I DISORDINI DELLA SERIE ERITROIDE INQUADRAMENTO E CLASSIFICAZIONE “Uno sguardo sulle Anemie: dalla clinica al laboratorio” FIRENZE 26 NOVEMBRE 2008 Prof. Alberto Bosi Cattedra di Ematologia Università degli Studi di Firenze

EMOPOIESI L’insieme dei processi che regolano il mantenimento del numero fisiologico di cellule circolanti del sangue in condizioni di omeostasi e intervengono come compenso in situazioni in cui la perdita/distruzione, o le richieste da parte dell’organismo, sono aumentate

proteine della matrice/ recettori sinusoidi midollari maturazione CLP CMP citochine prodotte in loco citochine prodotte distalmente stimolatorie inibenti HSC cellule dello stroma osteoblasti SCF/cKit Notch/Jagged proteine della matrice/ recettori

OSTEOBLASTI  LT-HSCs

CELLULE STAMINALI ELEMENTI MATURI PROGENITORI PRECURSORI NUMERO DI CELLULE ATTIVITA’ MITOTICA PLASTICITA’ FUNZIONALE SPECIALIZZAZIONE FUNZIONALE

NK Pre-T Pro-T CLP DC Pro-B Pre-B B/M LT-HSC ST-HSC MPP GMP CMP DC IL-7R+ c-mpl- B/M LT-HSC ST-HSC MPP CFU-M IL-7R- c-mpl+ CFU-G Epo-R- GMP CMP DC BFU-E CFU-E Epo-R+ MEP CFU-Meg

HSC differenziazione/ automantenimento differenziazione apoptosi quiescenza espansione

Cellule CD34+ Proteina transmembrana Funzione non nota (adesione?) 1-2% nel midollo 0.05% nel sangue periferico 0.3-0.5% nel sangue cordonale 0.5-3% nel sangue periferico mobilizzato >> in condizioni patologiche (IM) LTR dopo terapia mieloablativa Proteina transmembrana Funzione non nota (adesione?) 105-120 kD Altamente glicosilata 3 epitopi diversi (mAb di tre classi) Varianti molecolari

IN VIVO IN VITRO CFU-GM CFU-G CFU-M BFU-E CFU-E CFU-GEMM CFU-Mk 16-14 gg 14 gg 7 gg

REGOLAZIONE DELL’EMOPOIESI : Controllo estrinseco Controllo intrinseco

IL-2 IL-7 IL-6 IL-11 SCF... IL-7, -4 GM-CSF G-CSF TPO EPO IL-3 SCF

Dorshkind K, 2002

FISIOLOGIA DELLA ERITROPOIESI

DISTINCT STAGES OF ERYTHROPOIESIS DURING DEVELOPMENT PRIMITIVE EMBRYONIC DEFINITIVE ADULT E 9.5 E 12.5 Yolk sac E7.5 to E11 Liver E9.5 to newborn Bone Marrow E15 on nucleated -globins EPO-indep anucleated A-globins EPO-dep Shimizu R, 2001; Zang H, 2001

Glycophorin A - Spectrin HSC CMP MEP Pro- Erythroblast Orthochromatic Erythroblast BFU-E CFU-E Basophilic Erythroblast Polychromatic Erythroblast Reticulocyte cycling 10-20% 60-80% CD34 ++ - CD33 + - cKIT ++ - CD36 ± + CD41 + - EPOR + ++ GPA - ++ TNFR + ++ Transferrin Receptor CA I – Glycophorin C Glycophorin A - Spectrin Band 3 + band 4.1 + ankyrin

REGOLAZIONE DELL’ERITROPOIESI : Controllo estrinseco Controllo intrinseco Controllo estrinseco

ERYTHROPOIETIN: A classic negative feedback control system

CONDIZIONI CLINICHE ASSOCIATE A LIVELLI INADEGUATI DI EPO Anemia della IRC Malattia neoplastica (indipendentemente dal trattamento) Trapianto allogenico di midollo osseo Sindromi mielodisplastiche Mieloma multiplo In corso di chemioterapia (cisplatino, …..) Malattie infiammatorie e autoimmuni croniche Anemia falciforme Anemia del prematuro Anemia in corso di AIDS Nei gravi stati di malnutrizione

