Panorama sulle principali tecniche analitiche STRUMENTALI

Presentazione sul tema: "Panorama sulle principali tecniche analitiche STRUMENTALI"— Transcript della presentazione:

1 Panorama sulle principali tecniche analitiche STRUMENTALI
Estratto da un lavoro fatto dall’università del Piemonte nell’ambito del progetto «Ambiente» del 2005 L’utilizzo è al solo scopo didattico»

2 Valutazione di una tecnica analitica
Accuratezza  capacità di determinare il valore vero Precisione  capacità di replicare le misure Sensibilità  capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicine Limite di rivelabilità  concentrazione minima di analita che può essere rivelata Range dinamico lineare  range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineare Concentrazione Segnale Selettività  capacità di distinguere tra due analiti Effetti matrice  effetti di altre componenti del campione sulla risposta analitica

3 Tecniche analitiche Tecniche cromatografiche Tecniche spettroscopiche

4 Tecniche cromatografiche
In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC) In base al meccanismo di separazione Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico Esclusione Affinità

5 Schema delle tecniche Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

6 Tecniche cromatografiche
analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici  Gascromatografia analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica

7 Gascromatografia Gas-liquido supporto inerte solido
liquido non volatile, legato covalentemente meccanismo di ripartizione moltissime applicazioni Gas-solido fasi stazionarie di silice, allumina o carbone meccanismo di adsorbimento adatta per la separazione di gas permanenti (H2, He, Ar, O2, N2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione

8 Schema di un GC

9 Colonne per gascromatografia
Colonne impaccate contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida Colonne capillari WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

10 Confronto tra colonne impaccate e capillari
Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

11 Rivelatori per GC a conducibilità termica (TCD)
a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di elettroni (ECD) a conducibilità elettrolitica (ELCD) amperometrico per lo zolfo (ASD) termoionico (TID o NPD) fotometrico a fiamma (FPD) a fotoionizzazione (PID) ad emissione atomica (AED) a chemiluminescenza spettrometria di massa (MS) Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici (AED, ASD). Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa Un aspetto da considerare nella scelta del rivelatore è verificare se è distruttivo o no: nel secondo caso può essere interessante mettere in serie più rivelatori (es. TCD e MS)

12 Rivelatore a conducibilità termica
si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H2 ed He si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto la sensibilità è una delle peggiori è un sistema non distruttivo Campione Riferimento

13 Rivelatore a ionizzazione di fiamma
si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) non risponde a molecole volatili non infiammabili la sensibilità è buona è un sistema distruttivo

14 Rivelatore a cattura di elettroni
si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti all’uscita della colonna è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc.) la sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3H o 63Ni la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati è un sistema non distruttivo

15 Rivelatore a conducibilità elettrolitica
si misura la conducibilità elettrolitica modificata da composti derivati dagli analiti per combustione è un rivelatore alogeno-specifico (pesticidi clorurati, solventi alogenati, PCB, diossine) ma può rivelare anche composti di N ed S la sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i composti di N ed S è un sistema distruttivo

16 Rivelatore amperometrico per S
le sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente formando H2S che viene rivelato in una cella elettrochimica per ossidazione in-situ specifico per composti di S è un sistema distruttivo

17 Rivelatore termoionico
è specifico per composti contenenti azoto e fosforo (per questo è chiamato anche NPD) basato sulla formazione di radicali a partire da composti di N e P è un sistema distruttivo

18 Rivelatore fotometrico a fiamma
è specifico per composti contenenti zolfo e fosforo si misura l’emissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per P è un sistema distruttivo

19 Rivelatore a fotoionizzazione di fiamma
si impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misurata selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti eteroatomi (come organozolfo od organofosforo) è un sistema praticamente non distruttivo, in quanto la frazione di analita ionizzato è bassa

20 Rivelatore a emissione atomica
rivelatore specifico per elementi, vantaggioso per l’analisi di miscele complesse basato sull’emissione ottica di atomi formatisi in un plasma di elio a microonde è un sistema distruttivo

