LEISHMANIOSI: diagnosi di laboratorio Come affrontare i problemi diagnostici nella pratica quotidiana Dott. Emanuele Minetti

Traccia … Tre cardini diagnostici Diagnosi?? Esame delle urine SDS Age: biomarker??

Ricorda … I risultati di un test si dividono in: TN = “True Negative” – Veri Negativi FN = “False Negative” – Falsi Negativi TP = “True Positive” – Veri Positivi FP = “False Positive” – Falsi Positivi Se per esempio su 100 cani eseguo il test “X” vedo che ho i seguenti risultati: TN = “True Negative” – Veri Negativi 81 FN = “False Negative” – Falsi Negativi 5 TP = “True Positive” – Veri Positivi 12 FP = “False Positive” – Falsi Positivi 2

Ricorda … la Sensibilità Sensibilità = [TP ÷ (TP + FN) ] X 100 E’ la capacità di un test di identificare individui malati E’ la frequenza di un risultato positivo o “anormale” quando una malattia è presente E’ il limite % inferiore di indagine di un analita Esempio: sui 100 test “X” ho ottenuto 12 TP e 5 FN Sensibilità = [12 ÷ (12 + 5) ] X 100 = 70,58 %

Ricorda … la Specificità Specificità : [TN ÷ (TN + FP) ] X 100 E’ la capacità di un test di laboratorio di identificare pazienti che non presentano una malattia in particolare E’ la frequenza di un risultato negativo o “normale” quando una malattia è assente Esempio: sui 100 test “X” ho ottenuto 81 TN e 2 FP Specificità = [81 ÷ (81 + 2) ] X 100 = 97,59 %

Ricorda … Quando la sensibilità aumenta, la specificità diminuisce Un test di laboratorio è solo in alcuni casi altamente sensibile e altamente specifico I test di screening necessitano di alta sensibilità perché i risultati Falsi Positivi sono più accettabili dei risultati Falsi Negativi I test di screening sono usati per determinare la presenza di una malattia

Tre cardini diagnostici Ricerca del protozoo Leishmania Titolo anticorpale Proteine totali e Elettroforesi delle sieroproteine Dal 1985, anno in cui presentai una relazione proprio qui a Milano, nella pratica clinica poco è cambiato, se non alcune metodiche di laboratorio di riferimento

Dal 1985, anno in cui presentai una relazione proprio qui a Milano, nella pratica clinica poco è cambiato, se non alcune metodiche di laboratorio di riferimento

1) Alla ricerca del protozoo Esame citologico Esame istologico Esame Polymerase Chain Reaction (PCR e RT-PCR)

Un esame citologico negativo esclude la diagnosi di leishmaniosi Midollo osseo Linfonodi Cute Altri organi VANTAGGI: semplice, economico, rapido, specifico SVANTAGGI: sensibilità, deve eseguirlo un patologo di buona esperienza, difficoltà nel campionamento (midollo, organi interni) Un esame citologico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi

Un esame istologico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi Linfonodi Cute Altri organi VANTAGGI: relativamente semplice, abbastanza economico, offre ulteriori dati al caso clinico, specifico SVANTAGGI: sensibilità, da inviare a patologo veterinario esperto presso laboratorio di analisi, difficoltà nel campionamento, tempi di risposta di alcuni giorni Un esame istologico negativo NON esclude la diagnosi di leishmaniosi

Esame PCR: Reazione a Catena della Polimerasi La PCR (Polymerase Chain Reaction) consiste nella sintesi ciclica di DNA in vitro La miscela di reazione contenente gli oligonucleotidi specifici (primers), i nucleotidi trifosfati, un tampone di reazione adatto all’enzima, l’enzima DNA polimerasi termostabile e il DNA bersaglio viene sottoposta alla reazione La reazione, articolata in cicli successivi, comporta la duplicazione di ogni molecola di DNA bersaglio presente nel campione ad ogni successivo ciclo

PCR: “Golden Standard”? Midollo osseo Sangue intero Linfonodi Mix VANTAGGI: sensibilità, specificità SVANTAGGI: metodiche di campionamento non di routine, test fortemente condizionato dalla natura del campione inviato al laboratorio e dalla tecnica utilizzata nell’estrazione del DNA, tempi di risposta, costi Al momento non può essere ancora considerato esame di routine per le difficoltà pre-analitiche

2) Il titolo anticorpale: IFI La sierologia consente di determinare anticorpi specifici nei confronti del parassita La metodica in immunofluorescenza IFI è ancora oggi ritenuta il “Golden Standard” nella diagnosi della leishmaniosi canina Tale metodo è insostituibile negli studi epidemiologici, nella pratica clinica e nel follow-up del paziente Un titolo positivo di 1:160/1:200 ha specificità dal 98% al 99%

