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METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono.

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1 METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dellanalita, anche in matrici complesse. campione+ complesso antigene- anticorpo anticorpo quantificazione del complesso antigene- anticorpo

2 LA NASCITA DEI METODI IMMUNOMETRICI Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluoresceina Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con lenzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA) Engvall e Perlmann descrivono lELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale lanalita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT) Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

3 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

4 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (label) Piccoli volumi di campione Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi) Diagnosi precoce Determinazione di sostanze in tracce VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

5 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

6 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche - errori precisione e accuratezza - tempi di esecuzione rapidità VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

7 Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dallequilibrio: dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, k a e k d sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e K eq è la costante di equilibrio AbAn + An-Ab kaka kdkd K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq kaka kdkd = ASPETTI TERMODINAMICI INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una K eq = M -1

8 Un anticorpo specifico per lanalita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con lanalita stesso. Lanalita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con lanticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. COME SI OTTIENE UN ANTICORPO Mediante limmunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dellantigene e caratterizzati da diverse affinità. È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

9 Antisiero policlonaleAnticorpi monoclonali IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI ( II )

10 CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI VantaggiSvantaggi Caratteristiche (affinità e specificità) note e costanti Spesso caratterizzati da bassa affinità Solitamente caratterizzati da elevata specificità Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dellantigene) E possibile selezionare lanticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con lantigene Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate

11 Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina carrier (es. BSA o KLH) che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro laptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che lanticorpo sia diretto proprio contro laptene. ANTIGENI ED APTENI braccio spaziatore aptene carrier anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono laptene

12 SPECIFICITA DEGLI ANTICORPI Una caratteristica fondamentale dellanticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente lanalita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). La tendenza dellanticorpo a legare altre molecole, strutturalmente simili allanalita, viene quantificata attraverso la sua reattività crociata. Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici posizione di coniugazione con la proteina carrier utilizzata per la sintesi dellimmunogeno BaP 100%40%100%

13 STRATEGIE DI SINTESI DELLIMMUNOGENO La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dellimmunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse applicazioni immunogeno Anticorpo specifico per lanalita Anticorpo specifico per la classe

14 Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dallequilibrio: AbAn + An-Ab kaka kdkd K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq kaka kdkd = ASPETTI TERMODINAMICI INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

15 Laffinità dellanticorpo per lanalita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard. Riprendendo lequazione: [An-Ab] eq [An] eq = K eq Ab t - K eq [An-Ab] eq SCATCHARD PLOT ( I ) si definisce Ab t = [Ab] eq + [An-Ab] eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando lequazione ed introducendo Ab t si ottiene: K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq kaka kdkd =

16 [An-Ab] eq [An] eq = K eq Ab t - K eq [An-Ab] eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – K eq, lintercetta sullasse y è K eq Ab t e lintercetta sullasse x è Ab t. SCATCHARD PLOT ( II )

17 High affinity Low affinity Ab t K eq SCATCHARD PLOT ( III )

18 [An-Ab] [An-Ab]/[An] Retta 1 Retta 2 Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla K eq massima ed alla K eq minima. EFFETTI DELLETEROGENEITA DELLANTICORPO La K eq massima a minima danno informazioni sullanticorpo: eterogeneità (differenza tra le due K eq ); specificità (gli anticorpi con K eq vicina alla K eq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto). SCATCHARD PLOT ( IV )

19 TRACCIANTI An + Ab An-Ab La formazione del complesso An-Ab non è in genere facilmente misurabile. Viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto (non viene infatti rivelato direttamente lanalita) introducendo un tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità. Il tracciante viene ottenuto legando un label opportuno (specie facilmente rivelabile con una opportuna tecnica analitica) allantigene, ad un derivato dellantigene o ad un anticorpo.

20 Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. LABEL Isotopi radioattivi ( 125 I, 3 H) Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu 3+, Tb 3+ ) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

21 SCELTA DEL LABEL Tracciante: limite di rivelazione Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa ( g) e facilmente rivelabile TRACCIANTESEGNALEMASSA (moli/tubo) 125 I dpm0.1 – 10 x EnzimaAssorbanza – Luminescenza – Fluorescenza – Amplificazione ciclica enzimatica – Molecola fluorescente I fluorescenza – Molecola chemiluminescente mV –

22 Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? Lattività catalitica dellenzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sulluso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. E S La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante Lenzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

23 Vantaggi relativi alluso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dellattività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dellattività enzimatica in seguito al legame con lanticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi alluso di enzimi: lattività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dellenzima può ridurne lattività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