PRODUZIONE DI EPO INADEGUATA 100 ° IRC ° Art. Reum. 80 ° MM ° HIV 60 RISPOSTE ALLA EPO (% dei casi) ° An. Neoplasie 40 ° MDS/IMF 20 Complessità dei meccanismi operanti 20 40 60 80 100 PRODUZIONE DI EPO INADEGUATA (% dei casi) Goodnoug LT et al, 2000

EpoR: Redundant role Obligatory role 7-9gg 3 gg IL-3, SCF, GM-CSF HSC CFU-GEMM BFU-E CFU-E RBC 7-9gg 3 gg

I Progenitori Eritroidi L’insieme degli eritrociti circolanti e dei loro precursori a livello midollare costituiscono un’unità funzionale nota con il termine di ERITRONE, vero e proprio organo, la cui crescita e maturazione è regolata principalmente, dai livelli di ERITROPOIETINA. A livello midollare i precursori eritroidi sono ben riconoscibili a per le loro caratteristiche morfologiche e si distinguono in: PROERITROBLASTO ERITR. basofilo ERITR. policromatofilo ERITR. ortocromatico

La serie ERITROIDE Durante gli stadi differenziativi si assiste a Progressiva riduzione delle dimensioni cellulari Riduzione della basofilia citoplasmatica Progressiva riduzione volumetrica del nucleo e incremento dell’addensamento cromatinico perdita del nucleo La durata del processo maturativo è di 7-8 giorni e la vita in circolo del globulo rosso è di 120 giorni

Conteggio automatico degli eritroblasti e dei reticolociti I moderni contaglobuli, oltre al conteggio dei globuli rossi e dei loro parametri, ci forniscono anche il conteggio di reticolociti ed eritroblasti. Gli eritroblasti vengono segnalati fra i dati strumentali della formula leucocitaria. Vengono refertati dal laboratorio solo previa verifica al microscopio dello striscio di sangue. Sono forniti dai contaglobuli richiedendone uno specifico conteggio.

Presenza degli Eritroblasti nel sangue periferico Periodo neonatale Condizioni patologiche da valutare anche nel contesto di altre modificazioni quali- e quantitative dell’emocromo

Eritroblasti nel sangue periferico Anemie di vario tipo ( talassemie, anemie emolitiche da cause intra ed extraglobulari ), caratterizzate da risposta dell’eritrone allo stimolo ipossico . Malattie mieloproliferative, metastasi midollari, per il sovvertimento della barriera midollare operata dalla popolazione cellulare proliferante.

Reticolociti Il Reticolocito è un giovane eritrocito che si forma dall’Eritroblasto ortocromatico per perdita del nucleo. Il citoplasma è policromatico, in quanto non ha ancora completato il suo corredo emoglobinico e presenta una quota residua di RNA, che viene evidenziata da alcuni coloranti vitali sotto forma di granuli o di un fine reticolo.

Reticolociti Maturano per 24-48 ore nel midollo e passano poi nel circolo periferico ove mantengono le loro caratteristiche per altre 24 ore, costituendo l’1 % del totale dei GR. La maturazione dei Reticolociti porta alla formazione dei GR maturi attraverso: l’acquisizione della forma biconcava la perdita degli organuli e del contenuto di RNA la riduzione del volume cellulare (~ 20%)

RETICOLOCITI RET % = n° reticolociti / 100 GR VN = 0.5 – 2.0 Sono utili per lo studio delle anemie L’aumento rispecchia l’incremento dell’eritropoiesi La diminuzione accompagna situazioni di ipo-aplasia midollare blocco maturativo (eritropoiesi inefficace)

IRF - Immature Reticulocytes Fraction Aumenta precocemente nei periodi di intensa stimolazione eritropoietica: periodo post-emorragia risposta alla terapia in corso di anemie carenziali risposta alla r-Hu-EPO trapianto di midollo E’ considerato l’indicatore più precoce e sensibile dell’attecchimento nel trapianto di midollo, non risentendo, come nel caso del conteggio dei neutrofili, di altri fattori interferenti, quali la presenza di infezioni cliniche o subcliniche.