21 Rivelatore a chemiluminescenza
analogo come principio all’AED, ma la chemiluminescenza è emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomi le bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da interpretare la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla fluorescenza (l’eccitazione è prodotta per via chimica, non spettroscopica) limitato a composti che possono dare reazioni chemiluminescenti (composti di N ed S soprattutto) è un sistema distruttivo (l’analita reagisce con un composto)

22 Rivelatore a spettrometria di massa
accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenza è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali è un sistema distruttivo

23 Scelta del rivelatore La selezione è basata su:
natura chimica degli analiti potenziali interferenze limite di rivelabilità richiesto disponibilità e/o costo

24 Confronto tra rivelatori
Rivelatore Target LOD Range lineare TCD non selettivo 1 ng 106 FID idrocarburi 100 pg 107 ECD alogeni 50 fg Cl 104 ELCD composti di N, S, Cl 1 pg ASD composti di S 10 ppb S NPD composti di N, P 10 pg FPD composti di S, P 103 PID idrocarburi aromatici, eterocomposti 2 pg benzene AED elementi 0.1 – 20 pg/s Chem composti di N, S MS specie 10 ng (SCAN), pg (SIM) 105

25 Cromatografia liquida

26 Schema di un HPLC

27 Selezione della tecnica HPLC

28 Selezione della tecnica IC

29 Eluizione isocratica o in gradiente
isocratica isocratica gradiente (più forte) (meno forte)

30 Rivelatori per HPLC Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti Solute properties: si misura una caratteristica del soluto Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) Spettrofotometrico IR Fluorimetrico Indice di rifrazione (RID) Elettrochimico (ED) Spettrometria di massa (MS)

31 Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile
il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) basato sull’assorbimento di luce nel range UV-visibile sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) sensibilità tipica: 0.1 ppb è un sistema non distruttivo

32 Gruppi cromofori Cromoforo Formula lmax (nm) e aldeide -CHO 210 1.500
amino -NH2 195 2.800 azo -N=N- 3-25 bromuro -Br 208 300 carbossile -COOH 50-70 chetone -C=O 1.000 disolfuro -S-S- 194 5.500 estere -COOR 205 50 etere -O- 185 etilene -C=C- 190 6.000 fenile -C6H5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO2 270 12 nitrito -ONO nitrile -C=N 160 - nitro -NO2 forte

33 Scelta della lunghezza d’onda
La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: massimizzare sensibilità e specificità il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm) controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV operando sotto la lcutoff può: ridurre la sensibilità introdurre rumore sulla linea di base

34 Rivelatore Diode-array
misura in ogni istante lo spettro UV-visibile dell’eluato nell’intervallo desiderato può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)

35 Rivelatore spettrofotometrico IR
sensibilità tipica: 1 ppm applicabilità limitata dall’assorbanza della fase mobile nel range spettrale infrarosso

36 Rivelatore a fluorescenza
sensibilità 1000 volte superiore rispetto all’assorbimento UV-visibile sensibilità tipica: 0.01 ppb limitato alla rivelazione di composti fluorescenti, ma è possibile la derivatizzazione è un sistema non distruttivo (tranne che con derivatizzazione)

37 Rivelatore a indice di rifrazione
basato sulla misura del’indice di rifrazione dell’eluato (tipico rivelatore bulk) non adatto con eluizione in gradiente sensibilità tipica: 0. 1 ppm completamente aspecifico necessita di termostatazione accuratissima si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri) è un sistema non distruttivo

38 Rivelatore evaporative light scattering
l’eluato è trasformato in aerosol, desolvatato e mandato in una cella nella quale si misura lo scattering della luce necessita di fasi mobili volatili ideale per composti ad alto PM, zuccheri e acidi non volatili è un sistema distruttivo

39 Rivelatore elettrochimico
tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità amperometrica) possibilità di misura in voltammetria (per applicazioni particolari) amperometria coulometria (raro) conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica) generalmente poco adatto all’eluizione in gradiente

