Influenza della radiazione ambientale sul metabolismo e sulla risposta di organismi viventi ad agenti genotossici M.A. Tabocchini (Istituto Superiore di.

Presentazione sul tema: "Influenza della radiazione ambientale sul metabolismo e sulla risposta di organismi viventi ad agenti genotossici M.A. Tabocchini (Istituto Superiore di."— Transcript della presentazione:

1 Influenza della radiazione ambientale sul metabolismo e sulla risposta di organismi viventi ad agenti genotossici M.A. Tabocchini (Istituto Superiore di Sanità – INFN-RM1 Gr.coll.Sanità) Durata del progetto: 3 anni (2013 – 2015) ENEA Università dell’Aquila Flinders University, Adelaide, Australia INFN Roma1-Gr. Coll Sanità CENTRO FERMI INFN-LNGS INFN LNF La collaborazione

2 PARTECIPANTI ALL’ESPERIMENTO SILENZIO COSMICO

3 Experimental design Reference environmental radiation (~ 0.6-3 mGy/year) Reduced environnmental radiation (~ 33 µGy/year) Environmental radiation components ISS (external laboratory) L’Aquila Univ (external laboratory) LNGS (underground laboratory) Cosmic Rays (a) 30 nGy/h Negligible Cosmic and terrestrial γ-rays (b) 300 nGy/h34 nGy/h3.6 nGy/h 222 Rn (c) 1.7 nGy/h0.17 nGy/h Total dose rate ~ 330 nGy/h ~ 64 nGy/h ~ 3.8 nGy/h set up of parallel experiments in different radiation environments ISS / L’Aquila Univ (external labs) LNGS-INFN (underground lab) (a) based on UNSCEAR 2000 Report, Sources, Annex E; (b) TLD measurements; (c) based on the application of the model by Jostes et. al. Radiat Res.1991

4 Chinese hamster cells Satta et al., 2002 Antonelli et al., 2008 Previous experiments Human cells Carbone et al., 2009 Carbone & Pinto et al., 2010 S. Cerevisiae Satta et al., 1995 Pulex (Esp. Gr5) Silenzio Cosmico (Centro Fermi) Cells cultured in reduced environmental radiation conditions for several months are:  Less tolerant to radiation- induced DNA damage  Less efficient in scavenging reactive oxygen species 6 months of continuous culture 9 months of culture 120 generations – 1 week

5 The international framework Other underground laboratories in the world are starting biological experiments and strong attention has been manifested by the international community to the results already obtained at the LNGS Other underground laboratories in the world are starting biological experiments and strong attention has been manifested by the international community to the results already obtained at the LNGS Canfranc, Spain Deep Underground Science and Engineering Laboratory,(DUSEL), Homestalke Mine, S. Dakota The WIPP Facility, underground repository, Chihuahuan Desert, outside Carlsbad, New Mexico Geoffrey Smith, New Mexico State University, will spend several weeks at LNGS for collaborative in vitro experiments China JinPing Deep Underground Laboratory (CJPL)

6 "Does biochemistry of living matter depends on environmental radiation? The experience from Yeasts to human cells at the LNGS” oral presentation proposed by L.Votano

7 HORIZON 2020 – EURATOM HORIZON 2020 – EURATOM MELODI (Multidisciplinary European Low Dose Initiative) (strong emphasis to in vitro and in vivo studies aimed at investigating effects of low doses-dose rates such those encountered in the environment and in the working places) L’INFN ha strutture e competenze estremamente importanti nella ricerca sui rischi delle basse dosi EoI to join MELODI EoI to join MELODI

8 The importance of reducing the uncertainties on the evaluation of damage due to low chronic doses is underlined by the plan of the European Research community in the next 20 years: see for instance the EURATOM research projects under the radioprotection field. These studies foresee an integrated approach at epidemiological and, both in vivo and in vitro, experimental level. Current understanding and quantification of risk at low doses is limited by the uncertainties of the available scientific methods and by a lack of understanding of the basic biological mechanisms. A valid tool to understand these mechanisms still are in vitro cell cultures, even if the use of animal models is strongly needed for the final evaluation of the radiation biological effects. It is well known that not all the radiation induced damage has a local origin and that a relevant part of the biological radiation response is due to “non cell-autonomous physiological mechanisms” (that include cell-cell communication, tissue responses, immune system, etc) that require studies at organism level.

