CROMAROGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMAROGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) (CAS-5) Giorgio Bonaga

COMATOGRAFIA LIQUIDA PLANARE La fase stazionaria non è contenuta in una colonna, ma è distesa su una superficie piana. Le tecniche cromatografiche planari sono fondamentalmente due: cromatografia su strato sottile (TLC = Thin Layer Chromatography) cromatografia su carta (PC = Paper Chromatography) Sono tecniche rapide, semplici ed economiche. Specialmente la TLC è di grande aiuto nella fase di screening, cioè nella fase che precede l’analisi quali-quantitativa più rigorosa di una miscela di sostanze. Nel settore della chimica delle sostanze naturali, ed in particolare in quello dell’analisi degli alimenti, la TLC è ancora oggi uno strumento prezioso. Anche la TLC è governata dalla teoria generale della cromatografia, ma vanno discusse alcune varianti che sono caratteristiche dei metodi planari. Giorgio Bonaga 2

TLC a. FLUSSO DELLA FASE MOBILE La trattazione della TLC può essere organizzata in 4 punti: a. Flusso della fase mobile b. Fase stazionaria c. Fase mobile d. Esecuzione della TLC a. FLUSSO DELLA FASE MOBILE La migrazione della fase mobile avviene per capillarità ascensionale (la capillarità è l’insieme dei fenomeni dovuti alle interazioni tra le molecole di un liquido ed un solido, in corrispondenza della superficie che li separa). Il flusso ascensionale per capillarità dipende dalla natura della fase mobile (dalla sua tensione superficiale g e viscosità h), dalla natura della fase stazionaria (dimensione delle particelle) e dalla temperatura. In conclusione, dalle stesse variabili che, nella teoria generale della cromatografia, venivano indicate come i parametri che influenzano l’equilibrio di distribuzione termodinamico. Giorgio Bonaga 3

TENSIONE SUPERFICIALE (g) La tensione superficiale (N/m) è la forza che agisce sulle molecole della superficie libera di un liquido, conferendo alla superficie proprietà simili a quelle di una pellicola elastica. La natura della tensione superficiale è la stessa delle forze attrattive che agiscono tra le molecole interne del liquido: sono forze di coesione, di natura elettrostatica (legami a idrogeno, forze di London), antagoniste alle forze di adesione (legami a idrogeno), che si stabiliscono tra un fluido ed una superficie solida. Tuttavia, mentre ogni molecola interna, completamente circondata dal liquido, è attratta in ugual misura in tutte le direzioni dalle molecole vicine, ogni singola molecola superficiale risente solo dell’attrazione esercitata dalle molecole vicine; il risultato è una forza di richiamo, che tende ad attirare le particelle superficiali verso l’interno del liquido, conferendo alla superficie caratteristiche elastiche. Giorgio Bonaga tensione superficiale 4

TENSIONE SUPERFICIALE E TEMPERATURA Un effetto noto della competitività tra le forze di coesione e le forze di adesione è il profilo del menisco del liquido (ad es.: acqua o mercurio) che riempie un tubo di vetro. Nell’acqua le forze di adesione > forze di coesione e il menisco è concavo (l’acqua bagna il vetro perché forma legami a idrogeno). Nel mercurio le forze di adesione < forze di coesione e il menisco è convesso (il mercurio non bagna il vetro perché non forma legami a idrogeno). TENSIONE SUPERFICIALE E TEMPERATURA La tensione superficiale (g) diminuisce all’aumentare della temperatura (T), dal momento che aumentando il moto delle molecole si indeboliscono le forze di coesione intramolecolari. solvente g (N/m) 0°C 20°C 50°C acqua 7,6 . 10-2 7,2 . 10-2 6,8 . 10-2 esano 2,2 . 10-2 1,8 . 10-2 1,4 . 10-2 g Giorgio Bonaga 5

TENSIONE SUPERFICIALE (g) DI LIQUIDI liquido g (20°C) N . m-1 etere etilico 1,7 . 10-2 esano 1,8 . 10-2 acetonitrile 1,9 . 10-2 metanolo 2,2 . 10-2 tetraidrofurano 2,6 . 10-2 cloroformio 2,7 . 10-2 tetraclorometano diclorometano 2,8 . 10-2 toluene benzene diossano 3,4 . 10-2 glicerina 6,3 . 10-2 acqua 7,6 . 10-2 mercurio 42,7 . 10-2 Giorgio Bonaga 6

