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 Per quanto riguarda il mais per uso alimentare umano, i limiti di aflatossine (in µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del 2006 mais da sottoporre.

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2  Per quanto riguarda il mais per uso alimentare umano, i limiti di aflatossine (in µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del 2006 mais da sottoporre a selezione o altro trattamento prima del consumo o del suo utilizzo come ingrediente per alimenti → AFB1=5,0; totali=10,0 Cereali e derivati, tra cui i prodotti alimentari a base di cereali → AFB1=2,0; totali=4,0

3  Per quanto riguarda l’uso mangimistico per animali i limiti di AFB1 (in ppm di prodotto con umidità al 12%) sono contenuti nel D.Lgs. 149 del 2004 Tutte le materie prime ad uso mangimistico → 0,02 Prodotti per bovini, capre e pecore → 0,02 (tranne prodotti per bestiame da latte → 0,005 e prodotti per agnelli e vitelli → 0,01) Prodotti per polli e maiali (tranne quelli giovani) → 0,02 Altri prodotti completi → 0,01 Prodotti aggiuntivi per bovini, capre e pecore (tranne i prodotti aggiuntivi per bestiame da latte, agnelli e vitelli) → 0,02 Prodotti aggiuntivi per maiali e polli (tranne quelli giovani) → 0,02 Altri prodotti aggiuntivi → 0,005

4 Per estrarre le aflatossine dal campione da analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver filtrato, per purificare una parte del filtrato si utilizza una cartuccia di florisil e poi una di C18; La separazione e la determinazione successive si effettuano con sistema HPLC, utilizzando una colonna C18 a fase inversa, poi si effettua una derivatizzazione con una soluz. di iodio satura e, infine, una quantificazione, utilizzando un rivelatore a fluorescenza.

5  Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%)  Metanolo  Propanone (acetone)  Soluzione acetonelacqua (98:2)  Soluzione acqualmetanolo (80:20)  Soluzione acqualacetone (85:15)  Eluente per HPLC, costituito da una soluzione acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono essere per HPLC  Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare)  Celite 545 o simile trattata con acido  Cartucce di florisil  Cartucce di C18  Standard di aflatossine  Standard di aflatossine da 1 μg/ml circa

6  Registrare lo spettro ultravioletto della soluz. nell’intervallo nm contro la soluzione benzene/acetonitrile (9:1); trovare l‘A del pto. di massimo e trovare la concentraz. con la questa formula: AF(μg/ml)= (A ∙ PM ∙ 1000) / E A: assorbanza nel pto. di max PM: peso molecoare dell'AFB1 E: coeff. di estinz. molare A = assorbanza

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8  Infine, per quanto riguarda la soluz. di calibrazione, prima del suo utilizzo, portare lo standard da 1 μg/ml alla T ambiente; trasferirne una parte in recipiente tarato, in modo da poter ottenere uno standard diluito da 4 ng/ml circa di AF in acqualacetone. Usare questo standard diluito per ottenere da esso una serie di soluz. di calibrazione. Mantenerle alla temperatura di 4 °C e al buio. Preparando gli standard ed effettuando le analisi, bisogna evitare l’esposizione alla luce diretta e la presenza di NaClO sotto forma di vapore, che possono decomporre le AF. La vetreria nuova va sottoposta a trattamento, utilizzando una soluz. 2 N di acido solforico per 12 ore, prima di poter essere lavata normalmente.

9  Tritacarne  Agitatore meccanico  Bilancia analitica  Rotavapor  Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o un’altra simile  Filtro con pori di diametro 0,45 fvn  Colonna di vetro, con un diametro interno di 1 cm circa e una lunghezza di 30 cm circa con attacco luer  Rubinetto di nylon con attacco luer  Siringa da 10 ml con attacco luer  Cromatografo HPLC

10  Colonna C18 per HPLC da 311 o da 5 u  Pompa HPLC per la soluz. di iodio  Collegamento a T in acciaio inox, V morto zero da 1/16 per 0.75 nun  Spirale di reaz. in teflon o in acciaio inox, avente delle dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm  Bagno termostato a olio o acqua a 60 °C con regolazione della temperatura (± 0.1 °C)  Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria nella cella a flusso.  Integratore elettronico

11 Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita, rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine in soluzione acquosa, evitando quindi quelli portati a secchezza. Infatti queste sostanze, essendo particolarmente elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente nell‘ambiente circostante. In caso di versamento accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClO all'l %, lasciare reagire per 10 min e successivamente utilizzare una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30 min e poi lavare con cura. AF = aflatossine