Variazioni quantitative degli Eritrociti Vengono valutate attraverso i parametri quantitativi forniti dell’emocromo RBC Donna 4.0 - 5.0 Uomo 4.5 - 6.1 Hb Donna 12 - 15.5 Uomo 13 - 17.5 Hct Donna 36 - 45 Uomo 42 - 50

VARIAZIONI QUANTITATIVE Hb - RBC RBC, HB  ERITROCITOSI HB  ANEMIE ERITROCITOSI Hb > 18 mg/dl ANEMIA Hb < 12.5 mg/dl uomo Hb < 11.5 mg/dl donna Il numero dei GR non si riduce in tutte le condizioni anemiche, ma può risultare normale, o talora anche aumentato, nelle condizioni microcitemiche.

Parametri Eritrocitari MCV - MCH MCV (80-95 fl ) è calcolato dall’istogramma dei RBC; è il parametro che fornisce le maggiori indicazioni cliniche MCH rappresenta la quantità di emoglobina di un globulo rosso (27-33 pg ); le sue variazioni sono consensuali a quelle dell’MCV, pertanto le attuali linee guida ne propongono la eliminazione dal referto ematologico. MCH = Hb / n° GR

MCHC MCHC = Hb x 100 / Ht VN = 33 - 35 Bassi valori sono indice di ipocromia. Elevati valori si riscontano in casi di grave disidratazione. Non aumenta in tutte le condizioni di ipercromia. E’ il parametro che ci permette di riconoscere le agglutinazioni eritrocitarie (Crioagglutinine).

RDW ( Red Distribution Wight ) RDW = k. SD / MCV 1 Permette di valutare l’ANISOCITOSI Aumenti spiccati per presenza di due popolazioni eritrocitarie, una normocitica e una micro- o macrocitica (fasi di instaurazione e di correzione delle anemie carenziali).

Variazioni qualitative degli eritrociti Si possono stimare solo con l’osservazione al microscopio di uno striscio di sangue. Sono utili nell’inquadramento delle anemie, poiché riflettono particolari stati patologici. Affinità tintoriale forma grandezza inclusioni

Variazioni qualitative degli eritrociti: Affinità tintoriale ipocromici - per riduzione del contenuto di Hb policromasici - con un’affinità tintoriale intermedia fra la basofilia e l’acidofilia (tipica dei reticolociti). Ipercromici - sferociti Per Anisocromia si intende la presenza, nello striscio di sangue, di globuli rossi con diversa affinità tintoriale (es. anemia da carenza di ferro e di acido folico)

Variazioni di forma: Poichilocitosi Presenza nello striscio di sangue di cellule di forma variabile, spesso bizzarra.

Variazioni fisiologiche di forma Stomatociti Sferociti Sferociti echinociti In condizioni fisiologiche i GR possono andare incontro a due modificazioni distinte e reversibili: la cosiddetta forma ECHINOCITICA o spiculata (emazie spiculate con proiezioni citoplasmatiche corte a distribuazione regolare) e quella STOMATOCITICA ( a scodella con riduzione della concavità centrale ). I fattori che influenzano queste modificazioni sono: il pH del microambiente (alcalino per gli echinociti e acido per la forma stomatocitica), la deplezione di ATP, la presenza di ioni Calcio e l’esposizione ad alcune sostanze chimiche. Il persistere della noxa può portare ad ulteriori deformazioni degli eritrociti e condurre alla forma SFEROCITICA che rappresenta una condizione irreversibile dell’eritrocito. Gli sferociti, in qualità di elementi scarsamente deformabili, mal si adattano alle sinuosità della rete circolatoria e vengono facilmente intrappolati in siti di rimozione, quali la milza, dove vengono distrutti ad opera dei macrofagi

Stomatociti Stomatocitosi ereditaria (oltre il 50% delle emazie sono stomatociti) Malattie emolitiche con alterata permeabilità di membrana epatopatie striscio di sangue inadeguato

Sferociti Emazie sferiche più intensamente colorate in quanto, a causa della perdita della forma biconcava, hanno perso il pallore centrale. Sono presenti nella sferocitosi ereditaria e nelle forme emolitiche.

Sferocitosi Ereditaria Il difetto primitivo sembra legato a un deficit di sintesi o di struttura della Spectrina e in alcuni casi dell’Anchirina. Le alterazioni genetiche responsabili sono eterogenee e determinano una variabile severità delle manifestazioni cliniche. L’aumento franco dei reticolociti, tipico di questa condizione, maschera l’entità della riduzione del Volume globulare, che perciò si presenta solo modestamente diminuito.

