Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a.a. 2004-2005 Panorama sulle principali tecniche analitiche.

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1 Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a.a. 2004-2005 Panorama sulle principali tecniche analitiche

2 Valutazione di una tecnica analitica Accuratezza capacità di determinare il valore veroAccuratezza capacità di determinare il valore vero Precisione capacità di replicare le misurePrecisione capacità di replicare le misure Concentrazione Segnale Sensibilità capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicineSensibilità capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicine Limite di rivelabilità concentrazione minima di analita che può essere rivelataLimite di rivelabilità concentrazione minima di analita che può essere rivelata Range dinamico lineare range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineareRange dinamico lineare range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineare Selettività capacità di distinguere tra due analitiSelettività capacità di distinguere tra due analiti Effetti matrice effetti di altre componenti del campione sulla risposta analiticaEffetti matrice effetti di altre componenti del campione sulla risposta analitica

3 Tecniche analitiche Tecniche cromatograficheTecniche cromatograficheTecniche cromatograficheTecniche cromatografiche Tecniche spettroscopicheTecniche spettroscopicheTecniche spettroscopicheTecniche spettroscopiche Tecniche elettrochimicheTecniche elettrochimicheTecniche elettrochimicheTecniche elettrochimiche Tecniche volumetricheTecniche volumetricheTecniche volumetricheTecniche volumetriche Saggi qualitativiSaggi qualitativiSaggi qualitativiSaggi qualitativi

4 Tecniche cromatografiche In base alla forma del letto cromatograficoIn base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC)Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC)Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC)Cromatografia fluida supercritica (SFC) In base al meccanismo di separazione In base al meccanismo di separazione AdsorbimentoAdsorbimento RipartizioneRipartizione Scambio ionicoScambio ionico EsclusioneEsclusione AffinitàAffinità

5 Schema delle tecniche Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

6 Tecniche cromatografiche analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionicianaliti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici Gascromatografia analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabilianaliti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida Cromatografia liquida analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LCanaliti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica Cromatografia fluida supercritica

7 Gascromatografia Gas-liquidoGas-liquido supporto inerte solidosupporto inerte solido liquido non volatile, legato covalentementeliquido non volatile, legato covalentemente meccanismo di ripartizionemeccanismo di ripartizione moltissime applicazionimoltissime applicazioni Gas-solidoGas-solido fasi stazionarie di silice, allumina o carbonefasi stazionarie di silice, allumina o carbone meccanismo di adsorbimentomeccanismo di adsorbimento adatta per la separazione di gas permanenti (H 2, He, Ar, O 2, N 2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizioneadatta per la separazione di gas permanenti (H 2, He, Ar, O 2, N 2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione

8 Schema di un GC

9 Colonne per gascromatografia Colonne impaccateColonne impaccate contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquidacontengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida Colonne capillari Colonne capillari WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficieWCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimicaSCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimentoPLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

10 Confronto tra colonne impaccate e capillari Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

11 Rivelatori per GC a conducibilità termica (TCD)a conducibilità termica (TCD) a ionizzazione di fiamma (FID)a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di elettroni (ECD)a cattura di elettroni (ECD) a conducibilità elettrolitica (ELCD)a conducibilità elettrolitica (ELCD) amperometrico per lo zolfo (ASD)amperometrico per lo zolfo (ASD) termoionico (TID o NPD)termoionico (TID o NPD) fotometrico a fiamma (FPD)fotometrico a fiamma (FPD) a fotoionizzazione (PID)a fotoionizzazione (PID) ad emissione atomica (AED)ad emissione atomica (AED) a chemiluminescenzaa chemiluminescenza spettrometria di massa (MS)spettrometria di massa (MS) Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici (AED, ASD). Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso limpiego del rivelatore a spettrometria di massa Un aspetto da considerare nella scelta del rivelatore è verificare se è distruttivo o no: nel secondo caso può essere interessante mettere in serie più rivelatori (es. TCD e MS)

12 Rivelatore a conducibilità termica si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H 2 ed Hesi misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H 2 ed He si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di compostosi tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto la sensibilità è una delle peggiorila sensibilità è una delle peggiori è un sistema non distruttivoè un sistema non distruttivo CampioneRiferimento

13 Rivelatore a ionizzazione di fiamma si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettricosi misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato)è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) non risponde a molecole volatili non infiammabilinon risponde a molecole volatili non infiammabili la sensibilità è buonala sensibilità è buona è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

14 Rivelatore a cattura di elettroni si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti alluscita della colonnasi misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti alluscita della colonna è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc.)è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc.) la sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3 H o 63 Nila sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3 H o 63 Ni la sensibilità è ottima per gli idrocarburi cloruratila sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati è un sistema non distruttivoè un sistema non distruttivo

15 Rivelatore a conducibilità elettrolitica si misura la conducibilità elettrolitica modificata da composti derivati dagli analiti per combustionesi misura la conducibilità elettrolitica modificata da composti derivati dagli analiti per combustione è un rivelatore alogeno- specifico (pesticidi clorurati, solventi alogenati, PCB, diossine) ma può rivelare anche composti di N ed Sè un rivelatore alogeno- specifico (pesticidi clorurati, solventi alogenati, PCB, diossine) ma può rivelare anche composti di N ed S la sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i composti di N ed Sla sensibilità è eccellente per i composti clorurati, ottima per i composti di N ed S è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

16 Rivelatore amperometrico per S le sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente formando H 2 S che viene rivelato in una cella elettrochimica per ossidazione in-situle sostanze separate sono combuste in atmosfera riducente formando H 2 S che viene rivelato in una cella elettrochimica per ossidazione in-situ specifico per composti di Sspecifico per composti di S è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