DUE ESEMPI DI TENSIONE SUPERFICIALE Giorgio Bonaga 7

VISCOSITA’ (h) F v v v l v v = 0 La viscosità (Pa . s) è la resistenza allo scorrimento dei fluidi reali (liquidi e gas). Prendiamo un fluido confinato tra due lastre di vetro di superficie A e distanti tra loro l. Tenendo ferma la lastra di vetro inferiore, per fare scorrere quella superiore a velocità costante v occorre applicare una forza F. Tale forza F è necessaria perché lo strato monomolecolare di fluido vicino alla lastra superiore esercita una resistenza viscosa che si oppone allo scorrimento; ogni strato monomolecolare di fluido esercita su quelli adiacenti una resistenza, tanto che la velocità v del fluido ha un andamento a gradiente (diminuisce, fino ad azzerarsi, procedendo dagli strati superiori verso quelli inferiori) Il modulo della forza F risulta direttamente proporzionale a v e ad A, inversamente proporzionale alla distanza l e dipende anche da un coefficiente di proporzionalità detto coefficiente di viscosità (h). F v v v l v v = 0 Giorgio Bonaga 8

COEFFICIENTE DI VISCOSITA’ E TEMPERATURA L’espressione che definisce il modulo F è: F = h Da cui si ricava il coefficiente di viscosità h: h = = Pa . s = COEFFICIENTE DI VISCOSITA’ E TEMPERATURA Il coefficiente di viscosità h diminuisce all’aumentare della temperatura, dal momento che aumentando il moto delle molecole diminuiscono le forze di coesione intramolecolari. NOTA: nei gas, contrariamente ai liquidi, l’aumento di temperatura produce un aumento del valore del coefficiente di viscosità. A . v l kg m . s F . l A . v solvente h (Pa . s) 0°C 20°C 60°C acqua 1,8 . 10-3 1,0 . 10-3 0,65 . 10-3 glicerina 10000 . 10-3 1400 . 10-3 81 . 10-3 Giorgio Bonaga 9

COEFFICIENTI DI VISCOSITA’ (h) DI LIQUIDI liquido (20°C) Pa . s etere etilico 2,4 . 10-4 esano 2,9 . 10-4 acetonitrile 3,2 . 10-4 diclorometano 4,5 . 10-4 tetraidrofurano 4,6 . 10-4 metanolo 5,4 . 10-4 toluene 5,5 . 10-4 cloroformio 5,9 . 10-4 benzene 6,5 . 10-4 tetraclorometano 1,0 . 10-3 acqua diossano 1,4 . 10-3 mercurio 1,7 . 10-3 glicerina 14,0 . 10-1 Giorgio Bonaga 10

DUE ESEMPI DI VISCOSITA’ Giorgio Bonaga 11

CONFRONTO DELLE g e h DI ALCUNI LIQUIDI 14,0 . 10-1 50 42,7 . 10-2 ≈ 1,7 . 10-3 ≈ 12 10 10 1,0 . 10-3 9 8 8 h (Pa . s) g (N . m-1) 6,5 . 10-4 7 7,2 . 10-2 6 6 6,3 . 10-2 5,4 . 10-4 5 4 4 2,3 . 10-4 3 2,8 . 10-2 2 2 2,2 . 10-2 1,7 . 10-2 1 etiletere metanolo benzene glicerina acqua mercurio Giorgio Bonaga 12

la tensione superficiale g favorisce l’ascesa del liquido la densità d (e la gravità g) rallentano l’ascesa del liquido CAPILLARITA’ (h) Giorgio Bonaga tubo capillare H2O Hg La domanda è: quanto sale un liquido per capillarità ? 13

La forza diretta verso l’alto è il prodotto della tensione superficiale (g) per la lunghezza del contatto tra la superficie liquida e la parete di vetro, cioè la circonferenza (2pr) del tubo. La forza diretta verso il basso è la gravità, pari all’accelerazione di gravità (g) per la massa (m) del liquido, cioè il prodotto del suo volume (pr2h) per la sua densità (d). Quando il liquido raggiunge l’altezza massima consentita, le due forze si eguagliano: 2prg = pr2hdg da cui : h = 2prg 2g r d g m = pr2hd h mg Giorgio Bonaga 14