Ellissociti Eritrociti che mostrano una progressiva deformazione da cellule ovali (ovalociti) a cellule con veri aspetti ellissocitici (emazie a sigaro). Sono tipici dell’ Ellissocitosi Ereditaria, in cui oltre il 50-90% dei GR possono presentare morfologia ellittica Si possono trovare anche nei soggetti normali (10-15%) e in misura maggiore (anche fino al 25%) nell’ anemia sideropenica, nelle talassemie e in altre emoglobinopatie.

Ellissocitosi Ereditaria Il difetto genetico, alla base di questa condizione, è eterogeneo e legato ad alterazioni della spectrina, che rendono il GR incapace di riassumere la forma biconcava dopo ripetuti passaggi nel circolo capillare. Dal punto di vista clinico è spesso asintomatica e perciò rilevata casualmente durante l’osservazione dello striscio di sangue periferico Nelle forme conclamate può dare un quadro sovrapponibile a quello della sferocitosi ereditaria.

Acantociti o cellule spinose Si ritrovano in svariate condizioni patologiche quali: abetalipoproteinemia epatopatia alcolica splenectomia somministrazione di eparina come artefatto tecnico, nel soggetto normale Nel paziente uremico e nell’IRC i margini cellulari, ellissoidali e dentellati, conferiscono al globuli rossi un aspetto a “foglia di quercia”.

Leptociti Codociti Sono GR più sottili Sono cellule a bersaglio, o a campana Compaiono nelle anemie ipocromiche: talassemie, emoglobinopatie, anemia sideropenica

Dacriociti o emazie a goccia, o a lacrima Sono allungati ad una estremità per un danno subito dalla membrana nel passare attraverso la milza. Sono tipici della MIELOFIBROSI. Si osservano anche nella talassemia, nelle anemie a Corpi di Heinz e nelle metastasi midollari. Indicano la necessità di ulteriori approfondimenti diagnostici.

Drepanociti Sono tipici della emoglobinopatia di tipo S e delle sue associazioni con la talassemia e l’HbC. I GR assumono permanentemente la forma a falce, o a L, o a S in seguito alla cristallizzazione dell’Hb S in filamenti che deformano il GR. Dal punto di vista tintoriale si presentano più scure del normale.

Cheratociti Schistociti Derivano dalla frammentazione dei globuli rossi, per traumi subiti nel microcircolo. Si ritrovano in corso di aumentata emolisi per cause meccaniche: Malattie microangiopatiche CID, Porpora Trombotica Trombocitopenica, protesi valvolari cardiache.

Inclusioni Eritrocitarie: Corpi di Howell-Jolly Frammenti sferici di 0.5-1.0 μm di diametro, costituiti da cromatina. Di solito se ne trova uno per cellula. Sono destinati ad essere espulsi dall’emazia al passaggio nella milza. Si osservano in corso di anemia megaloblastica, anemia falciforme, splenectomia, mielofibrosi e rappresentano un segno di aumentata rigenerazione .

Inclusioni Eritrocitarie Corpi di Heinz Anelli di Cabot Formazione rotondeggiante, per lo più unica, disposta alla periferia dell’emazia, composta da Hb denaturatasi in conseguenza di deficit enzimatico o derivata da Hb instabili. Filamenti sottili di forma rotonda, probabilmente residui del fuso mitotico. Si riscontrano in condizioni mieloproliferative con esaltata eritropoiesi (es. mielofibrosi)

Inclusioni Eritrocitarie Punteggiatura basofila Inclusioni basofile puntiformi, corrispondenti a precipitati ribosomiali. Interessano i GR giovani Sono utili nella diagnosi differenziale delle affezioni ipopromiche e microcitiche, in quanto la loro presenza esclude la carenza marziale. Alterazioni della sintesi emoglobinica Intossicazione da piombo

Anemie MACROCITICHE NORMOCITICHE MICROCITICHE Hb < 12.5 gr/dl uomo Hb < 11.5 g/dl donna in età fertile MCV - è il parametro di primo orientamento MACROCITICHE NORMOCITICHE MICROCITICHE

Macrocitosi MCV > 95 fL Periodo neonatale Anemia da alterata della sintesi di DNA che comporta il ritardato raggiungimento del quantitativo di acido nucleico necessario alla replicazione cellulare, mentre il citoplasma, non condizionato aumenta di dimensioni, generando così una condizione di asincronismo maturativo nucleo-citoplasmatico. Gli aumenti più marcati del volume globulare sono tipici delle anemie megaloblastiche, nelle quali l’MCV è uguale o maggiore di 120.