17 Rivelatore termoionico è specifico per composti contenenti azoto e fosforo (per questo è chiamato anche NPD)è specifico per composti contenenti azoto e fosforo (per questo è chiamato anche NPD) basato sulla formazione di radicali a partire da composti di N e Pbasato sulla formazione di radicali a partire da composti di N e P è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

18 Rivelatore fotometrico a fiamma è specifico per composti contenenti zolfo e fosforoè specifico per composti contenenti zolfo e fosforo si misura lemissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per Psi misura lemissione ottica a 394 nm per S e 526 nm per P è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

19 Rivelatore a fotoionizzazione di fiamma si impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misuratasi impiega luce UV per ionizzare gli analiti che escono dalla colonna; gli ioni così prodotti generano una corrente misurata selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti eteroatomi (come organozolfo od organofosforo)selettivo per idrocarburi aromatici e composti contenenti eteroatomi (come organozolfo od organofosforo) è un sistema praticamente non distruttivo, in quanto la frazione di analita ionizzato è bassaè un sistema praticamente non distruttivo, in quanto la frazione di analita ionizzato è bassa

20 Rivelatore a emissione atomica rivelatore specifico per elementi, vantaggioso per lanalisi di miscele complesserivelatore specifico per elementi, vantaggioso per lanalisi di miscele complesse basato sullemissione ottica di atomi formatisi in un plasma di elio a microondebasato sullemissione ottica di atomi formatisi in un plasma di elio a microonde è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

21 Rivelatore a chemiluminescenza analogo come principio allAED, ma la chemiluminescenza è emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomianalogo come principio allAED, ma la chemiluminescenza è emessa da molecole eccitate piuttosto che da atomi le bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da interpretarele bande di luce emessa sono più ampie e più difficili da interpretare la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla fluorescenza (leccitazione è prodotta per via chimica, non spettroscopica)la radiazione di fondo è bassissima, analogamente alla fluorescenza (leccitazione è prodotta per via chimica, non spettroscopica) limitato a composti che possono dare reazioni chemiluminescenti (composti di N ed S soprattutto)limitato a composti che possono dare reazioni chemiluminescenti (composti di N ed S soprattutto) è un sistema distruttivo (lanalita reagisce con un composto)è un sistema distruttivo (lanalita reagisce con un composto)

22 Rivelatore a spettrometria di massa accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenzaaccoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenza è lunico rivelatore che fornisce informazioni strutturaliè lunico rivelatore che fornisce informazioni strutturali è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

23 Scelta del rivelatore La selezione è basata su: natura chimica degli analiti potenziali interferenze limite di rivelabilità richiesto disponibilità e/o costo

24 Confronto tra rivelatori RivelatoreTargetLOD Range lineare TCD non selettivo 1 ng 10 6 FIDidrocarburi 100 pg 10 7 ECDalogeni 50 fg Cl 10 4 ELCD composti di N, S, Cl 1 pg 10 4 - 10 6 ASD composti di S 10 ppb S 10 4 NPD composti di N, P 10 pg 10 4 FPD composti di S, P 100 pg 10 3 PID idrocarburi aromatici, eterocomposti 2 pg benzene 10 7 AEDelementi 0.1 – 20 pg/s 10 4 Chem composti di N, S 10 pg 10 4 MSspecie 10 ng (SCAN), 10 pg (SIM) 10 5

25 Cromatografia liquida

26 Schema di un HPLC

27 Selezione della tecnica HPLC

28 Selezione della tecnica IC

29 Eluizione isocratica o in gradiente isocratica isocratica gradiente isocratica isocratica gradiente (più forte) (meno forte) (più forte) (meno forte)

30 Rivelatori per HPLC Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analitiBulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti Solute properties: si misura una caratteristica del solutoSolute properties: si misura una caratteristica del soluto Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) Spettrofotometrico IRSpettrofotometrico IR FluorimetricoFluorimetrico Indice di rifrazione (RID)Indice di rifrazione (RID) Elettrochimico (ED)Elettrochimico (ED) Spettrometria di massa (MS)Spettrometria di massa (MS)

31 Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione)il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) basato sullassorbimento di luce nel range UV- visibilebasato sullassorbimento di luce nel range UV- visibile sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm)sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) sensibilità tipica: 0.1 ppbsensibilità tipica: 0.1 ppb è un sistema non distruttivoè un sistema non distruttivo

32 Gruppi cromofori CromoforoFormula max (nm) max (nm) aldeide-CHO2101.500 amino -NH 2 1952.800 azo-N=N-285-4003-25 bromuro-Br208300 carbossile-COOH200-21050-70 chetone-C=O1951.000 disolfuro-S-S-1945.500 estere-COOR20550 etere-O-1851.000 etilene-C=C-1906.000 fenile -C 6 H 5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO 2 27012 nitrito-ONO220-2301.000-2.000 nitrile-C=N160- nitro -NO 2 210forte

33 Scelta della lunghezza donda La del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: massimizzare sensibilità e specificitàmassimizzare sensibilità e specificità il solvente della fase mobile può causare shifts in max (2-5 nm)il solvente della fase mobile può causare shifts in max (2-5 nm) controllare lassorbanza degli analiti nella fase mobilecontrollare lassorbanza degli analiti nella fase mobile i solventi per fase mobile hanno cutoff nellUVi solventi per fase mobile hanno cutoff nellUV operando sotto la cutoff può:operando sotto la cutoff può: ridurre la sensibilitàridurre la sensibilità introdurre rumore sulla linea di baseintrodurre rumore sulla linea di base

34 Rivelatore Diode-array misura in ogni istante lo spettro UV-visibile delleluato nellintervallo desideratomisura in ogni istante lo spettro UV-visibile delleluato nellintervallo desiderato può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)

