MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI nucleotidi Acidi nucleici Aminoacidi proteine ELETTROFORESI Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di Migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un Campo elettrico

Metodi FRONTALI - in soluzione libera ELETTROFORESI Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA. E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in biochimica Metodi FRONTALI - in soluzione libera Metodi ZONALI – attraverso un mezzo poroso Acetato di cellulosa gel carta

UN METODO ANALITICO NUMERO di proteine presenti in una miscela GRADO DI PUREZZA PUNTO ISOELETTRICO PESO MOLECOLARE

FATTORI CHE INFLUENZANO LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE Natura del supporto Campo elettrico applicato Caratteristiche della particella: Massa Carica Dimensioni forma m mobilità elettroforetica m = velocità di migrazione V Campo elettrico applicato E

assorbimento – ritenzione di molecole da parte del supporto (coda) NATURA DEL SUPPORTO assorbimento – ritenzione di molecole da parte del supporto (coda) Elettroendosmosi – per la presenza di gruppi carichi sulla superficie del mezzo di supporto Carta – COOH Agarosio – SO4- pareti di vetro – Si-OH Filtrazione molecolare – effetto setaccio

CAMPO ELETTRICO APPLICATO Voltaggio – Corrente - Resistenza La differenza di potenziale tra gli elettrodi genera: E = V / d E = gradiente di potenziale V = voltaggio applicato d = distanza fra gli elettrodi Intensità di corrente = Voltaggio applicato / Resistenza

Aumentare della distanza fra RESISTENZA Aumentare della distanza fra Gli elettrodi + _ Aumenta la forza ionica del tampone Aumenta la temperatura

INFLUENZA DEL TAMPONE ha la funzione di mantenere le molecole del campione in uno stato di ionizzazione COMPOSIZIONE: non deve legarsi ai composti da separare CONCENTRAZIONE: da 0.05 a 0.10 M pH : determina, influenza, stabilizza la velocità di migrazione RISULTATI RIPRODUCIBILI VOLTAGGIO O AMPERAGGIO COSTANTI

CARATTERISTICHE DELLA PARTICELLA Carica – dimensioni - massa A PARITA’ DI CONDIZIONI ELETTROFORETICHE Le molecole si separano sulla base del rapporto: CARICA / MASSA SUPPORTO CAMPO ELETTRICO

Un apparato per elettroforesi è costituito da ALIMENTATORE CAMERA ELETTROFORETICA Verticale Orizzontale SUPPORTO SOLIDO POROSO SU GEL (su carta da filtro o acetato di cellulosa) (poliacrilammide o Agarosio) Sulla base alla composizione del mezzo in cui avviene l’elettroforesi : · Elettroforesi in condizioni native – denaturanti - riducenti Isoelettrofocalizzazione (IEF) · Elettroforesi bidimensionale · Elettroforesi su gradiente

ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel

usato per separare frammenti di DNA grandi (da 500 bp a 20 Kb) GEL DI AGAROSIO: usato per separare frammenti di DNA grandi (da 500 bp a 20 Kb) GEL DI ACRILAMMIDE: usato per separare frammenti di DNA piccoli (da 1 nucleotide a 2 Kb) I FRAMMENTI DI DNA SI MUOVONO VERSO IL POLO POSITIVO AD UNA VELOCITA’ INVERSAMENTE PROPORZIONALE AL LOGARITMO DELLA LORO LUNGHEZZA (rapporto CARICA / MASSA è COSTANTE)

ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE Utilizzata per la separazione di PROTEINE e di ACIDI NUCLEICI Il gel si ottiene dalla polimerizzazzione di molecole di ACRILAMMIDE e con la formazione di legami crociati in presenza di METILEN-BIS-ACRILAMMIDE Il processo di polimerizzazione è innescato dall’aggiunta di TEMED (tetrametilendiammina) e persolfato GEL DI ACRILAMMIDE: usato per separare frammenti di DNA piccoli ( da 1 nucleotide a 2 Kb)

Formazione di un gel di poliacrilammide

Rivelazione, stima quantitativa e recupero da gel elettro-eluizione densitometria a scansione Comparison of the sensitivity achieved with SYPRO, silver and Coomassie brilliant blue stains. Identical SDS-polyacrylamide gels were stained with A) SYPRO Orange protein gel stain, B) SYPRO Red protein gel stain; C) silver stain and D) Coomassie brilliant blue stain, according to standard protocols.