40 Rivelatore elettrochimico: amperometria
basata sulla misura della corrente risultante da un’elettrolisi (ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di un elettrodo il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per alcune applicazioni  dopamina) utilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range di potenziale dell’elettrodo di lavoro impiegato possibile avvelenamento degli elettrodi utilizzo non semplice è un sistema parzialmente distruttivo

41 Rivelatore elettrochimico: conducimetria
basato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni disciolti in un campo elettrico utile per sostanze ioniche o ionizzabili rivelatore più comune in cromatografia ionica sensibilità inferiore rispetto al rivelatore amperometrico utilizzo molto semplice è un sistema non distruttivo

42 Rivelatore a spettrometria di massa
il detector finale: sensibile, selettivo e universale, può permettere la caratterizzazione chimica del campione possibilità di discriminare analiti coeluiti in modalità SIM sensibilità tipica: 0.1 ppb limitato dall’interfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal campione gli analiti devono essere ionizzabili

43 Confronto tra rivelatori
Rivelatore Target LOD Range lineare UV-visibile/ UV-DAD composti che assorbono luce UV-VIS 1 µg/l 104 IR Fluorimetrico composti policondensati (PAH) 10 ng/l 103 RID non selettivo 1 mg/l ELSD ED amperometrico composti elettroattivi 100 pg/l ED conducimetrico composti ionici MS specie 0.1 µg/l 105

44 Cromatografia Fluida Supercritica
si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche fisiche intermedie tra i liquidi e i gas: maggiore densità rispetto ai gas minore viscosità rispetto ai liquidi alto potere solubilizzante Fluidi supercritici impiegati in cromatografia: CO2, Tc = 31°C C2H6, Tc = 32°C N2O, Tc = 37°C

45 Caratteristiche della SFC
è utile in particolare per analizzare composti che non possono essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici): composti non volatili composti termicamente instabili composti non rivelabili con i normali rivelatori per LC la strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita controllo accurato della temperatura fasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizione l’eluato si rivela come gas  rivelatori FID, MS (interfacciamento semplice), TCD, ECD

46 Applicazioni della SFC
separazione di molecole ad alto PM (fino a 105), prodotti naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosivi CO2 supercritico può solubilizzare alcani C5-C40 e PAH separazione di polietileni oligomerici con gradiente di pressione

47 Confronto tra HPLC ed SFC
Separazione di bi- e trifenile con HPLC (sx) ed SFC (dx): la velocità di flusso è maggiore in SFC per cui la separazione è più veloce

48 GC, LC o SFC? Caratteristiche comuni
Efficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono essere quantitative Vantaggi della GC Rapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MS Vantaggi della LC Determinazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie ioniche inorganiche La diffusione longitudinale è trascurabile Vantaggi della SFC caratteristiche intermedie tra GC ed LC

49 Tecniche elettroforetiche
Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene mediante colorazione, per via fotometrica o, nell’elettroforesi capillare, con rivelatori più sofisticati come il fotometrico, l’elettrochimico e lo spettrometro di massa Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)

50 Classificazione delle tecniche
Le tecniche elettroforetiche si classificano in: elettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tampone elettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimero elettroforesi classica (es. separazione delle proteine del siero) elettroforesi capillare

51 Elettroforesi capillare
Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono: Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale le correnti sono inferiori e conseguentemente il calore di Joule è notevolmente più basso con vantaggi analitici evidenti convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al flusso di corrente elettrica, che porta all’allargamento dei picchi difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi

52 Prestazioni dell’elettroforesi capillare
La strumentazione necessaria per l’elettroforesi capillare è costituita da due soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di energia ad alta tensione, un sistema per l’applicazione del campione e un rivelatore Si utilizzano rivelatori UV, UV-DAD, fluorimetrici, elettrochimici e a spettrometria di massa

53 Versioni della CE L’elettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche che hanno caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse. Le tecniche sono: elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE tradizionale elettroforesi capillare a gel: è l’adattamento della tecnica tradizionale di elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo come la poliacrilamide focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettrico isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa velocità cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): l’addizione di sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole neutre (es. fenoli)