Altre metodiche anticorpali? vantaggi e svantaggi Emoagglutinazione IHAT: antigene Leishmania Donovani, specifico ma poco sensibile (< 60%) Test di agglutinazione (commerciale): non più usato a causa delle molte reazioni crociate con altre malattie parassitarie ed infettive Test ELISA (commerciali): in genere da antigene totale, non sufficientemente specifici, poco sensibili, reazioni crociate possibili Test di Immunomigrazione (commerciali): molti e con diverse sensibilità e specificità, non buona riproducibilità e costanza nei risultati, reazioni crociate possibili

Altre metodiche anticorpali? Considerazioni pratiche Nessun test commerciale è attualmente paragonabile all’IFI per sensibilità e specificità Sensibilità e specificità variabili ne sconsigliano l’uso negli studi epidemiologici, nella pratica clinica, nel follow-up Creano “confusione diagnostica” e l’attesa del clinico è fortemente influenzata dai messaggi commerciali e dal vantaggio economico immediato Apparente servizio al cliente ma ad alto rischio di “Missing Diagnosis” o falsa diagnosi di malattia Troppo spesso usati per escludere la leishmaniosi canina dal diagnostico differenziale Un test negativo o positivo NON esclude o include la diagnosi di leishmaniosi

3) Leishmaniosi e P.T. con elettroforesi delle sieroproteine Proteine totali sieriche P.T. al di sopra dell’intervallo di riferimento Aumento delle frazioni beta-1, beta-2 e gammaglobuline, ponti beta-gamma Inversione rapporto albumine/globuline

Diagnosi ?? Nessuno dei test menzionati consente “da solo” di emettere diagnosi di leishmaniosi canina, di effettuare studi epidemiologici, di realizzare il follow-up del cane Positività anticorpale non è uguale a cane malato Ogni paziente “è un protocollo diagnostico” È necessario approfondire gli aspetti epidemiologici e clinici della malattia nel Nord Italia

Diagnosi ?? Gli esami di laboratorio devono essere completi  profili ematologici e biochimici per stadiare correttamente il paziente La stadiazione del cane leishmaniotico deve essere eseguita sempre anche tramite un profilo delle urine completo  chimico-fisico, rapporto PU/CU, SDS Age proteine urinarie per peso molecolare

Esame delle urine Il solo esame chimico-fisico delle urine non permette di stabilire se il cane è proteinurico Il solo rapporto Proteine Urinarie/ Creatinina Urinaria PU/CU non permette di stabilire se il cane è sicuramente proteinurico L’unico esame che attualmente permette lo studio della proteinuria nel cane è la elettroforesi modificata per peso molecolare su Sodio Dodecil Solfato Agar Gel SDS-Age

Analisi quali-quantitativa per peso molecolare delle proteine urinarie SDS Age Proteinurie PROTEINE TUBULARI < 70 KdA Beta2microglobuline 12 kDa Lisozima 15 kDa RBP 21 kDa Monomeri K/L 25 kDa Alfa1microproteine 33 kDa Dimeri K/L 50 kDa Albumine/Prealbumine 70 kDa Transferrina 80 kDa IgG 160 kDa IgA 165 kDa Aproglobuline Alfa2macroglobuline PROTEINE GLOMERULARI > 70 KdA PUNTO DI APPLICAZIONE

Le corse dei campioni vengono confrontate ciascuna con il SDS Age Proteinurie Ogni SDS viene eseguito inserendo un pool proteine di riferimento a composizione e peso molecolare noto in posizione 3 1 banda a P.M. 160 kDa 2 banda a P.M. 70 kDa 3 banda a P.M. 27 kDa 4 banda a P.M. 15 kDa 1 2 3 4 P.M. 1 2 3 4 Le corse dei campioni vengono confrontate ciascuna con il riferimento noto

Esempio di refertazione per SDS Age

Tipi di proteinuria Assente: il test non mostra alcuna banda di deposizione Semplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P.M. fra 900 e 70 kDa Semplice Tubulare: presenza di proteine tubulari con P.M. fra 70 e 12 kDa Mista Tubulare - Glomerulare: presenza di bande di proteine sia tubulari sia glomerulari

Assente: il test non mostra alcuna banda di deposizione Assenza di proteinuria Danno renale assente o di lieve entità Prognosi buona Ripetere il test durante il trattamento con antimoniali per valutare eventuale comparsa di bande tubulari in zona monomeri K/L-FLC (danno renale da farmaco?) Corsa n. 5 Nessuna deposizione di bande proteiche

Semplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P. M Semplice Glomerulare: presenza di proteine glomerulari con P.M. fra 900 e 70 kDa Danno renale presente anche se gli altri esami biochimici apparentemente sono negli intervalli di riferimento Diagnostica per immagini: ecografia renale, Rx apparato urinario con contrasto Esecuzione biopsia renale eco-assistita Corsa n. 3 Bande proteiche a 70 e 80 kDa