12 Macinare completamente il campione e renderlo omogeneo Estrarre 50 g di campione, utilizzando 250 ml di CHCl3 e 25 ml di acqua deionizzata, in una beuta con tappo smerigliato, e aggiungere 25 g di celite, che funge da coadiuvante di filtrazione(cioè un materiale ausiliare nel proc. di filtraz. che serve principalmente a conferire incomprimibilità e porosità al deposito di particelle solide che si accumula sul mezzo di filtrazione) Agitare per 30 minuti, filtrare con filtro a pieghe e poi ottenere almeno 50 ml di liquido filtrato ed estratto

13 Collegare il rubinetto di nylon al gambo corto della cartuccia florisil, lavare quest’ultima e prelevare 10 ml di CHCl3 con la siringa e farne passare 8 nella cartuccia attraverso il rubinetto, per togliere l’aria Collegare il gambo lungo della cartuccia alla colonna di vetro e far passare gli altri 2 ml di CHCl3, attraverso la cartuccia, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Aggiungere il filtrato al complesso colonna-cartuccia e lasciare filtrare per gravità, poi lavare con 5 ml di CHCl3 e poi con 20 ml di MeOH; poi scartare i componenti dell’eluito (attenzione: nel frattempo controllare che la colonna-cartuccia non vada a secchezza)

14 Eluire le AF con 40 ml di acetonelacqua e raccogliere l’eluato che si ottiene Utilizzando il rotavapor, concentrare l’eluato, anche per eliminare i residui di acetone rimasti che porterebbero a perdita di analita (le AF) nella cartuccia C18; riprendere questo residuo con 1 ml di MeOH e 4 di acqua Collegare il rubinetto al gambo corto della cartuccia di C18 e far passare con la siringa 10 ml di MeOH, per togliere l’aria; prelevare 10 ml di acqua e farne passare 8 attraverso la cartuccia

15 Collegare il gambo lungo della cartuccia a una colonna di vetro e far passare, attraverso la cartuccia, gli altri 2 ml di acqua, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e staccare la siringa Mettere l’estratto ottenuto nella colonna e, con acqualmetanolo, lavare il pallone almeno 2 volte; lasciare filtrare per gravità; controllare che la colonna- cartuccia non vada a secchezza Eluire le AF con 50 ml di acqualacetone; raccogliere, in un cilindro graduato, tutto l’eluato; se ritenuto necessario, portare a volume 50 ml con acqua e mescolare.

16 Impostare il flusso della pompa a 0,5/0,3 ml/min, rispettiv. per colonna da 5 o da 311 u; la fase mobile (eluente) è acqualmetanolo /acetonitrile Il flusso dell’altra pompa dev’essere impostato a 0,4/0,2 ml/min di soluzione satura di iodio per flussi rispettiv. di 0,5 e 0,3 ml/min dell’eluente Il rivelatore a fluorescenza va impostato alle λ di lavoro; regolare il detector impostando una deviazione di circa l’80% del fondo scala del registratore per 1 ng di AFB1

17 Introdurre per iniezione nello strumento 250 μ l delle soluz. Di calibrazione, precedentemente preparate, e dell’estratto del campione Verificare la linearità della risposta fluorimetrica calcolando la curva di regressione lineare y=ax+b che si ottiene dalla correlazione della quantità x delle AF in ng iniettate, con le aree proporzionali all’intensità di fluorescenza y

18 II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è calcolato con questa formula: AF = (m ∙ Vn) / (Vm ∙ M ∙ Vf ∙ 250) Dove: m = quantità di AF (espressa in ng) che si ottiene dal picco del campione estratto, e che si calcola sulla curva di regress. lineare Vn = i ml di estratto di campione che sono stati iniettati Vm = il ml finali dell'estratto di campione M = la massa (g) del campione Vf = il volume (ml) del filtrato ottenuto 250 = i ml di CHCl3 usato per estrarre il campione Se l’analisi e stata effettuata secondo le indicazioni la formula diventa: AF (espressa in μg/kg) = 20 ∙ m

19  ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli, Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN 96/34  RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di Bologna  lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0 005:0024:IT:PDF lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0 005:0024:IT:PDF  news.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File /Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.% pdf?OpenElement news.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File /Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.% pdf?OpenElement


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