24 La misura dellattività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dallenzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. Luso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo. TRACCIANTI ENZIMATICI Chemiluminescenza 2-naphthyl- -D- galactopyranoside Fluorimetria4-metilumbelliferone Spettrofotometria2-nitrofenolo -galattosidasi ChemiluminescenzaAMPPD Fluorimetria4-metilumbelliferone-fosfato Spettrofotometria4-nitrofenilfosfatoFosfatasi alcalina ChemiluminescenzaH 2 O 2 /luminolo SpettrofotometriaH 2 O 2 /cromogenoPerossidasi METODOLOGIA ANALITICA SISTEMA DI RIVELAZIONE ENZIMA

25 METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA) Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi ( s) Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

26 CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA Può essere considerata una chemiluminescenza attivata per via elettrochimica anziché chimica. Ru(bpy) 3 2+ electrode TPA Ru(bpy) 3 2+ : ECL label TPA: tripropylamine TPA products photon Ru(bpy) 3 2+ Ru(bpy) 3 2+ * Ru(bpy) 3 3+ e-e- TPATPA + e-e- TPA - H +

27 CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA VANTAGGI: E una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato Può essere accesa e spenta (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente) Non ha segnale di fondo Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con lusi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

28 Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche magnete Fasi di reazione e lavaggio: microsfere in sospensione Fasi di eliminazione della soluzione: microsfere trattenute dal magnete Elettrodi per la produzione del segnale ECL METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV)

29 Sono a tuttoggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys: METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V)

30 COMPETITIVI ETEROGENEI NON COMPETITIVI ETEROGENEI CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI COMPETITIVI OMOGENEI NON COMPETITIVI OMOGENEI

31 La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). Lequilibrio che si instaura è: An + Ab An-Ab + An* An*-Ab K An K An* Le condizioni per lesecuzione del metodo sono: [An*] i = costante [Ab] i = costante [Ab] i < [An] i + [An*] i PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI

32 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Anticorpo immobilizzato Antigene Tracciante Enzima Substrato enzimatico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

33 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

34 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

35 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

36 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

37 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

38 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI COMPETITIVI ETEROGENEI

39 segnale log concentrazione analita Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce allaumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI log [analita]

40 Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dellanalita allanticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante allanticorpo. 123 aggiunta reattivi reazione separazione libero legato analita tracciante Conc. analita Tracciante legato PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI

41 B/B 0 log concentrazione analita La concentrazione dellanalita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B 0 in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI B 0 è il segnale ottenuto in assenza di analita B è il segnale a concentrazione x di analita

42 B/B 0 log concentrazione analita PARAMETRI QUANTITATIVI Sensibilità pendenza della curva Intervallo dinamico Convenzionalmente compreso fra B/B 0 90% e B/B 0 10% Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard di B 0 Midrange Concentrazione corrispondente a B/B 0 50%

43 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI a c a+d 2 y x d b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI x = dose y = B Lintroduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N c a a/ 2 y x b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log FITTING DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE

44 errori PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE SI ASSUME ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)

45 EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI B/B 0 log concentrazione analita Ridurre la concentrazione del tracciante Diminuire la quantità di anticorpo immobilizzato e riottimizzare il metodo (se la rivelabilità del tracciante è adeguatamente elevata, si sposta verso il basso il range dinamico) Aumentare la costante di affinità dellanticorpo e riottimizzare il metodo La rivelabilità assoluta del tracciante ha un effetto solo indiretto, permettendo di lavorare a concentrazioni minori. Riduzione del limite di rivelazione:

46 La specificità di un anticorpo è la sua capacità di discriminare tra antigeni con struttura simile. Tra i vari modi per misurare la specificità di un anticorpo, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dallanticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. SPECIFICITA DELLINTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO [An-Ab]/[An] [An] ab

47 LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello stiramento della sigmoide che approssima la curva dose- risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

48 Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa. METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

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52 Quanto costa unanalisi immunometrica? - Kit immunometrico per analisi del progesterone: 80 (permette di effettuare 40 analisi in duplicato 2 /analisi) - Spettrofotometro per micropiastre con filtri per le adeguate lunghezze donda: Altra attrezzatura indispensabile per lanalisi (micropipette, vortex, ecc.): Materiali disposable (provette, puntali, ecc.): per ogni kit utilizzato - Tempo richiesto per lanalisi, includendo i tempi necessari per la preparazione dei campioni ed i tempi di incubazione: 3-4 ore per 40 campioni METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