Banda a 70 kDa (albumine) e banda a 25 kDa (FLC) Semplice Tubulare: presenza di proteine tubulari con P.M. fra 70 e 12 kDa Danno renale presente o malattia neoplastica (mieloma multiplo) o infiammatoria Indagini collaterali complete (ecografia, Rx, TAC, RMN ecc) Condizione rara quasi sempre con banda fra 25 e 20 kDa da riferirsi a monomeri K/L o Free Light Chains-FLC (o Catene Libere Leggere) … possono essere anche identificate come proteine di Bence-Jones Banda a 70 kDa (albumine) e banda a 25 kDa (FLC) Corsa n. 4

Esempio di FLC proteinuria Immunofissazioni per FLC o monomeri K/L con anticorpi anticane

Mista Tubulare-Glomerulare: presenza di bande di proteine sia tubulari sia glomerulari Danno renale grave Prognosi da seria ad infausta Possibile end-stage Eventuali ulteriori indagini diagnostiche (ecografia, Rx, TAC, RMN, ecc) Corse n. 1 e n. 2 Bande fra 900 e 15 kDa

SDS Age: biomarker? La valutazione qualitativa della proteinuria nel cane è sicuramente un nuovo ed importante ausilio diagnostico soprattutto nei cani senza apparenti segni clinici di Leishmaniosi ma positivi ai test di ricerca del protozoo e/o anticorpali Avere a disposizione un test predittivo per la valutazione della funzionalità renale consente di avere più dati nell’iter clinico che porta alla decisione sempre critica del trattamento o meno dei soggetti asintomatici o paucisintomatici

Si apre un capitolo nuovo Lo studio della proteinuria nel cane è un nuovo capitolo che si è appena aperto e, sulla scorta dell’importanza che ha assunto nella patologia clinica dell’uomo, potrà diventare uno strumento fondamentale nelle mani del Medico Veterinario La complessità della materia non consente oggi di valutarne appieno le opportunità diagnostiche Sono in corso di pubblicazione lavori scientifici che consentiranno di applicare l’analisi delle proteine urinarie in corso di Leishmaniosi nella pratica clinica

Bibliografia … LATIMER K.S., MAHAFFEY E.A. , PRASSE K.W.: “VETERINARY LABORATORY MEDICINE , CLINICAL PATHOLOGY” – DUNCAN&PRASSE’S 4TH ED. 2003 WILLARD M.D. , TVEDTEN H.: “SMALL ANIMAL CLINICAL DIAGNOSIS BY LABORATORY METHODS” – SAUNDERS 4TH ED. 2004 POLI G.: “PRINCIPI E APPLICAZIONI DELL’INGEGNERIA GENETICA”- UTET 1997 POLI G., COCILOVO A.: “MICROBIOLOGIA E IMMUNOLOGIA VETERINARIA” – UTET 1996 LE CARRER D. ,BOUCRAUT J.: “ URINE PROTEIN ELECTROPHORESIS END IMMUNOFIXATION, ILLUSTRATED INTERPRETATIONS” –LAB. SEBIA 1999 ZATELLI A., BONFANTI U.: “QUALITATIVE DETERMINATION OF PROTEINURIA BY SDS-AGE IN THE HEALTHY DOG” J VET INT MED 2002;3:389 A. ZATELLI - E. ZINI - U. BONFANTI - R. SANTILLI - M. BORGARELLI: ”CORRELATION BETWEEN QUALITATIVE PROTEINURIA ASSESSED WITH SDS-AGE AND RENAL HISTOPATHOLOGIC FINDINGS IN DOGS” A. ZATELLI ET ALII: “GLOMERULAR LESIONS IN DOGS INFECTED WITH LEISHMANIA ORGANISM” AM J VET RES,2003 MAY;64(5):558-61 ZINI E., BONFANTI U. ZATELLI A.: “WISHES TO CLARIFY SUBJECT OF CANINE MULTIPLE MYELOMA” J AM VET MED ASSOC. 2004 JAN 15;224(2);196; 196-7

Ringrazio La Bayer e il CVM per l’opportunità concessami I colleghi Andrea Zatelli, Ugo Bonfanti, Eric Zini e tutti gli altri con i quali in questi ultimi quasi tre anni ho avuto l’onore di condividere una serie di ricerche difficili e complesse che ha portato alla pubblicazione, tutt’ora in corso, di prestigiosi articoli scientifici sulle più importanti riviste internazionali Lo staff scientifico e tecnico della BiEsseA Laboratorio Analisi Veterinarie di Milano senza il quale il mio lavoro non esisterebbe Un ringraziamento particolare alla Dottoressa Sabrina Giussani che ha avuto la pazienza di sopportarmi e di “aggiustare” questa presentazione