35 Rivelatore spettrofotometrico IR sensibilità tipica: 1 ppmsensibilità tipica: 1 ppm applicabilità limitata dallassorbanza della fase mobile nel range spettrale infrarossoapplicabilità limitata dallassorbanza della fase mobile nel range spettrale infrarosso

36 Rivelatore a fluorescenza sensibilità 1000 volte superiore rispetto allassorbimento UV- visibilesensibilità 1000 volte superiore rispetto allassorbimento UV- visibile sensibilità tipica: 0.01 ppbsensibilità tipica: 0.01 ppb limitato alla rivelazione di composti fluorescenti, ma è possibile la derivatizzazionelimitato alla rivelazione di composti fluorescenti, ma è possibile la derivatizzazione è un sistema non distruttivo (tranne che con derivatizzazione)è un sistema non distruttivo (tranne che con derivatizzazione)

37 Rivelatore a indice di rifrazione sensibilità tipica: 0. 1 ppmsensibilità tipica: 0. 1 ppm completamente aspecificocompletamente aspecifico necessita di termostatazione accuratissimanecessita di termostatazione accuratissima si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri) è un sistema non distruttivoè un sistema non distruttivo basato sulla misura delindice di rifrazione delleluato (tipico rivelatore bulk)basato sulla misura delindice di rifrazione delleluato (tipico rivelatore bulk) non adatto con eluizione in gradientenon adatto con eluizione in gradiente

38 Rivelatore evaporative light scattering leluato è trasformato in aerosol, desolvatato e mandato in una cella nella quale si misura lo scattering della luceleluato è trasformato in aerosol, desolvatato e mandato in una cella nella quale si misura lo scattering della luce necessita di fasi mobili volatilinecessita di fasi mobili volatili ideale per composti ad alto PM, zuccheri e acidi non volatiliideale per composti ad alto PM, zuccheri e acidi non volatili è un sistema distruttivoè un sistema distruttivo

39 Rivelatore elettrochimico tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità amperometrica)tra i più sensibili (sensibilità tipica: 1 ppt, femtomoli in modalità amperometrica) possibilità di misura inpossibilità di misura in voltammetria (per applicazioni particolari)voltammetria (per applicazioni particolari) amperometriaamperometria coulometria (raro)coulometria (raro) conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica)conducimetria (utilizzato in cromatografia ionica) generalmente poco adatto alleluizione in gradientegeneralmente poco adatto alleluizione in gradiente

40 Rivelatore elettrochimico: amperometria basata sulla misura della corrente risultante da unelettrolisi (ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di un elettrodobasata sulla misura della corrente risultante da unelettrolisi (ossidazione o riduzione) di molecole di analita alla superficie di un elettrodo il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per alcune applicazioni dopamina)il più sensibile tra i rivelatori per LC (fino a femtomoli per alcune applicazioni dopamina) utilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range diutilizzabile per tutte le sostanze elettroattive nel range di potenziale dellelettrodo di lavoro impiegato possibile avvelenamento degli elettrodipossibile avvelenamento degli elettrodi utilizzo non sempliceutilizzo non semplice è un sistema parzialmente distruttivoè un sistema parzialmente distruttivo

41 Rivelatore elettrochimico: conducimetria basato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni disciolti in un campo elettricobasato sulla misura della corrente elettrica trasportata da ioni disciolti in un campo elettrico utile per sostanze ioniche o ionizzabiliutile per sostanze ioniche o ionizzabili rivelatore più comune in cromatografia ionicarivelatore più comune in cromatografia ionica sensibilità inferiore rispetto al rivelatore amperometricosensibilità inferiore rispetto al rivelatore amperometrico utilizzo molto sempliceutilizzo molto semplice è un sistema non distruttivoè un sistema non distruttivo

42 Rivelatore a spettrometria di massa il detector finale: sensibile, selettivo e universale, può permettere la caratterizzazione chimica del campioneil detector finale: sensibile, selettivo e universale, può permettere la caratterizzazione chimica del campione possibilità di discriminare analiti coeluiti in modalità SIMpossibilità di discriminare analiti coeluiti in modalità SIM sensibilità tipica: 0.1 ppbsensibilità tipica: 0.1 ppb limitato dallinterfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal campionelimitato dallinterfaccia e dalla necessità di rimuovere il solvente dal campione gli analiti devono essere ionizzabiligli analiti devono essere ionizzabili

43 Confronto tra rivelatori RivelatoreTargetLOD Range lineare UV-visibile/ UV-DAD composti che assorbono luce UV-VIS 1 µg/l 10 4 IR Fluorimetrico composti policondensati (PAH) 10 ng/l 10 3 RID non selettivo 1 mg/l 10 4 ELSD 1 mg/l ED amperometrico composti elettroattivi 100 pg/l ED conducimetrico composti ionici 1 µg/l 10 3 MSspecie 0.1 µg/l 10 5

44 Cromatografia Fluida Supercritica Fluidi supercritici impiegati in cromatografia:Fluidi supercritici impiegati in cromatografia: CO 2, Tc = 31°CCO 2, Tc = 31°C C 2 H 6, Tc = 32°CC 2 H 6, Tc = 32°C N 2 O, Tc = 37°CN 2 O, Tc = 37°C si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche fisiche intermedie tra i liquidi e i gas:si utilizza come fase mobile un fluido supercritico (cioè portato al di sopra della temperatura critica, Tc, sopra la quale una sostanza non può più essere trasformata in un liquido), avente caratteristiche fisiche intermedie tra i liquidi e i gas: maggiore densità rispetto ai gasmaggiore densità rispetto ai gas minore viscosità rispetto ai liquidiminore viscosità rispetto ai liquidi alto potere solubilizzantealto potere solubilizzante