54 Vantaggi della CE utilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammi l’efficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N piatti teorici elevatissimo) richiede una quantità minima di campione e di reagenti può essere facilmente automatizzata è applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre tecniche separazione

55 Selezione della tecnica più adatta
Le varie versioni della CE hanno caratteristiche che le rendono più adatte in certe situazioni. Nella tabella sono elencate in ordine di efficienza decrescente per la separazione delle diverse classi di analiti Ioni a basso PM Molecole a basso PM Peptidi Proteine Oligo nucleotidi DNA CZE MECC CGE ITP IEF

56 Applicazioni della CE Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse biologico è carica, la CE ha applicazioni importanti nell’analisi di aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (SEC). In particolare, per l’analisi di proteine e peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un solo aminoacido. Nella figura è mostrata l’analisi di una soluzione di albumina di siero bovino digerita con tripsina

57 Applicazioni della CE Altre applicazioni comprendono la separazione di anioni e cationi inorganici e di composti farmaceutici purchè carichi Separazione con MECC di aminoacidi (sx) e di corticosteroidi (dx)

58 Tecniche spettroscopiche
Interazione tra luce e materia  Tecniche spettroscopiche Informazione qualitativa (elementi, composti) Informazione quantitativa (concentrazione)

59 Lo spettro elettromagnetico
I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla materia analizzata Energia 

60 Classificazione delle tecniche spettroscopiche
In base al meccanismo assorbimento emissione fluorescenza In base alla regione spettrale impiegata raggi g (0.01 Å)  PIGE raggi X (0.01 Å – 100 Å)  XRF, PIXE UV-Visibile (10 nm – 800 nm)  AAS, ICP-AES IR (800 nm – 0.4 mm)  FT-IR microonde (0.4 mm – 0.25 m)  EPR radiofrequenze (> 0.25 m)  NMR In base alla specie interessata atomica molecolare

61 Assorbimento ed emissione di luce
A livello microscopico la luce interagisce con la materia in modalità differenti ma sempre legate a salti tra stati energetici L’assorbimento e l’emissione di luce da parte della materia sono interpretabili come passaggio tra due stati di energia di un atomo o una molecola S1 S0

62 Spettroscopia atomica e molecolare
Spettroscopia atomica: il campione è trasformato in atomi somministrandogli energia  si determinano elementi Spettroscopia molecolare: il campione è analizzato tal quale  si determinano composti

63 Regioni spettrali utilizzate
Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano effetti diversi a seconda dell’energia della radiazione utilizzata: raggi g e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci interni e reazioni nel nucleo raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci esterni raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali microonde e onde radio interessano l’orientazione degli spin elettronici e nucleari

64 Spettroscopia atomica
Il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento Il vapore atomico subisce un interazione con la luce oppure con un campo magnetico; l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa e quantitativa

65 Tecniche atomiche A seconda del tipo di interazione che subisce il vapore atomico, si possono avere le seguenti tecniche di spettroscopia atomica: il vapore è irraggiato con una radiazione monocromatica assorbibile solo dagli atomi di un determinato elemento il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi emettono il surplus di energia sotto forma di radiazione luminosa il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi si trasformano in ioni i quali sono separati e rivelati con uno spettrometro di massa Assorbimento atomico Emissione atomica Spettrometria di massa

66 Spettroscopia atomica: assorbimento
il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento il vapore atomico subisce un’interazione con la luce emessa da una sorgente luminosa (righe) la riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante l’assorbimento di risonanza l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali elementi) identificazione attraverso le  assorbite quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota legge di Lambert-Beer (A = bC)

67 Spettrofotometria AAS

68 Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)
regolazione dei gas comparto della fiamma introduzione del campione combustibile (acetilene) + comburente (aria)  fiamma

69 Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)
cammino ottico aspirazione in continuo segnale dipendente dalla concentrazione e non dalla massa

