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FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione.

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1 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di una radiazione elettromagnetica con la materia Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche

2 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA MECCANISMO DELLINTERAZIONE Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo, ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo, ione o molecola portandoli ad un più basso stato di energia In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo distinguere metodi di assorbimento e di emissione.

3 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE ( I ) Energia del fotone = h h = costante di Planck (6,626 x J s) = frequenza (s -1 ) Allaumentare di la frequenza e lenergia del fotone diminuiscono = c c = velocità della luce Unità di più comuni: nm = m Å = m m = m

4 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE ( II ) TipoLunghezza dondaEnergiaInterazione < 0,1 nmemissione nucleare raggi X0,1-10 nmtransizioni elettroniche (elettroni interni) UV nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) Vis nmtransizioni elettroniche (elettroni di valenza) IR800 nm-100 mtransizioni vibrazionali Microonde100 m- 1 cmtransizioni rotazionali onde radio1 cm- metriassorbimento nucleare

5 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO = c / E = h Energia Ultravioletto Visibile Infrarosso Raggi cosmiciRaggi gamma Raggi XUltravioletto VisibileInfrarosso Microonde RadarTelevisione NMR RadioUltrasuoni Suoni (udibile) Infrasuoni Frequenza [Hz] Lunghezza donda [m]

6 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Una sostanza assorbe la luce solo quando lenergia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione Le transizioni possono essere: Elettroniche Vibrazionali Rotazionali Le ultime due riguardano solo le molecole

7 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso. Latomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento a righe complesso dovuto a transizioni elettroniche allinterno dei sottolivelli s,p,d,f

8 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Transizioni vibrazionali Causano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR) A B A B Transizioni rotazionali Causano modifiche dellenergia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde) A----B A----B IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

9 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Linterazione con una molecola e lassorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Le interazioni con altre molecole avranno anchesse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a bande (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre). ASSORBIMENTO MOLECOLARE

10 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0S0 S1S1 S2S2 I Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche

11 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Locchio umano vede il colore complementare di quello assorbito COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE

12 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE rosso arancio giallo-verde verde verde-bluastro blu-verdastro blu violetto blu-verde blu-verdastro porpora rosso-porpora rosso arancio giallo giallo-verde Lunghezza donda (nm)Colore assorbitoColore complementare

13 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Lanalisi quantitativa spettrofotometrica è basata principalmente sullo studio degli spettri UV/Vis. La legge fondamentale su cui si basano i metodi di assorbimento è quella di Lambert e Beer. Questa legge dice che: la quantità di luce assorbita da una soluzione è proporzionale alla concentrazione della sostanza assorbente e alla lunghezza del cammino ottico. ANALISI QUANTITATIVA

14 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA P/P 0 è anche denominata Trasmittanza (T) -logT = A dove A viene definita Assorbanza A = bc Il rapporto P/P 0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita ANALISI QUANTITATIVA P0P0 c b P = assorbività b = cammino ottico c = concentrazione

15 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA LA LEGGE DI LAMBERT E BEER Concentrazione Assorbanza

16 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è meglio determinare lassorbività utilizzando standard E possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione: Molarità, %, ppm, ecc. Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il cammino ottico in cm, lassorbività viene definita come assorbività molare ( ) ed ha unità M -1 cm -1 DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA

17 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA In genere si cerca di eseguire le misure al valore della lunghezza donda corrispondente al massimo dellassorbanza ( max ) Questo è il punto di massima risposta corrispondente alla più alta sensibilità e più basso limite di rivelazione Permette inoltre di ridurre il più possibile lerrore associato alla misura legato ad una eventuale scarsa riproducibilità della lunghezza donda MISURA DELL ASSORBANZA

18 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella risposta. MISURA DELL ASSORBANZA Piccolo errore Piccolo errore Grande errore Grande errore Stessa variazione di lunghezza donda Stessa variazione di lunghezza donda

19 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Deviazione dalla relazione lineare Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo ambito di concentrazione. MISURA DELL ASSORBANZA Il metodo deve essere utilizzato solo in questo ambito Ambito lineare

20 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA MISURA DELL ASSORBANZA Questo segnale potrebbe essere dovuto al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità Questo segnale potrebbe essere dovuto ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione Ambito lineare

21 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia lassorbanza della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente misurata è la trasmittanza. Lerrore nella determinazione di una concentrazione mediante una misura spettrofotometrica ( c) è quindi legato allerrore che si ha nella misura della trasmittanza ( T). Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di Lambert e Beer si ha: c/c = ( / TlogT) T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA

22 FACOLTA DI FARMACIA – CHIMICA ANALITICA Landamento di c/c in funzione di T è il seguente: E consigliabile quindi operare in un ambito di trasmittanza compreso tra %T al fine di minimizzare lerrore spettrofotmetrico. Errore relativo in funzione della %T Errore relativo su conc. 80% 20% %T ERRORE NELLA MISURA DELL ASSORBANZA


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