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI (gel di poliacrilammide in UREA) Separazione di frammenti di DNA UREA 7 M aggiunta al gel mantiene denaturati (a singolo filamento) i frammenti di DNA Gel lungo (fino a 50-60 cm) e sottile Ad alto voltaggio (circa 2000V) I frammenti migrano solo in base alla loro lunghezza DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA

ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Separazione ed analisi di campioni contenenti DNA o RNA Si scioglie l’agarosio in polvere nel tampone in seguito ad EBOLLIZIONE della sospensione Dopo raffreddamento fino alla temperatura di 45°C la soluzione si versa in uno stampo dove gelificherà Un pettine genera gli spazi per depositare i campioni Il gel viene immerso completamente nel tampone Migrazione orizzontale verso il polo positivo (anodo) separazione in BASE ALLA LORO MASSA poiché il loro rapporto CARICA / MASSA è costante

La velocita’ di migrazione dipende: 1) dalle dimensioni dei frammenti 2) dalla percentuale dell’agarosio nel gel 3) dal voltaggio applicato. Frammenti lineari piu’ piccoli migrano piu’ velocemente rispetto a quelli piu’ grandi, mentre, a parita’ di peso molecolare, il DNA circolare migra piu’ velocemente di un DNA lineare, in quanto assume una conformazione detta super avvolta (super coiled DNA)

Come si rivelano gli acidi nucleici? Colorazione con ETIDIO BROMURO (colorante fluorescente) Questo composto contiene un gruppo planare che si intercala tra le coppie di basi del DNA. il colorante viene quindi visualizzato irradiando con raggi U.V. (ad esempio con un transilluminatore) e fotografandolo su un film polaroid. la sensibilità del rilevamento è solitamente migliore di 0.1 mg di DNA. Dal momento che l'etidio è un agente intercalante, è un potenziale mutageno.

SOUTHERN BLOT IMPRONTA DEL DNA basata sui polimorfismi di sequenza cioè piccole differenze di sequenza presenti in media ogni 500 – 1000 coppie di basi e Diverse da individuo ad individuo ( polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione o RFLP)

Dal valore di pH del tampone ELETTROFORESI DI PROTEINE su gel di poliacrilammide La porosità del gel dipende dal rapporto ACRILAMIDE/BIS-ACRILAMIDE LA VELOCITA’ DI MIGRAZIONE DIPENDE Carica netta Dimensione Corrente applicata Dal valore di pH del tampone A pH fisiologici la maggior parte delle proteine è sotto forma di ANIONI (-)

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE Permette di individuare un enzima o proteina per la sua ATTIVITA’ BIOLOGICA Le proteine conservano la loro carica nativa Separazione: rapporto CARICA / MASSA nel gel è possibile incubare un substrato: l’enzima si lega e sviluppa un prodotto colorato PAGE al 7,5 % in sistema refrigerato per evitare denaturazione

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI SDS-PAGE

Le proteine si denaturano con molecole di SDS ogni due residui di Aminoacidi La carica nativa della proteina viene eliminata dalle molecole di SDS cariche negativamente SI ALLESTISCE: Running gel matrice al 10% di PAGE in cui avviene la separazione Staking gel al 4% TUTTE LE PROTEINE SONO CARICHE NEGATIVAMENTE (migrano verso l’anodo) SEPARAZIONE BASATA SULLE DIMENSIONI (gel come setaccio molecolare)

(Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Effetto “setaccio” in un gel uniforme

Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico Colorazione con Blu di Coomassie Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO

La mobilità di una proteina è direttamente proporzionale al logaritmo decimale della MASSA MOLECOLARE

IEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONE separazione di sostanze anfotere Separazione sulla base del pi GEL con GRADIENTE DI pH Si usano GLI ANFOLITI (elettroliti anfoteri) Sono miscele di acidi alifatici sintetici poliammino-policarbossilici che formano un gradiente di pH nella matrice prima della sua polimerizzazione Gli analiti migrano verso la zona di pH corrispondente al proprio punto isoelettrico (FOCALIZZAZIONE) E’ utile una CALIBRAZIONE con proteine a pi noto

Il gradiente di pH e’ formato dall’ introduzione nel gel di composti conosciuti come “anfoliti”, che sono miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici. Gli anfoliti possono essere acquistati per diversi range di pH, sia a banda larga (ad es. da pH 3 a pH 10) che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8)

USO: per separare forme isoenzimatiche e per determinare il punto isoelettrico di una proteina

MAPPA DI PROTEINE: confronto tra normale e malato SEQUENZIAMENTO di proteina da singola macchia Analisi con SPETTROMETRIA DI MASSA

FOCALIZZAZIONE ISOELETTRICA Un’altra tecnica, oltre alla cromatografia a scambio ionico, che permette la separazione di macromolecole sulla base della loro carica. Estremamente potente Catodo (-) Anodo (+)  Miscela di anfoliti Focalizzazione isoelettrica di alcune varianti della stessa proteina, l’emoglobina :

Trasferimento su un foglio di nitrocellulosa

Nel punto in cui è localizzata la proteina che interessa si forma una banda Colorata- L’immunoblot consente di identificare proteine anche in quantità Molto piccole e di definire il loro peso molecolare

Una applicazione clinica del Western Blot Viral Proteins HIV, like any other virus, is composed of a number of different proteins. The Western Blot positive control lane contains proteins from patient sera as well as HIV proteins. HIV positivity can therefore only be confirmed by the presence of the following types of proteins: gp160 viral envelope precursor (env) gp120 viral envelope protein (env) binds to CD4 p24 viral core protein (gag) p31 Reverse Transcriptase (pol) Band pattern interpretation In 1987 the Centers for Disease Control along with several other organizations established criteria for serologic interpretation of HIV Western blot tests. The criteria are listed below. No bands present  Negative Bands at either p31 OR p24 AND bands present at either gp160 OR gp120  Positive Bands present, but pattern does not meet criteria for positivity  Indeterminate Lane 1, HIV+ serum (positive control) Lane 2, HIV- serum (negative control) Lane A, Patient A Lane B, Patient B Lane C, Patient C

Capillary Electrophoresis (CE) Advantages of Capillary Electrophoresis High separation efficiency (105 to 106 theoretical plates) Small sample size required (1-10 ul) Fast separation (1 to 45 min) Easy and predictable selectivity Automation Quantitation (linear) Reproducibility Couple to mass spectrometer Types of Molecules that can be separated by Capillary Electrophoresis Proteins, Peptides, Amino acids Nucleic acids Inorganic ions, Organic bases, Organic acids Whole cells

Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico Colorazione con Blu di Coomassie Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE delle proteine rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO Nell’esempio la purificazione dell’enzima RNA Polimerasi da E.Coli

Elettroforesi di proteine in condizioni native (A) Analysis of binding of the b subunit cytoplasmic domain (bsol) to ECF1 and ECF1 (-). Mixtures of polypeptides were first analyzed by native agarose gel electrophoresis (A) through a 1% agarose gel. Lanes from left to right: I, ECF1 (-) II, bsol ; III,  IV, bsol +  ; V, bsol + ( 1-134); VI, bsol + ECF1 (-); VII,  + ECF1 (-); VIII, bsol +  + ECF1 (-); IX, ECF1 (-) + ( 1-134); X, bsol + ECF1 (-) + ( 1-134). (B) Bands were excised from the agarose gel and separated on a 10-18% gradient of polyacrylamide in SDS. Rodgers et al (1997) J. Biol. Chem. 272: 31058