ESEMPI Di quanti cm si innalza l’acqua, in un tubo di diametro interno di 0,4 mm, a 20°C ? g (20°C) = 7,2 . 10-2 N . m-1 r = 0,2 mm d(20°C) = 0,998 g . cm-3 g = 9,81 m . s-2 h = 7,43 cm Di quanti cm si innalza l’esano, in un tubo di diametro interno di 0,4 mm, a 20°C ? g (20°C) = 1,8 . 10-2 N . m-1 r = 0,2 mm d(20°C) = 0,659 g . cm-3 g = 9,81 m . s-2 h = 2,78 cm 7,43 cm (acqua) 2,78 cm (esano) Giorgio Bonaga 15

CAPILLARITA’ E TEMPERATURA 0°C 20°C 50°C 7,76 cm 7,43 cm 6,95 cm 3,40 cm 2,78 cm 2,20 cm acqua esano Giorgio Bonaga 16

DUE ESEMPI DI CAPILLARITA’ Giorgio Bonaga 17

ASCIUGHIAMO …. IL TAVOLO (un esempio di una pseudo-cromatografia su carta) carta assorbente superficie solida Giorgio Bonaga 18

CAPILLARITA’ NELLA TLC supporto inerte (vetro, alluminio, PET) fase stazionaria (silica gel, allumina) Sf Af Bf fase mobile (miscela di solventi) Giorgio Bonaga 19

con: t = tempo di migrazione La capillarità ascensionale, dunque, trascina la fase mobile lungo lo strato di fase stazionaria per effetto della tensione superficiale, in una migrazione frenata dalla forza di gravità. La distanza percorsa dal fronte del solvente (Sf) è data dall’espressione: con: t = tempo di migrazione k = costante di proporzionalità = . con: dp = diametro delle particelle della fase stazionaria (in mm) g = tensione superficiale del liquido (in N . m-1) h = viscosità del liquido (Pa . s) Il flusso di fase mobile, pertanto, è direttamente proporzionale a g e inversamente proporzionale a h. Esso non è costante, ma a gradiente, da un valore massimo (estremità inferiore della lastra) a zero (estremità superiore della lastra). Il fronte del solvente, pertanto, può essere definito la distanza dall’origine nella quale il flusso della fase mobile è zero. È bene sottolineare che nella TLC il flusso non è facilmente regolabile e che la sua tendenza ad azzerarsi determina anche la dimensione massima della lastra (20 x 20 cm). Sf = √ t . k g h 1 2dp Giorgio Bonaga 20

(esano) = 1,8 . 10-2 N . m-1 (esano) = 2,9 . 10-4 Pa . s Sf = √ k . t ESEMPI Qual’è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con esano per 20 minuti a 20°C una lastra di gel di silice con particelle del diametro di 5 mm ? dp = 5 mm = 5 . 10-6 m (esano) = 1,8 . 10-2 N . m-1 (esano) = 2,9 . 10-4 Pa . s t = 20’ = 1200 s Sf =  8,5 . 10-2 m =  8,5 cm Nelle stesse condizioni, con: dp = 20 mm Sf =  4,5 . 10-2 m =  4,5 cm Sf = √ k . t 1,8 . 10-2 N . m-1 2 x 5 . 10-6 m 2,9 . 10-4 Pa . s 1 Sf = 1200 s 74 . 10-4 m2 Sf = Giorgio Bonaga 21

(metanolo) = 2,2 . 10-2 N . m-1 (metanolo) = 5,4 . 10-4 Pa . s ESEMPI Qual è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con metanolo per 30 minuti a 20°C una lastra di gel di silice con particelle del diametro di 5 mm ? dp = 5 mm = 5 . 10-6 m (metanolo) = 2,2 . 10-2 N . m-1 (metanolo) = 5,4 . 10-4 Pa . s t = 30’ = 1200 s Sf =  7,0 . 10-2 m =  7,0 cm Nelle stesse condizioni, con: dp = 20 mm Sf =  3,5 . 10-2 m =  3,5 cm Sf = √ k . t 2,2 . 10-2 N . m-1 2 x 5 . 10-6 m 5,4 . 10-4 Pa . s 1 Sf = 1200 s 49 . 10-4 m2 Sf = Giorgio Bonaga 22

