ESERCITAZIONE DI FISIOLOGIA ANIMALE L’esercitazione è suddivisa in due fasi: Estrazione dei lipidi di membrana (Bligh & Dyer) Analisi del profilo lipidico mediante: CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) MALDI-TOF

Il rapporto dei solventi è: H2O/CH3OH/CHCl3 = 0,8/2/1 ESTRAZIONE DEI LIPIDI DI MEMBRANA (metodo di Bligh & Dyer) Si parte da un’aliquota di coltura cellulare di 0.8 ml, in provetta da centrifuga Aggiungere 2 ml di CH3OH e agitare gentilmente per 15 min (denaturazione delle proteine) Aggiungere 1 ml di CHCl3 e agitare per 15 min (ripartizione dei lipidi nella fase organica): si nota la precipitazione delle proteine denaturate bianche. MONOFASE Il rapporto dei solventi è: H2O/CH3OH/CHCl3 = 0,8/2/1 Centrifuga: 3500 rpm x 10 min SN Pellet

BIFASE: 0.9:1:1 H2O/ CHCl3 /CH3OH - Aggiungere 1 ml di CHCl3 e 1 ml di KCl 0.2M Fase metanolo acqua Fase cloroformio-lipidi Attendere la separazione tra fase acqua/metanolo (superiore incolore) e fase cloroformio. Nella fase cloroformio sono solubilizzati i lipidi; mentre la proteina denaturata si dispone all’interfase. Raccogliere la fase cloroformio in un’altra provetta. Portare a secco i lipidi disciolti nella fase cloroformio sotto flusso di N2. I lipidi possono essere pesati e risospesi in un piccolo volume di CHCl3. Infine, l’estratto lipidico può essere analizzato mediante TLC.

Preparazione di una lastra per TLC Linea di deposizione Linea del fronte 1 cm 7.5 cm 0,5 cm pozzetto spazio tra due pozzetti Lavaggio della lastra con CHCl3/CH3OH (1:1) Attivazione in stufa 180 °C per 2 h

Estrazione dei lipidi ( Bligh &Dyer) Allestimento bancone: Pipette graduate in vetro Pipette Pasteur in vetro Provette in vetro pirex (vol=15 ml) Palla di Peleo Carta da bancone Agitatore di provette Centrifuga Occorrente: Coltura cellulare di Salinibacter ruber, Halobacterium salinarum CHCl3 (cloroformio) CH3OH (metanolo) H2O bidistillata KCl 0.2M (cloruro di potassio)

Cromatografia su strato sottile Occorrente: Lastre in vetro ricoperte da silice (Merck 20x10 cm, spessore 0,2 mm) Microsiringhe Hamilton (5-10 µl) Cameretta cromatografica Cilindri in vetro Solventi organici Carta da bancone Solventi da preparare: Russel acido: CHCl3/CH3OH/CH3COOH/H2O (85/15/10/3.5 vol/vol) Solvente A : CHCl3/CH3OH/CH3COOH (65/30/4 vol/vol)