acqua termale”

Esempi di casi di legionellosi associati a “fonti inusuali”

E importante ottenere un diagramma schematico dell’impianto e annotare le seguenti particolarità: la localizzazione della conduttura principale di rifornimento dell’acqua o della sorgente privata, La localizzazione delle cisterne, dei vasi di amplificazione o delle pompe, La localizzazione dei caloriferi e dei riscaldatori d’acqua, il tipo di apparecchi usati nel sistema (rubinetti, docce, valvole) e con quale materiale sono state costruite le tubazioni, la presenza di torri di raffreddamento, presenza all’interno dell’edificio un sistema di aria condizionata ed uno di umidificazione. Indagine ambientale Prerequisito dell’indagine è una dettagliata conoscenza dell’impianto idrico facendosi coadiuvare o dall’idraulico in caso di un impianto semplice o da altro personale qualificato (ingegnere o geometri dei servizi tecnici) in caso di strutture più complesse.

Dove eseguire i campioni e quali. Indagine ambientale Con tutte queste notizie si deve tracciare una carta / diagramma dei servizi dal punto di ingresso dell’acqua nell’edificio e se possibile sarebbe utile eventualmente annotate nel diagramma: le condizioni delle tubature, le connessioni incrociate con altri servizi, la presenza di rivestimenti, la sorgenti di calore, la protezione standard fornita alle cisterne, i punti morti della rete, i disconnettitori degli apparecchi, come sono fatte le congiunzioni delle tubature. Dove eseguire i campioni e quali.

Dove eseguire i campioni e quali. La ricerca di Legionella spp nell’ambiente idrico artificiale (Indoor), in funzione dell’indagine localistica eseguita, prevede la raccolta di campioni di acqua, di residuo di calcare, di biofilm, di filtri o di limo presente nei punti critici individuati: all’inizio della rete, dalle cisterne e dagli scambiatori di calore, in uno sbocco prossimo, ma a valle di ciascuna cisterna o scambiatori di calore, in un punto distale di ciascun servizio, dall’impianto di condizionamento (acqua di condensa e/o acqua di sgocciolamento e/o filtri). nelle torri di raffreddamento (acqua di sgocciolamento sul fondo della vasca)

Campionamento Nelle Linee Guida Europee per il controllo della legionellosi nei viaggiatori, se in una struttura recettiva si evidenzia la presenza di un potenziale rischio, è necessario effettuare un campionamento dell’acqua per la ricerca di Legionella spp. in un numero di siti che sia rappresentativo di tutto l’impianto idrico e comunque non inferiore a sei. Rete dell’acqua fredda: serbatoio dell’acqua (possibilmente dalla base), il punto più distale dal serbatoio. Rete dell’acqua calda: a) serbatoio di accumulo dell’acqua calda alla base del serbatoio dell’acqua calda vicino alle valvole di scarico, b) ricircolo dell’acqua calda al sito di erogazione più distale dal serbatoio dell’acqua calda.

Prelievo di acqua per ricerca di Legionella Campionamento Prelievo di acqua per ricerca di Legionella Volume di acqua da prelevare: almeno ”un litro” in bottiglie sterili, con presenza di tiosolfato di sodio a (0,01%), ma in alcuni casi, in funzione della sensibilità della risposta quantitativa, fino a 5 litri. Modalità di prelievo: Per valutare, la presenza di Legionella, alle condizioni di utilizzo prelevare acqua calda senza farla scorre e non flambare il punto di sbocco. Per valutare la presenza di Legionella, all’interno della rete di distribuzione dell’acqua, prelevare facendola scorre per 5-10 minuti e flambare il punto di sbocco. Trasporto: a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce con consegna al Laboratorio entro 24 ore dal prelievo, a 4°C per un periodo non superiore a 7 giorni.

Monitoraggio E’ un falso problema. E’ utile implementare un’indagine ambientale ed eseguire campionamenti per ricerca di Legionella in assenza di casi? E’ un falso problema. Qualsiasi indagine microbiologica è di tipo retrospettivo, non risolve il problema, ma informa solo che c’è un problema. Il monitoraggio è utile quando si vuole verificare: l’origine di una infezione, le potenziali fonti di proliferazione / trasmissione, l’efficacia di un protocollo di bonifica. Il monitoraggio è utile quando si vuole tutelare, in ambiente ospedaliero, i pazienti a rischio.

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite su notifica in alberghi (n°18) Anni 1999-2003

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite su notifica in abitazioni civili ed aziende (n°8) Anni 1999-2003

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite in studi odontoiatrici (n°7)

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite in terme (n°2) Anni 1999-2003

Indagine positiva per ricerca di Legionella eseguita su notifica in casa di cura (n°1) Anno 2003 Contagiato il Tecnico che seguiva la ristrutturazione/manutenzione dell’impianto di condizionamento.