9 Importanza della sperimentazione in vivo L’ambiente del laboratorio sotterraneo dei LNGS consente inoltre di effettuare studi mirati alla comprensione degli effetti a livello polmonare dell’inalazione di Radon come unica fonte di esposizione a radiazioni ionizzanti La sperimentazione “in vitro” continua a rimanere fondamentale per studi meccanicistici, ma è estremamente importante la validazione “in vivo” (come fortemente raccomandato nell’ambito dei bandi dei Progetti europei). Bq/m 3 Bq/m 3 ore presa dati ore presa dati Misure Radon nel box Pulex dal 13/06/06 al 20/06/06 Blocco temporaneo del sistema di ventilazione Nuovo paradigma della radiobiologia: da una visione DNA centrica verso una grossa enfasi sul ruolo dei fenomeni di interazione e di comunicazione cellula-cellula tessuto organismo

10 *Matsuoka et. al., Science 1991 pKZ1 Chromosomal Inversion Assay Il modello sperimentale murino pKZ1* Ideale per studiare la risposta a dosi estremamente basse di agenti genotossici This mouse model has been widely used for very low dose radiation experiments by Prof. Pam Sykes, Flinders University, Adelaide, Australia LacZ Expression DNA inversion P P ZcaL P P LacZ

11 X-gal staining in varius organs Epithelial cells lining the prostate gland lumen, some also in the interstitium Epithelial cells at the top of the intestinal crypts, facing on to the lumen of the colon non-specific specific X-gal staining in frozen spleen Secondary spermatocytes and spermatids in the middle of the seminiferous tubules. No blue in Sertoli cells or spermatogonia Epithelium of the follopian tube: no blue in the primary or secondary follicles, small amount in the mature follicles. (From the seminar given by Prof. P. Sykes at the ISS)

12 In vivo inversion frequency for pKZ1 spleen and prostate tissue after single whole body X- irradiation (acute exposure) Zeng et al, 2006Day et al, 2006, 2007 (From the seminar given by Prof. P. Sykes at the ISS) Straight line?

13 What about pkZ1 response after chronic exposures to very low doses??? The LNGS underground laboratory represents a “unique” opportunity to investigate the influence of environmental doses-dose rates Male mice will be kept for 1, 3 and 6 months after weaning in different radiation environments Biological test will be performed before and after acute irradiation in the dose range: 10 µGy-10 mGy comparable to the range of doses imparted during medical diagnostics

14 Other end points of interest gene expression and activity of enzymes such as SOD, CAT, GPX; HSP Stress response Cell proliferation and apoptosis Ki67, TUNEL assay in cryopreserved tissues Trans-generation experiments male reproductive germ cells damage and biological studies in the offspring pkZ1 assay will be performed primarly in frozen spleen (other tissues will be kept for further analysis)

15 Other end points of interest Neurological and behavioural tests Learning and memory, anxiety and exploration, motor coordination non invasive sentinel tests Stem cells from hair follicle Cell death (apoptosis, …. )

16 Il modello sperimentale murino pKZ1 Università dell’Aquila A partire da tre coppie di topi pKZ1 inviateci dalla Prof. Sykes è attualmente presente presso lo stabulario dell’Università dell’Aquila una colonia murina così costituita: GENOTIPOSessoNumero pKZ1M13 pKZ1F14 WTM17 WTF11 TOTALE55 Al momento

17 GESTIONE VETERINARIA Gli animali oggetto dell’esperimento sono mantenuti in un ambiente adeguato alla loro salute ed al loro benessere. Il Dott. Luca Fruci, medico veterinario incaricato, vigilerà sulle condizioni di salute degli animali, fornendo l'assistenza sanitaria veterinaria e svolgendo funzioni di consulenza sul benessere e sullo stato sanitario degli animali. La sperimentazione animale presso l’Università dell’Aquila sarà effettuata in accordo al protocollo presentato al Ministero della Salute, che è attualmente in fase di approvazione. Il modello sperimentale murino pKZ1 Università dell’Aquila CollaboratoriLaureaQualificaDipartimento E. AlesseMedicinaProf. OrdinarioMedicina Sperimentale D. CapeceBiotecnologieBorsistaCentro Fermi F. ZazzeroniSc. BiologicheRicercatoreMedicina Sperimentale A.TessitoreSc. NaturaliAssegnistaMedicina Sperimentale M. FischiettiBiotecnologieDottorandaMedicina Sperimentale D. VerzellaBiotecnologieDottorandaMedicina Sperimentale A. GaggianoBiotecnologieDottorandaMedicina Sperimentale