70 Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)
Elettrotermica (ET): atomizzazione mediante una corrente elettrica ad alta potenza che crea un riscaldamento per effetto Joule

71 Atomizzazione elettrotermica (ETAAS)
il campione (poche decine di µl) viene depositato all’interno di un cilindro di grafite detto fornetto, sottoposto poi a cicli di riscaldamento

72 Fornetti di grafite Il fornetto di grafite ha dimensioni di pochi cm
La tecnica è nota anche come GF-AAS

73 Spettroscopia atomica: emissione
il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento il vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza dell’energia somministratta sotto forma di calore le righe emesse vengono separate e misurate l’entità dell’emissione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali elementi) identificazione attraverso le  emesse quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota intensità propozionale alla concentrazione (I = C)

74 Spettrofotometria AES

75 Emissione atomica a fiamma (FF)
regolazione dei gas comparto della fiamma introduzione del campione utilizzo lo stesso strumento senza sorgente ottica

76 Emissione atomica con plasma (ICP-AES)

77 Spettrofotometria ICP-AES
Pompa peristaltica Nebulizzatore Camera di nebulizzazione Torcia di quarzo Sistema ottico Smaltimento fumi al PC 2 canali: 1 per il campione 1 per lo scarico

78 Spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)

79 Spettrometria ICP-MS

80 Spettrometro di massa e rivelatore
Spettrometria ICP-MS Spettrometro di massa e rivelatore Interfaccia Torcia ICP Introduzione del campione

81 Caratteristiche tecniche
tecniche distruttive ( °C) si determinano elementi si analizzano liquidi, solidi se disciolti analisi totale del campione risultati espressi in concentrazione ottima sensibilità mg/l per FAAS e FF µg/l per GFAAS e ICP-AES ng/l per ICP-MS

82 Confronto tra tecniche

83 Limiti di rivelabilità

84 Spettroscopia molecolare
Il campione è irraggiato con luce avente  nell’UV, nel visibile o nell’infrarosso Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole Le tecniche più comunemente utilizzate sono quelle in assorbimento

85 Spettroscopia molecolare: assorbimento
il campione è irraggiato con luce avente  nell’UV, nel visibile o nell’infrarosso (bande o righe) le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) la risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole l’entità di questa interazione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali composti) identificazione attraverso le  assorbite quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota legge di Lambert-Beer (A = bC)

86 Spettrofotometria IR Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le  assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono l’energia equivalente per vibrare. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Esempio di spettrofotometro IR. Si tratta in genere di strumento molto compatti I campioni liquidi sono analizzati tal quali, mentre per i campioni solidi si prepara una pastiglia di KBr nel quale si disperde il campione polverizzato; è possibile analizzare anche i campioni gassosi

87 IR: modi di vibrazione Alcuni modi di vibrazione sono gli stretching (allungamenti) e i bending (piegamenti) che corrispondono a livelli energetici ben definiti

88 Esempio di spettro IR Il campione è irraggiato con un intervallo di  compreso tra 2.5 e 20 µm (o  compreso tra 4000 e 500 cm-1). Il 100% della scala di trasmittanza corrisponde ad assorbimento nullo

89 Spettrofotometria IR Ogni gruppo funzionale ha modi di vibrazione corrispondenti a  o  ben definite, che ne permettono l’identificazione

90 Impronta digitale L’insieme dei gruppi funzionali identificati permette di risalire globalmente alla molecola, lo spettro IR della quale corrisponde ad un’impronta digitale

91 Spettro IR della formaldeide
H C O L’assegnazione delle bande di assorbimento ai vari modi di vibrazione permette di risalire in modo ancora più accurato alla struttura della molecola

92 Applicazioni IR Esempi di applicazioni della tecnica IR:
caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi caratterizzazione strutturale di intermedi di sintesi monitoraggio di cinetiche di reazione caratterizzazione della purezza di un composto raramente utilizzata per determinazioni quantitative