(diossano) = 3,4 . 10-2 N . m-1 (diossano) = 1,4 . 10-3 Pa . s ESEMPI Qual è il Sf in una TLC ottenuta sviluppando con diossano per 20 minuti a 20°C una lastra di gel di silice con particelle del diametro di 5 mm ? dp = 5 mm = 5 . 10-6 m (diossano) = 3,4 . 10-2 N . m-1 (diossano) = 1,4 . 10-3 Pa . s t = 20’ = 1200 s Sf =  5,4 . 10-2 m =  5,4 cm Nelle stesse condizioni, con: dp = 20 mm Sf =  2,8 . 10-2 m =  2,8 cm Sf = √ k . t 3,4 . 10-2 N . m-1 2 x 5 . 10-6 m 1,4 . 10-4 Pa . s 1 Sf = 1200 s 29 . 10-4 m2 Sf = Giorgio Bonaga 23

Quando sulla lastra TLC si depone una soluzione di campione e si sviluppa immergendola in una vaschetta contenente la fase mobile, nell’ascesa ciascun soluto presente nel campione si ripartisce tra la fase mobile e la fase stazionaria e migra con una certa velocità. Alla fine dell’eluizione (cioè quando la fase mobile ha percorso la distanza Sf) ciascun soluto avrà percorso una certa distanza (Xf) dal punto di caricamento del campione, distanza che definisce il suo fattore di ritardo (Rf = Retard factor) o fattore di ritenzione (Retention factor). L’ Rf è espresso dal rapporto tra il valore in centimetri della migrazione del soluto, misurata a partire dalla linea di caricamento (cioè a circa 2,5 cm dall’estremità inferiore della lastra) e la misura in centimetri (normalmente 10-12 cm, con fasi mobili a bassa viscosità) del Sf . Xf = 3 cm Sf = 12 cm Rf (X) = 3/12 = 0,25 Sf Xf Giorgio Bonaga 24

I valori di Rf possono essere convertiti nei valori del fattore di capacità k’, attraverso la relazione: k’ = Le condizioni TLC ottimali si realizzano quando il valore di Rf è compreso tra 0,20 e 0,25 perché ad essi corrisponde un valore di k’ compreso tra 4 e 3 (i valori ideali del k’). ESERCIZIO Un soluto è migrato per 6 cm, in una TLC con Sf = 12 cm. Calcolare Rf e k’ del soluto. Rf = 6/12  0,5 k’ = = 1,0 Più è elevata la viscosità della fase mobile minore è la capillarità ascensionale (h) dei soluti. Inoltre le bande (o le macchie) “scodano” (trascinamento). È un effetto analogo alla diminuzione di flusso di gas di trasporto nella GC o alla diminuzione di pressione della fase mobile nella HPLC. 1 Rf - 1 1 0,5 - 1 Giorgio Bonaga 25

LASTRA PER TLC (20 x 20 cm) Sf Rf = 0,25 start PROPRIETA’ supporto di vetro (20 x 20 cm) strato di silica gel Rf = 0,25 start PROPRIETA’ material  silica gel 60 layer thickness   250  mm particle size  5-20 mm pore size  60 Å Giorgio Bonaga 26

Superficie specifica (m2/g) b. FASE STAZIONARIA Nella TLC la fase stazionaria è generalmente costituita da silice (più raramente allumina), la cui gelificazione viene ottenuta con sostanze diverse (acidi carbossilici, alcoli grassi, ecc.), successivamente addizionata di leganti (gesso, alcol polivinilico, polimeri diversi) ed infine stratificata (con spessori dipendenti dal tipo di TLC) sulla lastra di vetro. Proprietà Silice 40 Silice 60 Silice 100 Diametro pori (Å) 40 60 100 Volume pori (ml/g) 0,65 0,75 1,0 Superficie specifica (m2/g) 650 500 400 Tipo di TLC Spessore strato (mm) Diametro particelle Volume depositabile (ml) Preparativa 500 - 2000 20 - 40 150 Analitica 250 10 – 20 1 HPTLC 5 Giorgio Bonaga 27

Anche per la TLC è disponibile sul mercato silice per cromatografia a fase diretta, silice funzionalizzata (C18) per cromatografia a fase inversa (con fasi mobili contenenti al massimo il 25% di acqua, a causa della limitata bagnabilità della silice funzionalizzata), silice per cromatografia a coppia ionica, silice per cromatografia chirale. La TLC che utilizza particelle di silice della dimensione di 5 mm è una tecnica che raggiunge alte prestazioni ed è definita con l’acronimo HPTLC (High Performance Thin Layer Chomatography). TLC PREPARATIVA ANALITICA HPTLC 2000 mm 250 mm 150 mm 40 mm 10 mm 5 mm Giorgio Bonaga 28