53 Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con lanticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando lenzima lisozima come tracciante, ma successivamente lenzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito allinterazione con lanticorpo. METODI COMPETITIVI OMOGENEI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

54 S S P Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con lanticorpo Il segnale aumenta allaumentare della concentrazione di analita. Sono stati proposti due sistemi. conc. analita attività enzimatica METODI COMPETITIVI OMOGENEI 1° sistema: EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

55 S S P conc. analita attività enzimatica Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con lanticorpo Il segnale diminuisce allaumentare della concentrazione di analita. 2° sistema: METODI COMPETITIVI OMOGENEI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)

56 Lefficienza dellassorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dallangolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e loscillatore nella molecola. Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, il piano di polarizzazione della luce emessa sarà parallelo a quello della luce assorbita. luce assorbitaluce emessa fluoroforo Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) METODI COMPETITIVI OMOGENEI

57 Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola. Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con, esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenutaLa polarizzazione viene persa Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) METODI COMPETITIVI OMOGENEI

58 Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns. In condizioni di eccitazione costanti lemissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. Lanalita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato allanticorpo in fase omogenea. Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo. Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)

59 METODI IMMUNOMETRICI NON COMPETITIVI Reazione dellanalita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag][Ab*] > [Ag] Lanalita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab* Non Competitivi di Tipo Sandwich: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei

60 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Anticorpo di cattura immobilizzato Antigene Tracciante Enzima Substrato enzimatico Anticorpo di rivelazione METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

61 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

62 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

63 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

64 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

65 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

66 Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA SANDWICH

67 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) DIRETTIINDIRETTI

68 DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo Ab anti-ferritina marcato con HRP min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione 60 min 37 °C

69 DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

70 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Antigene di cattura immobilizzato Anticorpo Tracciante Enzima Substrato enzimatico Anticorpo specie- specifico METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

71 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

72 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

73 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

74 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

75 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

76 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

77 STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO Marcatura diretta Rivelazione mediante un anticorpo secondario marcato Ab ottenuto nella specie X Ab anti-specie X marcato Ab ottenuto nella specie X Ab anti-specie X biotinilato Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile con un opportuno reagente Streptavidina marcata

78 IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA avidinabiotina enzima MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

79 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La concentrazione dellanalita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva ideale è lineare. Segnale Concentrazione analita In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dellanticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione

80 Segnale concentrazione analita PARAMETRI QUANTITATIVI Sensibilità pendenza della curva Intervallo dinamico Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard del bianco

81 EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI Aumentare la costante di affinità dellanticorpo (lantigene viene catturato più efficacemente dellanticorpo) Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) ottimizzando le condizioni di rivelazione, utilizzando principi di rivelazione maggiormente sensibili o sistemi di rivelazione amplificati. B/B 0 concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione:

82 Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dellantigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati allantigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc... substrato prodotto intermedio prodotto finale METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

83 SISTEMAINDICATORI i 1 /i 2 SUBSTRATIPRODOTTI P 1 / P 1 Enzimi vicinali Esochinasi / GPDasi ATP/glucosi o NAD+ Glucosio 6-fpsfato Gluconolattone-6- fosfato + NADH Enzimi vicinali GOasi/ POasi Glucosio/ Donatore H ossidato Perossido/ Donatore H ossidato

84 METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato) alta %P anticorpo analita marcato (in eccesso) bassa %P [analita] %P

85 METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI Metodi eterogenei Poco sensibile allinterferenza della matrice del campione Molto sensibile allinterferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei CARATTERISTICHE

86 TestTecnicaRangeTempi analisi FT4Competizione0-7 ng/ml90 T3Competizione0-6 ng/ml60 T4Competizione0.25µg/dl60 Ig-ESandwich0-500 IU/mL180 ProlattinaSandwich0-400 ng/ml60 FSHSandwich0-150 mIU/ml150 CortisoloCompetizione0-50 µg/dl60 ESEMPI DI TEST COMPETITIVI E NON COMPETITIVI

87 INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: - la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con lanticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con lanticorpo per il legame con lantigene (es proteine del siero), ecc; - la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

88 Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi ( s) Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns) METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA)

89 APPLICAZIONI: ESEMPI Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica clinica riguardano la determinazione di: ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva) farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi, immunosoppressivi, antibiotici, ecc...) droghe dabuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaine) Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero, proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine Interleuchine diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma, Epatite

90 SENSIBILITA DEI METODI IMMUNOMETRICI

91 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay Permettono unanalisi qualitativa o semi- quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) e fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dellanalita (T) e la zona di controllo (C) SS TT CC NegativoPositivo

92 Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura: - da negativo a 20 mg/l - da 20 a 50 mg/l - da 50 a 100 mg/l - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test: - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza: - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002 Conformità direttiva 98/79/CEE LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE

93 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con lanticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti alluso. E necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori,...)