93 Spettrofotometria UV-visibile
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le  assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Gli spettrofotometri UV-visibile sono molto diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo; quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti nel range strumentale ( nm) Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per HPLC

94 Transizioni elettroniche
La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce, come il gruppo –NO2 (nitro), -N2- (azo), ecc. Solo le transizioni di elettroni n e  hanno energie nel range nm

95 Esempio di spettro UV-visibile
Esempio di spettro UV-visibile di un’aldeide insatura. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm). Le bande di assorbimento registrate sono in numero minore rispetto all’IR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer

96 Tabella dei gruppi cromofori
Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare () Cromoforo Esempio Transizione max (nm)  Solvente C=C Etene   * 171 15.000 Esano 1-Esino 180 10.000 C=O Etanale n  *   * 15 N=O Nitrometano 275 200 17 5.000 Etanolo C-X X = Br X = I Metil bromuro Metil ioduro n  * n  * 205 255 360 esano

97 Applicazioni dell’UV-visibile
caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi monitoraggio di cinetiche di reazione caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto naturale (es. olio, vino) determinazione quantitativa di specie di interesse chimico-clinico o ambientale (A = bC) rivelazione in sistemi cromatografici

98 Caratteristiche tecniche
tecniche distruttive o non distruttive si determinano composti si analizzano liquidi, solidi o gas analisi totale o parziale del campione risultati espressi in concentrazione buona sensibilità (mg/l)

99 Tecniche molecolari: Raman
Il campione è irraggiato con luce monocromatica; le  assorbite, aventi energia minore rispetto alla  irraggiata, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono la differenza di energia per vibrare. A differenza dell’IR, non si misura la luce assorbita ma quella che viene restituita o diffusa dai gruppi funzionali dopo l’assorbimento. La risposta è visibile sotto forma di spettro Spettro Raman di un pigmento

100 Caratteristiche tecniche
tecniche distruttive o non distruttive si determinano composti si analizzano liquidi, solidi o gas possibili analisi in situ analisi totale o parziale del campione risultati espressi in concentrazione buona sensibilità

101 Fluorescenza a raggi X Il campione è colpito con un fascio di raggi X dalla sorgente. Gli elementi presenti localmente vengono eccitati, cioè passano ad uno stato energetico superiore, dal quale decadono istantaneamente emettendo radiazioni X monocromatiche specifiche per ogni elemento L’intensità delle radiazioni emesse è correlabile alla concentrazione degli elementi presenti nel campione nel punto irraggiato La zona irraggiata può essere di mm2

102 Caratteristiche tecniche
tecnica non distruttiva o distruttiva si determinano elementi si analizzano liquidi, solidi possibilità di analisi in situ buona risoluzione spaziale risultati espressi in concentrazione sensibilità discreta

103 Altre tecniche spettroscopiche
Esistono altre tecniche di analisi nelle quali si sfrutta l’interazione della materia con un campo magnetico e/o con una radiazione luminosa Le tecniche principali in questo settore sono due: la spettrometria di massa la risonanza magnetica nucleare o NMR Queste tecniche vengono generalmente considerate tecniche spettroscopiche al pari di quelle descritte in precedenza

104 Spettrometria di massa (MS)
Nella spettrometria di massa le molecole sono trasformate in ioni i quali, attraverso l’interazione con un campo elettromagnetico, sono separati e analizzati per fornire informazioni sul peso molecolare e la struttura della molecola progenitrice

105 Esempio di spettri MS in questo esempio il campione è costituito da H2O. Attraverso la sorgente si possono formare lo ione molecolare (H2O + e-  H2O+ + 2 e-) e i frammenti H+, O+ e OH+ I segnali degli ioni sono riportati assegnando allo ione più abbondante il 100% e mostrando gli altri ioni come percentuale di esso specie massa H2O+ 18 OH+ 17 O+ 16 H+ 1

106 Applicazioni della tecnica MS
Le applicazioni della tecnica MS spaziano in tutti i campi della scienza. In particolare: analisi ambientale (determinazione di composti tossici come diossine, PCB, PAH, ecc.) caratterizzazione di composti di interesse biologico o farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica, principi attivi, ecc.) analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti naturali e sintetici, ecc.) rivelatore per cromatografia, sia GC che LC