c. FASE MOBILE Nella TLC la fase mobile è una miscela di liquidi scelti in base al tipo di tecnica cromatografica prescelta (fase diretta, fase inversa, ecc.). Analogamente alla LC, per: FASE DIRETTA: la fase mobile si prepara miscelando un primo solvente non polare (es. esano) con un secondo solvente più polare (es. etere etilico) e con piccole quantità di un terzo solvente molto polare (es. acido acetico) in modo da disattivare, in parte, lo strato di gel di silice ed evitare lo scodamento delle macchie o delle bande; FASE INVERSA: la fase mobile si prepara miscelando un primo solvente polare (es. acetonitrile) con un secondo solvente non polare (es. toluene). Giorgio Bonaga 29

d) ESECUZIONE DELLA TLC 1. Stoccaggio delle lastre Le lastre per TLC vengono conservate in essicatore o attivate in stufa a circa 100°C per un’ora prima dell’uso. Giorgio Bonaga 30

2. Caricamento del campione Giorgio Bonaga 2. Caricamento del campione Mediante una microsiringa o un capillare, la soluzione di campione viene depositata a circa 2,5 cm dall’estremità inferiore della lastra, “a macchia” (“spot”) nella TLC analitica o bidimensionale, a “banda” nella TLC preparativa. 3. Sviluppo della lastra La camera di sviluppo, a tenuta, è dotata di una vaschetta contenente circa 100 ml di fase mobile. La camera viene presaturata di fase mobile in frigorifero, prima dello sviluppo. La lastra viene posta nella vaschetta e al termine dello sviluppo viene estratta e asciugata. Nel caso della TLC bidimensionale la lastra viene ruotata di 90° e sviluppata una seconda volta in una seconda camera presaturata con la fase mobile scelta per la seconda eluizione cromatografica. 31

CARICAMENTO E SVILUPPO TLC MONODIMENSIONALE Sf (12 cm) ascensione (capillarità) 2,5 cm caricamento del campione “a banda” caricamento del campione “a macchia” Giorgio Bonaga 32

CARICAMENTO E SVILUPPO TLC BIDIMENSIONALE caricamento del campione Giorgio Bonaga 33

CARICAMENTO E SVILUPPO TLC BIDIMENSIONALE caricamento del campione Giorgio Bonaga 34

CAMERA DI SVILUPPO PER TLC Giorgio Bonaga

4. Rivelatori e visualizzazione Giorgio Bonaga 4. Rivelatori e visualizzazione Nella TLC sono numerosi, ma i più comuni si basano su due principi. Rivelatori di fluorescenza Con un nebulizzatore si spruzza la lastra con una soluzione alcolica di sale sodico di 2’,7’-diclorofluoresceina. La lastra viene visualizzata con una lampada di Wood (radiazioni UV). Rivelatori per carbonizzazione Con un nebulizzatore si spruzza la lastra con una soluzione satura di bicromato di potassio in acido solforico. La lastra viene visualizzata dopo riscaldamento in stufa a 110°C per alcuni minuti. 36

RIVELATORI E VISUALIZZAZIONE lampada di Wood soluzione alcolica del sale sodico della 2',7'- diclorofluoresceina Giorgio Bonaga

RIVELATORI E VISUALIZZAZIONE soluzione satura di K2Cr2O7 in H2SO4 (in stufa a 110°C per alcuni minuti) Giorgio Bonaga 38

PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE Giorgio Bonaga ALTRI RIVELATORI RIVELATORE PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE SOSTANZE RIVELABILI anisaldeide soluzione di 0,5 ml di anisaldeide in 50 ml di CH3COOH glaciale con aggiunta di 1 ml di H2SO4 concentrato steroli terpeni reattivo di Dragendorff soluzione 0,11 M di KI aggiunta a una soluzione 0,6 mM di subnitrato di bismuto in CH3COOH 3,5 M alcaloidi composti con N quaternario iodoplatinato di potassio soluzione allo 0,15% di iodoplatinato di potassio aggiunta a una soluzione al 3% di HCl diluito ammine composti azotati acido fosfomolibdico soluzione al 10% di acido fosfomolibdico in etanolo lipidi lattoni cheto- e idrossi-acidi acidi grassi insaturi composti fenolici rodammina B soluzione allo 0,25 % di rodammina B in etanolo anisaldeide subnitrato iodoplatinato acido fosfobolibdico rodammina B di bismuto di potassio 39