94 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: analizzatori automatici Laboratori di grosse dimensioni utilizzano analizzatori automatici che, una volta inserito il campione, eseguono automaticamente le procedure di calibrazione, analisi del campione ed elaborazione dei dati. Abbott TDx

95 REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI In opportune condizioni la formazione del complesso antigene-anticorpo dà luogo ad una reazione di precipitazione: essendo le molecole di anticorpo bivalenti e possedendo spesso lantigene due o più epitopi, si ottengono comunemente precipitati con legami reticolati (cross-linked). In un sistema ideale abbiamo tre zone: -(A) Eccesso di anticorpo (Ab) -(B) Zona di equivalenza (zona più interessante a fini analitici). -(C) Eccesso di Ag Ag Ab precipitato A B C

96 REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE La composizione del precipitato varia fortemente nelle tre zone. La precipitazione degli aggregati antigene-anticorpo (reazione di immunoprecipitazione) rappresenta una tecnica molto utilizzata per lanalisi qualitativa e quantitativa di componenti relativamente abbondanti nel siero, in particolare delle proteine sieriche. Nellambito delle tecniche basate su reazioni di immunoprecipitazione abbiamo: -Tecniche basate sulla diffusione -Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida -Tecniche di tipo elettroforetico In senso lato, anche le tecniche immunometriche propriamente dette (es. tecniche immunoenzimatiche) si possono considerare tecniche di immunoprecipitazione. Ag Ab precipitato A B C METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI

97 Diffusione monodimensionale semplice: la soluzione contenente (potenzialmente) lantigene in esame viene stratificata sopra un gel di agar contenente un opportuno antisiero. Lantigene migra nel gel, determinando la formazione di una o più bande di precipitato (complesso antigene-anticorpo) nelle zone ove si raggiungono rapporti ottimali di concentrazione (poiché queste zona variano nel tempo, le bande migrano verso il basso). Diffusione monodimensionale doppia: fra le due soluzioni viene interposto un ulteriore stato di gel di agar (zona neutra). Le bande si formano quindi dove la diffusione di entrambe le specie porta al raggiungimento dei rapporti ottimali di concentrazione antigene/anticorpo. Tecniche di diffusione monodimensionale Soluzione contenente lantigene Gel di agar contenente lantisiero Diffusione Zona neutra Diffusione METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI

98 Nelle tecniche di diffusione bidimensionale si utilizza uno strato di gel di agar, nel quale sono stati ricavati pozzetti nei quali vengono poste le soluzioni in esame e la soluzione di anticorpo. A seguito della diffusione radiale dei vari componenti, ove possibile si formano archi di precipitato che identificano lavvenimento della reazione antigene- anticorpo. Con opportune modificazioni questa tecnica è applicabile anche a fini quantitativi (es. tecniche di immunodiffusione radiale: usando solo lantigene nei pozzetti, mentre lanticorpo è disciolto nel gel di agar, larea delle bande che si formano è proporzionale alla concentrazione dellantigene). Tecniche di diffusione bidimensionale Soluzioni contenente lantigene Soluzione contenente lanticorpo Diffusione Reazione antigene- anticorpo Nessuna reazione METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI

99 Nelle tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida il precipitato formatosi a seguito della reazione antigene-anticorpo viene di solito quantificato attraverso leffetto Tyndall, ovvero la dispersione della luce incidente. Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida La quantificazione del precipitato può avvenire mediante turbidimetria o nefelometria (la seconda è nettamente più sensibile, permettendo di raggiungere limiti di rivelazione nettamente minori di quelli ottenibili con le tecniche di diffusione). Luce incidente Misura della luce assorbita: turbidimetria Misura della luce diffusa: nefelometria METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI

100 Rivelazione USO DI PARTICELLE DI POLISTIRENE PER METODI IMMUNOMETRICI (es:PACIA - Particle Counting Immunoassay o misure di diffusione)


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