107 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)
Questa tecnica analitica è da ormai 50 anni la più utilizzata nel campo della caratterizzazione della struttura di sostanze organiche; ha buone potenzialità anche in campo inorganico Le caratteristiche tecniche dell’NMR ne fanno però uno strumento da ricerca più che da laboratorio, per quanto alcune applicazioni siano entrate nella routine, per esempio nell’ambito del controllo in campo alimentare La tecnica si basa sull’interazione tra atomi aventi numero di spin non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze

108 Nuclei e numeri di spin Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono riportate nella tabella seguente Numero di protoni di neutroni di Spin Esempi pari 12C, 16O, 32S dispari 1/2 1H, 19F, 31P 3/2 11B,35Cl, 79Br 13C 127I 5/2 17O 1 2H, 14N NMR-attivo no si

109 Schema di uno spettrometro NMR

110 Chemical shift: esempi

111 Esempio di spettro 1H NMR
acido dimetilbenzoico

112 Esempio di spettro 13C NMR

113 Tecniche accoppiate Le tecniche accoppiate o ifenate (dall’inglese hyphen che indica il trattino di sillabazione) sono costituite dall’interfacciamento di un sistema separativo ad un sistema di rivelazione spettroscopica Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi: la parte cromatografica produce frazioni pure di analita la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono meno diffuse, es. GC-AES, LC-ICPMS. A parte GC-MS, si tratta normalmente di strumenti disponibili a grandi centri di ricerca

114 Informazioni fornite Le grandi potenzialità delle tecniche ifenate sono legate alle informazioni strutturali che forniscono sul campione spettri di massa determinazione di specie diverse di uno stesso elemento

115 Determinazione di metalli
Combinazioni possibili step di cleanup della matrice step di preconcentrazione possibilità di studi di speciazione

116 Criteri di scelta: separazione
Scelta della fase mobile o del carrier carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri) GC-AFS IEC-(postcolumn-HG)-AFS carrier organico (specie lipofiliche) RP-HPLC-FAAS RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione) RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione) tamponi (specie ioniche e non ioniche) IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 mM) Ion pair-RP-HPLC-ICP-AES rivelatore gassoso secco acquoso organico salino AFS +++ X FAAS ++ + ICP-AES ICP-MS +++ necessario ++ possibile + in condizioni specifiche X non utilizzabile

117 Criteri di scelta: rivelazione
in base agli analiti da determinare As, Se, Hg, Sb  AFS Cu, Zn, Cr  FAAS in base alla concentrazione elementi maggiori  FAAS tracce  AFS, ICP-AES ultratracce  AFS, ICP-MS il rivelatore deve poter funzionare in modalità continua il sistema deve generare segnali transienti

118 Speciazione di elementi volatili
Se, As, Sb, Te, Hg, (Sn) formano idruri volatili  LC-HG-AFS Separazione di composti organoarsenici

119 GC-ICP-MS solo per elementi che formano composti volatili
necessita di derivatizzazione (HG o etilazione) 100 % di campione introdotto nel detector (sensibilità elevata) nessun problema di interfaccia (carrier gassoso!)

120 Speciazione di organometalli
Speciazione di composti organostannici (5 ppb)

121 GC-ICP-AES meno sensibile di GC-ICPMS interfacciamento semplice
produce uno spettro di emissione per ogni analita

122 GC-FTIR può distinguere isomeri strutturali che presentano lo stesso spettro di massa fornisce informazioni sulla struttura molecolare anche in assenza di un esatto riferimento limitazione: librerie povere (poche migliaia di spettri contro spettri in MS), in quanto la maggior parte degli spettri è in fase liquida o solida, ma in fase gas sono diversi

123 CE-ICP-MS richiede un’interfaccia speciale effetti matrice elevati
consumo di campione bassissimo (nL) risoluzione eccellente