45 Caratteristiche della SFC è utile in particolare per analizzare composti che non possono essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici):è utile in particolare per analizzare composti che non possono essere determinati con GC o LC (25% dei problemi analitici): composti non volatilicomposti non volatili composti termicamente instabilicomposti termicamente instabili composti non rivelabili con i normali rivelatori per LCcomposti non rivelabili con i normali rivelatori per LC la strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita controllo accurato della temperaturala strumentazione è simile a quelle per GC o LC; necessita controllo accurato della temperatura fasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizionefasi mobili analoghe a quelle per HPLC in ripartizione leluato si rivela come gas rivelatori FID, MS (interfacciamento semplice), TCD, ECDleluato si rivela come gas rivelatori FID, MS (interfacciamento semplice), TCD, ECD

46 Applicazioni della SFC separazione di molecole ad alto PM (fino a 10 5 ), prodotti naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosiviseparazione di molecole ad alto PM (fino a 10 5 ), prodotti naturali, alimenti, additivi, pesticidi, polimeri, esplosivi CO 2 supercritico può solubilizzare alcani C 5 -C 40 e PAHCO 2 supercritico può solubilizzare alcani C 5 -C 40 e PAH separazione di polietileni oligomerici con gradiente di pressione

47 Confronto tra HPLC ed SFC Separazione di bi- e trifenile con HPLC (sx) ed SFC (dx): la velocità di flusso è maggiore in SFC per cui la separazione è più veloce

48 GC, LC o SFC? Caratteristiche comuniCaratteristiche comuni Efficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono essere quantitativeEfficienti e altamente selettive; non distruttive (in senso analitico); possono essere quantitative Vantaggi della GCVantaggi della GC Rapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MSRapida; risoluzione eccezionale; facilmente interfacciabile con MS Vantaggi della LCVantaggi della LC Determinazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie ioniche inorganicheDeterminazione di specie non volatili o termicamente instabili, specie ioniche inorganiche La diffusione longitudinale è trascurabileLa diffusione longitudinale è trascurabile Vantaggi della SFCVantaggi della SFC caratteristiche intermedie tra GC ed LCcaratteristiche intermedie tra GC ed LC

49 Tecniche elettroforetiche Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto leffetto di un campo elettrico con diverse velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene mediante colorazione, per via fotometrica o, nellelettroforesi capillare, con rivelatori più sofisticati come il fotometrico, lelettrochimico e lo spettrometro di massa Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)

50 Classificazione delle tecniche Le tecniche elettroforetiche si classificano in: elettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tamponeelettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tampone elettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimeroelettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimero elettroforesi classica (es. separazione delle proteine del siero)elettroforesi classica (es. separazione delle proteine del siero) elettroforesi capillareelettroforesi capillare

51 Elettroforesi capillare Due grossi svantaggi dellelettroforesi classica sono: Questi svantaggi sono superati grazie allavvento della tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale le correnti sono inferiori e conseguentemente il calore di Joule è notevolmente più basso con vantaggi analitici evidenti convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al flusso di corrente elettrica, che porta allallargamento dei picchiconvezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al flusso di corrente elettrica, che porta allallargamento dei picchi difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammidifficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi

52 Prestazioni dellelettroforesi capillare La strumentazione necessaria per lelettroforesi capillare è costituita da due soluzioni tampone, il capillare con dispositivo di raffreddamento, un generatore di energia ad alta tensione, un sistema per lapplicazione del campione e un rivelatore Si utilizzano rivelatori UV, UV-DAD, fluorimetrici, elettrochimici e a spettrometria di massa

53 Versioni della CE Lelettroforesi capillare comprende una famiglia di tecniche che hanno caratteristiche operative e di separazione alquanto diverse. Le tecniche sono: elettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/caricaelettroforesi capillare di zona (CZE): è la forma più semplice di CE, in cui le molecole sono separate in base alle differenze nel rapporto massa/carica elettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE tradizionaleelettroforesi capillare ad alta prestazione (HPCE): evoluzione della CE tradizionale elettroforesi capillare a gel: è ladattamento della tecnica tradizionale di elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo come la poliacrilamideelettroforesi capillare a gel: è ladattamento della tecnica tradizionale di elettroforesi su gel operata su un capillare contenente un mezzo anticonvettivo come la poliacrilamide focusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettricofocusing isoelettrico (IEF): molecole cariche migrano in un campo elettrico nel quale un gradiente di pH le porta al loro punto isoelettrico isotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa velocitàisotacoforesi (ITP): le particelle migrano nel campo elettrico alla stessa velocità cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): laddizione di sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole neutre (es. fenoli)cromatografia capillare elettrocinetica micellare (MECC): laddizione di sostanze in grado di formare micelle permette la separazione di molecole neutre (es. fenoli)

54 Vantaggi della CE utilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammiutilizza la moderna tecnologia dei rivelatori in modo che gli elettroferogrammi assomigliano molto ai cromatogrammi lefficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N piatti teorici elevatissimo)lefficienza è analoga a quella della GC capillare o migliore (N piatti teorici elevatissimo) richiede una quantità minima di campione e di reagentirichiede una quantità minima di campione e di reagenti può essere facilmente automatizzatapuò essere facilmente automatizzata è applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre tecniche separazioneè applicabile ad un range di analiti più ampio rispetto alle altre tecniche separazione

55 Selezione della tecnica più adatta Le varie versioni della CE hanno caratteristiche che le rendono più adatte in certe situazioni. Nella tabella sono elencate in ordine di efficienza decrescente per la separazione delle diverse classi di analiti Ioni a basso PM Molecole a basso PM PeptidiProteine Oligo nucleotidi DNA CZEMECCCZECZECGECGE ITPCZEMECCCGEMECC ITPIEFIEF CGEITP