Megalociti Hanno diametro > 8,5 μm Hanno tendenza alla forma ovalare. Sono accompagnati da anisocitosi del quadro ematico.

Anemia megaloblastica L’osservazione al microscopio dello striscio di sangue permette di osservare i due segni caratteristici e patognomonici delle anemie megaloblastiche: la macro-ovalocitosi e l’ipersegmentazione del nucleo dei gr.neutrofili. A carico della serie rossa può essere presente un certo grado di anisopoichilocitosi con corpi di Iolly ed eritroblasti circolanti. Nonostante l’iperplasia eritrocitaria midollare tipica di queste forme, l’eritropoiesi inefficace fa sì che il conteggio reticolocitario non risulti aumentato.

Esami di Laboratorio nelle Macrocitosi I test utili per l’inquadramento diagnostico delle macrocitosi comprendono i dosaggi di: Reticolociti Ac.folico Vit. B12 LDH bilirubina indiretta B.O.M. Il primo test d’orientamento è il conteggio reticolocitario.

Inquadramento diagnostico delle Macrocitosi Di fronte a una anemia normocromica e normo-macrocitica con riduzione dei reticolociti l’orientamento diagnostico sarà verso un’anemia da eritropoiesi inefficace o da ridotta eritroblastogenesi. Prima di iniziare qualunque terapia, occorre dosare Vit.B12 e ac. Folico per fare diagnosi differenziale. Nei casi non carenziali è utile l’esecuzione della BOM, che mostrerà un quadro ipo-aplastico in caso di anemia da ridotta produzione midollare, o un quadro iper-displastico in caso di anemie da eritropoiesi inefficace. Di fronte a una anemia normocromica e normo-macrocitica con un marcato aumento dei reticolociti l’orientamento diagnostico sarà verso un’anemia da aumentata distruzione periferica, quando è possibile escludere un difetto dell’emoglobinosintesi e della produzione degli eritrociti.

Anemie emolitiche Reticolociti  Emivita GR  Striscio periferico: sferociti, emazie basofile, eritroblasti

Anemie Emolitiche Anemie emolitiche da cause intra-globulari alterazioni delle proteine strutturali (Sferocitosi, Ellissocitosi, Stomatocitosi) alterazioni della molecola emoglobinica (Hb instabili: S, C) deficit enzimatici (PK, G-6P-DH), alterazioni di membrana (EPN) Anemie emolitiche da cause extra-globulari anemie emolitiche autoimmuni, anemie emolitiche da cause meccaniche (microangiopatiche, da protesi valvolari)

Microcitemie MCV < 80 fL Durante il ciclo replicativo, la crescita citoplasmatica e la scarsa concentrazione emoglobinica, consentono una divisione mitotica in più, dando luogo a cellule più piccole.

Condizioni fisiologiche e patologiche caratterizzate da Microcitemia Età pediatrica Carenza di ferro Emoglobinopatie (talassemie, Hb instabili, HbC, HbE) Anemie sideroblastiche acquisite (saturnismo, carenza di vitamina B 6, farmaci interferenti col metabolismo dell’eme) Anemia delle malattie croniche (spesso normocitica) Policitemie trattate con salassoterapia Anemia da carenza proteica (proteine < 4.0 g/dl)

Parametri di primo orientamento nelle Microcitemie Diagnosi differenziale fra Sideropenia e ß-Talassemia Parametri dell’emocromo di primo orientamento:

Gli esami di Laboratorio nelle MICROCITEMIE Ferro, Ferritina, Saturazione TRF Hb elettroforesi L’esame dello striscio di sangue non è diagnostico Le alterazioni morfologiche, poichilocitosi, anisocitosi e ipocromia, non sono specifiche ed aumentano in relazione alla gravità dell’anemia

A. Sideropenica A. Sideropenica grave Talassemia maior Talassemia minor

Inquadramento diagnostico delle Microcitemie

Anemie Normocitiche A. post-emorragica A. emolitiche A. aplastica A. mieloftisica A. Malattie croniche (talora lievemente microcitica) A. Disordini endocrini (talora microcitica)