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SVILUPPO DI UN IMMUNOSENSORE PER LA DETERMINAZIONE DEL 17- ESTRADIOLO NEL SIERO BOVINO G. Fares, G. Volpe, D. Moscone, R. Draisci*, F. delli Quadri*, L.

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1 SVILUPPO DI UN IMMUNOSENSORE PER LA DETERMINAZIONE DEL 17- ESTRADIOLO NEL SIERO BOVINO G. Fares, G. Volpe, D. Moscone, R. Draisci*, F. delli Quadri*, L. Achene*, G. Palleschi. Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di Roma Tor Vergata, Via della Ricerca Scientifica, Roma. * Lab. Medicina Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, V.le Regina Elena 299, Roma. INTRODUZIONE Il 17 -estradiolo (17 -E 2 ) è un ormone steroideo naturale con attività estrogenica, usato per curare e prevenire infezioni animali. Tale sostanza, date le sue proprietà anabolizzanti, viene anche illegalmente utilizzata come promotore di crescita negli allevamenti intensivi degli animali di azienda. A causa dei suoi effetti carcinogenici, lUnione Europea ha bandito il suo utilizzo a scopo di ingrasso per proteggere il consumatore da possibili effetti dannosi dovuti al consumo di carne contaminata. Conseguentemente, in Italia, è stato stabilito un limite massimo per il 17 -E 2 (40 pg/ml tranne per animali gravidi) nel siero e nel plasma bovino. Da qui lesigenza di disporre di metodi di analisi, semplici e rapidi, per accertare leventuale presenza dellormone nei fluidi biologici. Questo lavoro è focalizzato sulla realizzazione di un immunosensore elettrochimico monouso per la determinazione del 17 -E 2 nel siero bovino. Lo schema del saggio sviluppato è di tipo competitivo diretto Fig.1. Allo scopo di ottenere una superficie altamente selettiva per lanalita e ridurre allo stesso tempo ladsorbimento aspecifico da parte di altre molecole, è stato utilizzato il metodo del precoating che prevede ladsorbimento sulla fase solida (superficie elettrodica) di IgG aspecifiche, seguito dal loro legame con gli anticorpi specifici per lanalita da dosare. Le successive fasi ottimizzate consistevano nella incubazione della soluzione di competizione, contenente estradiolo libero e estradiolo coniugato (appositamente sintetizzato) con lenzima fosfatasi alcalina (AP) e nella rilevazione dell -naftolo, prodotto della reazione tra lenzima e il substrato -naftil fosfato, mediante voltammetria differenziale ad impulsi (DPV). PRINCIPIO DEL METODO La tecnologia degli screen printed(SPEs), elettrodi stampati ottenuti tramite serigrafia, consente la realizzazione di sistemi di rilevazione miniaturizzati, prodotti su larga scala ed a basso costo. La loro economicità permette di utilizzarli come usa e getta, eliminando di conseguenza fenomeni di avvelenamento della superficie elettrodica, e li rende adatti per misure in situ Elettrodo di Riferimento di Ag 2. Elettrodo di Lavoro di grafite 3. Controelettrodo di Ag Come è fatto uno SPE? Come è fatto uno SPE? Funzione di un SPE Funzione di un SPE Trasduttore di segnale Supporto per limmobilizzazione del biocomponente Limmunosensore realizzato prevede che linterazione tra i biocomponenti avvenga direttamente sulla superficie dellelettrodo di grafite stampato (elettrodo di lavoro). IgG aspecifiche Anticorpo specifico per il 17 -E E 2 -AP 17 -E 2 Fig. 1 RISULTATI velocità di scansione:100 mV/s frequenza degli impulsi di potenziale: 0.16 sec intervallo di potenziale: mV durata dellimpulso: 60 ms ampiezza dellimpulso ( E): 50 mV Parametri ottimizzati per l -naftolo Current ( A) E (mV) Risposta degli elettrodi SPEs a differenti a concentrazioni di -naftolo Voltammetria ad impulso differenziale (DPV) Binding steps 4 µL 17 -E 2 -AP (differenti diluizioni), 25 min. precoating: 8 µL IgG aspecifiche (10µg/mL), overnight 4 o C coating: 8 µL Pab (1:100), 1h 4 µL tampone di lavoro (PBS), 5 min. 50 µL 1-naftilfosfato, 2 min Curva di binding del 17 -E 2 -AP tra tutti gli steps menzionati, venivano effettuati 2 rapidi lavaggi con PBS addizionato con Tween (0.05%) Immunosensore Allo scopo di ottimizzare la quantità di 17 -E 2 -AP, da utilizzare nella successiva competizione, sono state costruite delle curve di binding fissando la concentrazione dellanticorpo specifico (Pab) per il 17 -E 2 e variando quella del coniugato secondo lo schema: Competition steps 4 µL 17 -E 2 -AP (1:150), 25 min. precoating: 8 µL IgG aspecifiche (10µg/mL),overnight 4 o C coating: 8 µL Pab (1:100), 1h 4 µL 17 -E 2 (soluzioni standard ), 5 min. 50 µL 1-naftilfosfato, 2 min Curva standard del 17 -E 2 La sperimentazione futura consisterà nel testare le performance dellimmunosensore sviluppato su un siero bianco fortificato con differenti concentrazioni di17 -E 2 e nellanalisi di campioni reali; i risultati verranno confrontati con quelli ottenuti mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS-MS). la diluizione di 17 -E 2 -AP = 1:150 (punto di flesso della curva ) è stata selezionata per la succesiva competizione:


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