56 Applicazioni della CE Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse biologico è carica, la CE ha applicazioni importanti nellanalisi di aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (SEC). In particolare, per lanalisi di proteine e peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un solo aminoacido. Nella figura è mostrata lanalisi di una soluzione di albumina di siero bovino digerita con tripsina

57 Applicazioni della CE Altre applicazioni comprendono la separazione di anioni e cationi inorganici e di composti farmaceutici purchè carichi Separazione con MECC di aminoacidi (sx) e di corticosteroidi (dx)

58 Tecniche spettroscopiche Interazione tra luce e materia Tecniche spettroscopiche Informazione qualitativa (elementi, composti) Informazione qualitativa (elementi, composti) Informazione quantitativa (concentrazione) Informazione quantitativa (concentrazione)

59 Lo spettro elettromagnetico I vari intervalli dello spettro elettromagnetico sono sfruttati a scopo analitico per ottenere informazioni strutturali quali-quantitative sulla materia analizzata Energia

60 Classificazione delle tecniche spettroscopiche In base al meccanismoIn base al meccanismomeccanismo assorbimentoassorbimento emissioneemissione fluorescenzafluorescenza In base alla regione spettrale impiegata In base alla regione spettrale impiegataregione spettraleregione spettrale raggi 0.01 Åraggi 0.01 Å PIGE raggi X (0.01 Å – 100 Å)raggi X (0.01 Å – 100 Å) XRF, PIXE UV-Visibile (10 nm – 800 nm)UV-Visibile (10 nm – 800 nm) AAS, ICP-AES IR (800 nm – 0.4 mm)IR (800 nm – 0.4 mm) FT-IR microonde (0.4 mm – 0.25 m)microonde (0.4 mm – 0.25 m) EPR radiofrequenze (> 0.25 m)radiofrequenze (> 0.25 m) NMR In base alla specie interessataIn base alla specie interessataspecie interessataspecie interessata atomicaatomica molecolaremolecolare

61 Assorbimento ed emissione di luce A livello microscopico la luce interagisce con la materia in modalità differenti ma sempre legate a salti tra stati energetici Lassorbimento e lemissione di luce da parte della materia sono interpretabili come passaggio tra due stati di energia di un atomo o una molecola S1S0S1S0

62 Spettroscopia atomica e molecolare Spettroscopia atomica: il campione è trasformato in atomi somministrandogli energia si determinano elementiSpettroscopia atomica: il campione è trasformato in atomi somministrandogli energia si determinano elementi Spettroscopia molecolare: il campione è analizzato tal quale si determinano compostiSpettroscopia molecolare: il campione è analizzato tal quale si determinano composti

63 Regioni spettrali utilizzate Irraggiando la materia con la radiazione luminosa si creano effetti diversi a seconda dellenergia della radiazione utilizzata: raggi e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci interni e reazioni nel nucleoraggi e raggi X provocano transizioni elettroniche nei gusci interni e reazioni nel nucleo raggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci esterniraggi UV e visibile causano transizioni elettroniche nei gusci esterni raggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionaliraggi infrarossi causano transizioni vibrazionali e rotazionali microonde e onde radio interessano lorientazione degli spin elettronici e nuclearimicroonde e onde radio interessano lorientazione degli spin elettronici e nucleari

64 Spettroscopia atomica Il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamentoIl campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento Il vapore atomico subisce un interazione con la luce oppure con un campo magnetico; lentità di questa interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa e quantitativaIl vapore atomico subisce un interazione con la luce oppure con un campo magnetico; lentità di questa interazione fornisce la risposta analitica, qualitativa e quantitativa

65 Tecniche atomiche A seconda del tipo di interazione che subisce il vapore atomico, si possono avere le seguenti tecniche di spettroscopia atomica: il vapore è irraggiato con una radiazione monocromatica assorbibile solo dagli atomi di un determinato elementoil vapore è irraggiato con una radiazione monocromatica assorbibile solo dagli atomi di un determinato elemento il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi emettono il surplus di energia sotto forma di radiazione luminosail vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi emettono il surplus di energia sotto forma di radiazione luminosa il vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi si trasformano in ioni i quali sono separati e rivelati con uno spettrometro di massail vapore subisce un riscaldamento ulteriore e gli atomi si trasformano in ioni i quali sono separati e rivelati con uno spettrometro di massa Assorbimento atomico Emissione atomica Spettrometria di massa

66 Spettroscopia atomica: assorbimento il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamentoil campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento il vapore atomico subisce uninterazione con la luce emessa da una sorgente luminosa (righe)il vapore atomico subisce uninterazione con la luce emessa da una sorgente luminosa (righe) la riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante lassorbimento di risonanzala riga viene assorbita solo dagli atomi corrispondenti mediante lassorbimento di risonanza lentità di questa interazione fornisce la risposta analiticalentità di questa interazione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali elementi) qualitativa (quali elementi) identificazione attraverso le assorbite identificazione attraverso le assorbite quantitativa (qual è la concentrazione) quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota calibrazione con soluzioni a concentrazione nota legge di Lambert-Beer (A = bC) legge di Lambert-Beer (A = bC)

67 Spettrofotometria AAS

68 Assorbimento atomico a fiamma (FAAS) combustibile (acetilene) + comburente (aria) fiamma regolazione dei gas comparto della fiamma introduzione del campione

69 aspirazione in continuoaspirazione in continuo segnale dipendente dalla concentrazione e non dalla massasegnale dipendente dalla concentrazione e non dalla massa cammino ottico Assorbimento atomico a fiamma (FAAS)

70 Atomizzazione elettrotermica (ETAAS) Elettrotermica (ET): atomizzazione mediante una corrente elettrica ad alta potenza che crea un riscaldamento per effetto Joule