18 - Set up di una facility per stabulazione all’interno dei laboratori sotterranei dei LNGS, satellite dello stabulario dell’Università dell’Aquila SILENZIO COSMICO Attività I anno (2013): - Caratterizzazione della radiazione ambientale mediante misure di spettroscopia e di dosimetria all’interno del laboratorio di riferimento dell’Università dell’Aquila e della facility satellite presso il laboratorio sotterraneo dei LNGS - Allestimento di una colonia di topi pKZ1 all’interno della facility di stabulazione dei LNGS - Test biologici (test sentinella, pKZ1, stress ossidativo, test comportamentali, …) in funzione del tempo di permanenza in condizioni di fondo ambientale di riferimento e di risposta ad agenti genotossici in topi maschi allevati presso lo stabulario dell’Università dell’Aquila (Milestone 30-9-2013) (Milestone 31-12-2013)

19 Set up of an animal housing facility at the LNGS underground lab satellite facility of the reference animal laboratory at L’Aquila University The colleagues of L’Aquila University will be in charge for animal care and autorization procedures Mice will be kept for some months in reduced environmental radiation conditions and then taken to L’Aquila University for the biological tests Legend: A = animal rack B = cupboard C = table D = rack E = sink A BC D E C

20 - Mantenimento della colonia di topi pKZ1 all’interno dei LNGS - Topi maschi trasferiti all’Università dell’Aquila con periodicità trimestrale per test biologici (pKZ1, stress ossidativo, test comportamentali, …) in funzione del tempo di permanenza in condizioni di ridotto fondo ambientale e di risposta ad agenti genotossici SILENZIO COSMICO - Attività II anno (2014): SILENZIO COSMICO - Attività III anno (2015): - Mantenimento della colonia di topi pKZ1 all’interno dei LNGS per esperimenti trans-generazionali - Topi maschi trasferiti all’Università dell’Aquila con periodicità trimestrale per test biologici (pKZ1, stress ossidativo, test comportamentali, …) in funzione del tempo di permanenza in condizioni di ridotto fondo ambientale e di risposta ad agenti genotossici

21 http://www2.consiglio.regione.abruzzo.it/leggi/lexreght/testilex/0423125.htm Norme approvate da parte del Consiglio Regionale Abruzzese il 31 luglio 2012

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24  Gli aspetti legati alle risposte a livello di intero organismo non possono essere studiate con altri sistemi modello (che peraltro continuano ad essere utilizzati per ottenere informazioni sui meccanismi di base in una sperimentazione parallela)  La limitata valenza statistica ottenuta da studi epidemiologici e l’impossibilità di studiare altrimenti i meccanismi trans- generazionali e comportamentali giustifica ulteriormente la sperimentazione proposta  Quando necessario, gli animali saranno sacrificati secondo le modalità previste dalla legge; le persone coinvolte hanno una consolidata esperienza e competenza in questo tipo di sperimentazione  Anche gli aspetti relativi all’Art.16 sono rispettati in quanto saranno tenuti in considerazione i risultati di esperimenti precedenti condotti dalla Prof. Sykes e collaboratori Nel caso dell’esperimento SILENZIO COSMICO

25 La proposta dell’esperimento COSMIC SILENCE (SC) sarà sottomessa per approvazione al XXXVIII meeting of the LNGS Scientific Committee - October 16-17, 2012 E’ stata aperta la sigla “SILENZIO COSMICO” da parte della CSN5 a seguito dell’audizione del 26-9-2012 E’ stata aperta la sigla “SILENZIO COSMICO” da parte della CSN5 a seguito dell’audizione del 26-9-2012 GRAZIE PER L’ATTENZIONE !

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