Clonaggio per espressione e clonaggio funzionale Clonare un gene sfruttando il metodo tradizionale dell’ibridazione degli acidi nucleici è possibile solo quando si ha qualche idea sulla sequenza che si sta cercando. Tuttavia capita molto spesso di essere interessati a geni per i quali non si ha nessuna indicazione sulla sequenza, ma si hanno a disposizione informazioni sulla proteina. Per molte di queste situazioni sono state sviluppate diverse strategie che, senza far ricoso all’ibridazione, permettono di arrivare all’identificazione del cDNA in questione. In genere queste strategie necessitano di libraries ci cDNA prodotte in vettori di espressione. Questi ultimi possono essere sia di tipo plasmidico che fagico.

Expression Tag, contenente il sito di inizio della traduzione cDNA Expression Tag, contenente il sito di inizio della traduzione (b-Gal o GST) MCS Promotoreregolabile (ad es. lac) MCS cDNA

Problemi posti dalle libraries di espressione Il cDNA deve essere nella giusta cornice di lettura rispetto all’expression tag utilizzato. Pertanto non tutti i cloni che contengono l’inserto produrranno la proteina corretta Le proteine prodotte sono raramente intere. E’ estremamente più facile trovarsi di fronte a frammenti. Tuttavia questo in genere non dà molto fastidio perché i domini funzionali responsabili della caratteristica che interessa sono unità abbastanza indipendenti Se si usano vettori procariotici per proteine eucariotiche, la conformazione tridimensionale delle proteine di fusione potrebbe non essere corretta, e quindi lo screening potrabbe rivelarsi inefficace

Situazioni tipiche e strategie di screening Problema 1 Ho prodotto un anticorpo che riconosce una proteina dalle proprietà molto interessanti. Non riesco a purificare biochimicamente la proteina. Ciononostante ne voglio isolare il cDNA. Soluzione Posso effettuare lo screening di una library di espressione, utilizzando come sonda specifica il mio anticorpo, marcato con isotopi radioattivi o altri traccianti.

+ Induttore del promotore Proteine

Legame antigene-anticorpo, seguito da lavaggi Proteine * * * Legame antigene-anticorpo, seguito da lavaggi

Situazioni tipiche e strategie di screening Problema 2 Sto studiando una proteina, e so che nelle cellule esiste sotto forma di complesso con altre proteine. Voglio trovare i cDNA delle altre proteine che fanno parte di questo complesso. Soluzione Procedo come per l’anticorpo, se sono in grado di produrre notevoli quantità della proteina già nota, opportunamente marcata

Situazioni tipiche e strategie di screening Problema 3 So che una certa sequenza di DNA a doppio filamento lega una proteina importante per la regolazione trascrizionale del promotore di un gene. Voglio clonare il cDNA che codifica per questa proteina. Soluzione Posso effettuare lo screening di una library di espressione, utilizzando come sonda specifica un oligonucleotide a doppio filamento, tipicamente marcato con 32P

Situazioni tipiche e strategie di screening Problema 4 Voglio identificare i possibili substrati di un certo enzima (ad esempio potrebbe essere una protein-chinasi) Soluzione Se possiedo l’enzima purificato, posso effettuare lo screening di una library di espressione, utilizzando l’enzima per trasferire sui substrati specifici una sostanza tracciante (relativamente semplice nel caso delle chinasi, con le quali posso utilizzare 32P-g-ATP)

Clonaggio funzionale In molti casi ci si trova di fronte al problema di voler identificare i geni responsabili di determinate attività biologiche, senza alcuna indicazione sulle molecole che possono legare la proteina di interesse. In questo caso è importante avere a disposizione un saggio funzionale, che permetta di identificare il DNA in questione in base alla sua attività.

Ad esempio, è relativamente facile clonare i geni coinvolti in funzioni vitali di microorganismi se si hanno a disposizione mutanti condizionali

Oltre che per clonare geni, i saggi funzionali in mutanti condizionali possono anche essere utilizzati per rispondere a precisi quesiti biochimici

Esempio di clonaggio funzionale: identificazione di oncogeni cellulari Cellule tumorali Le cellule trasformate sono in grado di crescere in particolari condizioni, come terreni di coltura senza siero, e formano colonie isolabili cDNA library in vettore di espressione CMV Cellule normali Purificando e sequenziando il DNA plasmidico presente nelle colonie trasformate si possono identificare gli oncogeni Cellula trasformata

Saggio funzionale Linea cellulare da paziente Linea cellulare normale Radiazioni ionizzanti Linea cellulare da paziente Linea cellulare normale Cellule morte Cellule vive

Screening funzionale Vettore plasmidico cDNA normale cDNA library da soggetto normale Linea cellulare da paziente Cellule trasfettate con library Radiazioni Analisi del plasmide Clone

Screening in saggi funzionali di libraries suddivise in pool Library genomica o di cDNA Purificazione DNA plasmidico da tutti i singoli cloni I DNA vengono raggruppati per formare diverse serie di pool Singoli cloni A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V X Y Prima serie Pool 1 Pool 2 Pool 3 Pool 4 Pool 5 Pool 6 Seconda serie Pool 7 Pool 8

Esempio: identificazione del gene dell’eritropoietina Cellule CHO trasfettate Pool 7 Pool 8 Cellule staminali midollo osseo Terreno di coltura No eritrociti Eritrociti Pool 4 Pool 5 Pool 6 No eritrociti Eritrociti