71 Atomizzazione elettrotermica (ETAAS) il campione (poche decine di µl) viene depositato allinterno di un cilindro di grafite detto fornetto, sottoposto poi a cicli di riscaldamento

72 Fornetti di grafite Il fornetto di grafite ha dimensioni di pochi cmIl fornetto di grafite ha dimensioni di pochi cm La tecnica è nota anche come GF-AASLa tecnica è nota anche come GF-AAS

73 Spettroscopia atomica: emissione il campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamentoil campione è trasformato in atomi con metodi vari di riscaldamento il vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza dellenergia somministratta sotto forma di caloreil vapore atomico emette luce emessa a righe in conseguenza dellenergia somministratta sotto forma di calore le righe emesse vengono separate e misuratele righe emesse vengono separate e misurate lentità dellemissione fornisce la risposta analiticalentità dellemissione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali elementi) qualitativa (quali elementi) identificazione attraverso le emesse identificazione attraverso le emesse quantitativa (qual è la concentrazione) quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota calibrazione con soluzioni a concentrazione nota intensità propozionale alla concentrazione (I = C) intensità propozionale alla concentrazione (I = C)

74 Spettrofotometria AES

75 Emissione atomica a fiamma (FF) utilizzo lo stesso strumento senza sorgente ottica regolazione dei gas comparto della fiamma introduzione del campione

76 Emissione atomica con plasma (ICP-AES)

77 Spettrofotometria ICP-AES Pompa peristaltica Nebulizzatore Camera di nebulizzazione Torcia di quarzo Sistema ottico Smaltimento fumi al PC 2 canali: 1 per il campione 1 per lo scarico

78 Spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)

79 Spettrometria ICP-MS

80 Spettrometro di massa e rivelatore Introduzione del campione Torcia ICP Interfaccia

81 Caratteristiche tecniche tecniche distruttive (1500-8000 °C)tecniche distruttive (1500-8000 °C) si determinano elementisi determinano elementi si analizzano liquidi, solidi se discioltisi analizzano liquidi, solidi se disciolti analisi totale del campioneanalisi totale del campione risultati espressi in concentrazionerisultati espressi in concentrazione ottima sensibilitàottima sensibilità mg/l per FAAS e FFmg/l per FAAS e FF µg/l per GFAAS e ICP-AESµg/l per GFAAS e ICP-AES ng/l per ICP-MSng/l per ICP-MS

82 Confronto tra tecniche

83 Limiti di rivelabilità

84 Spettroscopia molecolare Il campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarossoIl campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarosso Le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile)Le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecoleLa risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole Le tecniche più comunemente utilizzate sono quelle in assorbimentoLe tecniche più comunemente utilizzate sono quelle in assorbimento

85 Spettroscopia molecolare: assorbimento il campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarosso (bande o righe)il campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarosso (bande o righe) le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile)le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile) la risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecolela risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole lentità di questa interazione fornisce la risposta analiticalentità di questa interazione fornisce la risposta analitica qualitativa (quali composti) qualitativa (quali composti) identificazione attraverso le assorbite identificazione attraverso le assorbite quantitativa (qual è la concentrazione) quantitativa (qual è la concentrazione) calibrazione con soluzioni a concentrazione nota calibrazione con soluzioni a concentrazione nota legge di Lambert-Beer (A = bC) legge di Lambert-Beer (A = bC)

86 Spettrofotometria IR Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono lenergia equivalente per vibrare. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Esempio di spettrofotometro IR. Si tratta in genere di strumento molto compatti I campioni liquidi sono analizzati tal quali, mentre per i campioni solidi si prepara una pastiglia di KBr nel quale si disperde il campione polverizzato; è possibile analizzare anche i campioni gassosi

87 IR: modi di vibrazione Alcuni modi di vibrazione sono gli stretching (allungamenti) e i bending (piegamenti) che corrispondono a livelli energetici ben definiti

88 Esempio di spettro IR Il campione è irraggiato con un intervallo di compreso tra 2.5 e 20 µm (o compreso tra 4000 e 500 cm-1). Il 100% della scala di trasmittanza corrisponde ad assorbimento nullo

89 Spettrofotometria IR Ogni gruppo funzionale ha modi di vibrazione corrispondenti a o ben definite, che ne permettono lidentificazione

90 Impronta digitale Linsieme dei gruppi funzionali identificati permette di risalire globalmente alla molecola, lo spettro IR della quale corrisponde ad unimpronta digitale

91 Spettro IR della formaldeide Lassegnazione delle bande di assorbimento ai vari modi di vibrazione permette di risalire in modo ancora più accurato alla struttura della molecola HC H O

92 Applicazioni IR Esempi di applicazioni della tecnica IR: caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesicaratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi caratterizzazione strutturale di intermedi di sintesicaratterizzazione strutturale di intermedi di sintesi monitoraggio di cinetiche di reazionemonitoraggio di cinetiche di reazione caratterizzazione della purezza di un compostocaratterizzazione della purezza di un composto raramente utilizzata per determinazioni quantitativeraramente utilizzata per determinazioni quantitative

93 Spettrofotometria UV-visibile Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Gli spettrofotometri UV-visibile sono molto diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo; quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti nel range strumentale (180-800 nm) Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per HPLC

94 Transizioni elettroniche La spettroscopia UV-visibile è detta anche spettroscopia elettronica perchè è basata su transizioni di elettroni tra livelli energetici diversi Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce, come il gruppo –NO 2 (nitro), -N 2 - (azo), ecc. Solo le transizioni di elettroni n e hanno energie nel range 200-800 nm

95 Esempio di spettro UV-visibile Esempio di spettro UV-visibile di unaldeide insatura. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm). Le bande di assorbimento registrate sono in numero minore rispetto allIR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer

96 Tabella dei gruppi cromofori Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare () Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare ( ) CromoforoEsempioTransizione max (nm) Solvente C=CEtene *17115.000Esano C=CC=CC=CC=C1-Esino *18010.000Esano C=OEtanale n * * 290 290 1801510.000Esano N=ONitrometano n * *275200175.000Etanolo C-X X = Br X = I Metil bromuro Metil ioduro n * 205255200360esano

97 Applicazioni dellUV-visibile caratterizzazione strutturale di prodotti di sintesicaratterizzazione strutturale di prodotti di sintesi monitoraggio di cinetiche di reazionemonitoraggio di cinetiche di reazione caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto naturale (es. olio, vino)caratterizzazione della purezza di un composto o di un prodotto naturale (es. olio, vino) determinazione quantitativa di specie di interesse chimico- clinico o ambientale (A = bC)determinazione quantitativa di specie di interesse chimico- clinico o ambientale (A = bC) rivelazione in sistemi cromatograficirivelazione in sistemi cromatografici

98 Caratteristiche tecniche tecniche distruttive o non distruttivetecniche distruttive o non distruttive si determinano compostisi determinano composti si analizzano liquidi, solidi o gassi analizzano liquidi, solidi o gas analisi totale o parziale del campioneanalisi totale o parziale del campione risultati espressi in concentrazionerisultati espressi in concentrazione buona sensibilità (mg/l)buona sensibilità (mg/l)

99 Tecniche molecolari: Raman Il campione è irraggiato con luce monocromatica; le assorbite, aventi energia minore rispetto alla irraggiata, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole, i quali assorbono la differenza di energia per vibrare. A differenza dellIR, non si misura la luce assorbita ma quella che viene restituita o diffusa dai gruppi funzionali dopo lassorbimento. La risposta è visibile sotto forma di spettro Spettro Raman di un pigmento

100 Caratteristiche tecniche tecniche distruttive o non distruttivetecniche distruttive o non distruttive si determinano compostisi determinano composti si analizzano liquidi, solidi o gassi analizzano liquidi, solidi o gas possibili analisi in situpossibili analisi in situ analisi totale o parziale del campioneanalisi totale o parziale del campione risultati espressi in concentrazionerisultati espressi in concentrazione buona sensibilitàbuona sensibilità

101 Fluorescenza a raggi X Il campione è colpito con un fascio di raggi X dalla sorgente. Gli elementi presenti localmente vengono eccitati, cioè passano ad uno stato energetico superiore, dal quale decadono istantaneamente emettendo radiazioni X monocromatiche specifiche per ogni elemento Lintensità delle radiazioni emesse è correlabile alla concentrazione degli elementi presenti nel campione nel punto irraggiato La zona irraggiata può essere di 3-100 mm 2

102 Caratteristiche tecniche tecnica non distruttiva o distruttivatecnica non distruttiva o distruttiva si determinano elementisi determinano elementi si analizzano liquidi, solidisi analizzano liquidi, solidi possibilità di analisi in situpossibilità di analisi in situ buona risoluzione spazialebuona risoluzione spaziale risultati espressi in concentrazionerisultati espressi in concentrazione sensibilità discretasensibilità discreta

103 Altre tecniche spettroscopiche Esistono altre tecniche di analisi nelle quali si sfrutta linterazione della materia con un campo magnetico e/o con una radiazione luminosa Le tecniche principali in questo settore sono due: la spettrometria di massa la spettrometria di massa la risonanza magnetica nucleare o NMR la risonanza magnetica nucleare o NMR Queste tecniche vengono generalmente considerate tecniche spettroscopiche al pari di quelle descritte in precedenza

104 Spettrometria di massa (MS) Nella spettrometria di massa le molecole sono trasformate in ioni i quali, attraverso linterazione con un campo elettromagnetico, sono separati e analizzati per fornire informazioni sul peso molecolare e la struttura della molecola progenitrice

105 Esempio di spettri MS in questo esempio il campione è costituito da H 2 O. Attraverso la sorgente si possono formare lo ione molecolare (H 2 O + e- H 2 O + + 2 e - ) e i frammenti H +, O + e OH + I segnali degli ioni sono riportati assegnando allo ione più abbondante il 100% e mostrando gli altri ioni come percentuale di esso speciemassa H 2 O + 18 OH + 17 O + 16 H + 1

106 Applicazioni della tecnica MS Le applicazioni della tecnica MS spaziano in tutti i campi della scienza. In particolare: analisi ambientale (determinazione di composti tossici come diossine, PCB, PAH, ecc.)analisi ambientale (determinazione di composti tossici come diossine, PCB, PAH, ecc.) caratterizzazione di composti di interesse biologico o farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica, principi attivi, ecc.)caratterizzazione di composti di interesse biologico o farmaceutico (macromolecole, prodotti di ingegneria genetica, principi attivi, ecc.) analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti naturali e sintetici, ecc.)analisi di materiale di interesse agroalimentare (prodotti naturali e sintetici, ecc.) rivelatore per cromatografia, sia GC che LCrivelatore per cromatografia, sia GC che LC

107 Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Questa tecnica analitica è da ormai 50 anni la più utilizzata nel campo della caratterizzazione della struttura di sostanze organiche; ha buone potenzialità anche in campo inorganico Le caratteristiche tecniche dellNMR ne fanno però uno strumento da ricerca più che da laboratorio, per quanto alcune applicazioni siano entrate nella routine, per esempio nellambito del controllo in campo alimentare La tecnica si basa sullinterazione tra atomi aventi numero di spin non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze

108 Nuclei e numeri di spin Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono riportate nella tabella seguente Numero di protoni Numero di neutroni Numero di Spin Esempi paripari0 12 C, 16 O, 32 S disparipari1/2 1 H, 19 F, 31 P disparipari3/2 11 B, 35 Cl, 79 Br paridispari1/2 13 C paridispari3/2 127 I paridispari5/2 17 O disparidispari1 2 H, 14 N NMR-attivo no si si si si si no

109 Schema di uno spettrometro NMR

110 Chemical shift: esempi

111 Esempio di spettro 1 H NMR acido dimetilbenzoico

112 Esempio di spettro 13 C NMR

113 Tecniche accoppiate Le tecniche accoppiate o ifenate (dallinglese hyphen che indica il trattino di sillabazione) sono costituite dallinterfacciamento di un sistema separativo ad un sistema di rivelazione spettroscopica Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi: la parte cromatografica produce frazioni pure di analita la parte cromatografica produce frazioni pure di analita la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro la parte spettrale fornisce informazioni su un componente puro Le tecniche ifenate più comuni sono GC-MS ed LC-MS, disponibili in versioni commerciali largamente diffuse. Altre tecniche sono meno diffuse, es. GC-AES, LC-ICPMS. A parte GC-MS, si tratta normalmente di strumenti disponibili a grandi centri di ricerca

114 Informazioni fornite Le grandi potenzialità delle tecniche ifenate sono legate alle informazioni strutturali che forniscono sul campione spettri di massa spettri di massa determinazione di specie diverse di uno stesso elemento determinazione di specie diverse di uno stesso elemento

115 Determinazione di metalli Combinazioni possibili step di cleanup della matrice step di cleanup della matrice step di preconcentrazione step di preconcentrazione possibilità di studi di speciazione possibilità di studi di speciazione

116 Criteri di scelta: separazione Scelta della fase mobile o del carrier carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri)carrier gassoso (solo per elementi che formano idruri) GC-AFSGC-AFS IEC-(postcolumn-HG)-AFSIEC-(postcolumn-HG)-AFS carrier organico (specie lipofiliche)carrier organico (specie lipofiliche) RP-HPLC-FAASRP-HPLC-FAAS RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione)RP-HPLC-ICP-AES (necessaria desolvatazione) RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione)RP-HPLC-ICP-MS (necessaria desolvatazione) tamponi (specie ioniche e non ioniche)tamponi (specie ioniche e non ioniche) IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 mM)IEC-ICP-MS (solo tamponi < 50 mM) Ion pair-RP-HPLC-ICP-AESIon pair-RP-HPLC-ICP-AES rivelatoregassososeccoacquosoorganicosalino AFS++++++XXX FAAS++++++++++ ICP-AES++++++++++ ICP-MS++++++++X +++ necessario ++ possibile + in condizioni specifiche X non utilizzabile

117 Criteri di scelta: rivelazione in base agli analiti da determinarein base agli analiti da determinare As, Se, Hg, Sb AFSAs, Se, Hg, Sb AFS Cu, Zn, Cr FAASCu, Zn, Cr FAAS in base alla concentrazionein base alla concentrazione elementi maggiori FAASelementi maggiori FAAS tracce AFS, ICP-AEStracce AFS, ICP-AES ultratracce AFS, ICP-MSultratracce AFS, ICP-MS il rivelatore deve poter funzionare in modalità continuail rivelatore deve poter funzionare in modalità continua il sistema deve generare segnali transientiil sistema deve generare segnali transienti

118 Speciazione di elementi volatili Se, As, Sb, Te, Hg, (Sn) formano idruri volatili LC-HG-AFS Separazione di composti organoarsenici

119 GC-ICP-MS solo per elementi che formano composti volatilisolo per elementi che formano composti volatili necessita di derivatizzazione (HG o etilazione)necessita di derivatizzazione (HG o etilazione) 100 % di campione introdotto nel detector (sensibilità elevata)100 % di campione introdotto nel detector (sensibilità elevata) nessun problema di interfaccia (carrier gassoso!)nessun problema di interfaccia (carrier gassoso!)

120 Speciazione di organometalli Speciazione di composti organostannici (5 ppb)

121 GC-ICP-AES meno sensibile di GC-ICPMSmeno sensibile di GC-ICPMS interfacciamento sempliceinterfacciamento semplice produce uno spettro di emissione per ogni analitaproduce uno spettro di emissione per ogni analita

122 GC-FTIR può distinguere isomeri strutturali che presentano lo stesso spettro di massapuò distinguere isomeri strutturali che presentano lo stesso spettro di massa fornisce informazioni sulla struttura molecolare anche in assenza di un esatto riferimentofornisce informazioni sulla struttura molecolare anche in assenza di un esatto riferimento limitazione: librerie povere (poche migliaia di spettri contro 250.000 spettri in MS), in quanto la maggior parte degli spettri è in fase liquida o solida, ma in fase gas sono diversilimitazione: librerie povere (poche migliaia di spettri contro 250.000 spettri in MS), in quanto la maggior parte degli spettri è in fase liquida o solida, ma in fase gas sono diversi

123 CE-ICP-MS richiede uninterfaccia specialerichiede uninterfaccia speciale effetti matrice elevatieffetti matrice elevati consumo di campione bassissimo (nL)consumo di campione bassissimo (nL) risoluzione eccellenterisoluzione eccellente

124 Tecniche elettrochimiche Le tecniche elettrochimiche sono rivolte alla determinazione di specie elettroattive. Si tratta di un gruppo di tecniche con ottime prestazioni in termini di sensibilità, versatilità e rapporto qualità/costo, ma sono solitamente poste in secondo piano a causa della difficoltà di comprendere appieno la teoria che sta alle loro basi

125 Classificazione

126 Tecniche volumetriche

127 Saggi qualititativi