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Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia In Natura.

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Presentazione sul tema: "Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia In Natura."— Transcript della presentazione:

1 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia In Natura si distingue: Vita saprofita: nell’ambiente a spese di materiale inanimato Vita parassitaria: a carico di organismi superiori Parassiti Obbligati Facoltativi (Maggioranza dei batteri) (Minoranza) 1

2 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Parassiti Rapporti tra batteri e ospite: Commensali (indifferenti) Simbionti (utili) Opportunisti (talvolta possono dare malattia) Patogeni (nocivi) ( moltiplicazione in vivo e tossigenicità) 2

3 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 3 Popolazione microbica normale Esistono due gruppi di PMN: residente transito 1) Competizione con nutrienti (interferenza) 2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo) 3) Produzione di batteriocine 4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti (anaerobi) 5) Continua stimolazione del sistema immune (macrofagi) 6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)

4 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 4 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vita Dipendono da fattori genetici abitudini alimentari e igieniche situazioni di stress fenomeni psicosomatici età

5 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 5 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Residenti, o popolazione microbica normale rappresentano circa l’1% del peso corporeo. 10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.

6 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN Cute Cavità orale e prime vie aeree Tratto intestinale Uretra Vagina Occhio 6

7 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN Cute PM transitoria Pieghe cutanee Secrezioni sebacee Sudorazione e lavaggi Disinfezione Medicazioni occlusive 7

8 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN cavità orale Sterile alla nascita 4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti (madre) Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie, moraxelle, difteroidi. Eruzione dei denti: spirochete anaerobie, prevotelle, fusobatteri, capnocytophaga Actinomyces tonsille e gengive degli adulti Miceti: Candida 8

9 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN vie respiratorie Faringe e trachea simili alla cavità orale Bronchi pochi batteri Bronchioli e alveoli sterili 9

10 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN vie respiratorie 10

11 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 11 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è stata definita come "un insieme di microrganismi presenti nel lume intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"

12 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 12 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la concentrazione aumenta arrivando nel colon a batteri per g

13 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 13 PMN intestinale Duodeno: /gr Digiuno-ileo: /gr Cieco-colon trasverso: /gr Sigma-retto: /gr antibiotici pH acido basico

14 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 14 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi varia con il variare del sito anatomico

15 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 15 PMN intestinale

16 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 16 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Portano milioni di geni (5), un numero di gran lunga superiore ai stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore ) Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini

17 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 17 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della lignina e della cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale dove possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione delle feci

18 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 18 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine. B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico. La vitamina K viene sintetizzata dall 'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinale I germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.

19 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 19 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile. Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornar e al feg ato attraverso la vena porta.

20 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 20 POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di muco denso che contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule epiteliali adiacenti in modo da regolare la permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino questa sede

21 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 21 POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario

22 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 22 The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l

23 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia PMN vagina Alla nascita pH acido: lattobacilli Dopo alcune settimane fino a pubertà pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli Pubertà pH acido: lattobacilli Dopo la menopausa pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli IMPORTANTE IL LIVELLO DEGLI ESTROGENI 23

24 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 24

25 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 25

26 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Batteri a circolazione interumana: Infezioni esogene ed endogene Portatore sano 26

27 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Possibili vie d’accesso per i microorganismi Vie respiratorie tratto gastro-enterico genito-urinario Canali naturali 27

28 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Possibili vie d’accesso per i microorganismi ViaEsempi IngestioneSalmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae, C. botulinum ecc.. InalazioneMycobacterium, Mycoplasma, Legionella Chlamydia ecc… Penetrazione diretta (aghi, ferite) C. tetani, S. aureus ecc.. Punture d’artropodi Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc.. SessualeN. gonorrhoeae, T. pallidum, C. trachomatis transplacentareT. pallidum 28

29 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Possibili vie d’accesso per i microorganismi Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.) tubi per ventilazione sondini di drenaggio Somministrazione di farmaci che deprimono la risposta immunitaria o che alterano il microambiente di alcuni distretti dell’organismo (es. antiacidi) interruzioni dell’integrità della superficie della mucosa e della pelle Canali occasionali 29

30 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Meccanismi di difesa naturale e barriere L’ambiente in vivo è molto sfavorevole per i batteri: pH, T, O 2, flusso dei liquidi organici, cellule ciliate, macrofagi, integrità e composizione biochimica dei tessuti, infiammazione, febbre Strato corneo della pelle 30

31 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Meccanismi di difesa naturale e barriere Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati, movimento del contenuto del lume del canale mucoso (intestino, uretra)… PMN residente Cellule di sfaldamento Colonizzazione della cute e delle mucose 31

32 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Meccanismi di difesa naturale Fagocitosi Funzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la superficie batterica a) l’anticorpo agisce da opsonina b) l’anticorpo + antigene attiva il complemento c) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili che attivano il complemento La fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è stato osservato un aumento della produzione di acqua ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma, proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina, perossidasi) 32

33 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 33

34 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig) Variazione antigenica (shift) Inibizione della fusione lisosomiale Elusione dei lisosomi e moltiplicazione nel citoplasma Produzione di catalasi che scinde lo ione superossido Resistenza agli enzimi lisosomiali Produzione di IgA proteasi Strategie batteriche 34

35 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig) La resistenza ai macrofagi può aversi mediante: 1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi 2. capsula che impedisce la fagocitosi 3. produzione di superossidismutasi che sequestra l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP che è necessario per la fagocitosi 4. mimetismo antigenico Strategie batteriche 35

36 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Mimetismo antigene È la presenza di componenti strutturali che presentano notevoli analogie di composizione con materiali presenti nei tessuti dell’organismo ospite che vengono quindi difficilmente individuati come non- self 36

37 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Mimetismo antigene S.pyogenes possiede diversi materiali antigenici (proteina M, antigeni di membrana, carboidrati di gruppo) che presentano analogie molecolari ed antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute, nell’encefalo e nelle articolazioni e la risposta autoimmune che si mette in opera durante l’infezione da S. pyogenes, potrebbe rappresentare un elemento di rilievo nella patogenesi della febbre reumatica a della cardiomiopatia reumatica. 37

38 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Mimetismo antigene Le Chlamydie presentano negli involucri esterni alcune proteine ricche in cisteina che hanno analogie antigenetiche con la catena pesante dell’alfa-miosina specifica del muscolo cardiaco ed è stata quindi ipotizzata una base autoimmune nella patologia cardiaca correlata alla infezione di Chlamydia (C. pneumoniae soprattutto). 38

39 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 39 Gram-negative commensal of the human oropharynx, can cause septicaemia by crossing the mucosal barrier and entering the bloodstream or meningitis by crossing the blood–brain barrier into the cerebrospinal fluid. In each case, N. meningitidis uses molecular mimicry to survive exposure to the innate immune system. The ability of the immune system to distinguish foreign cells from self is mediated in part by sialic acid, which coats the surface of human cells and acts as a ‘self signal’. N. meningitidis exploits this feature by decorating its outer surface with sialic acid residues, thus masking itself from human defences. Molecular mimicry is a key component of N. meningitidis pathogenesis and mutants that are unable to sialylate their outer surface are highly attenuated. The in vivo nutritional environment has an impact on N. meningitidis host cell mimicry. N. meningitidis can use lactate and glucose as carbon and energy sources, and lactate and glucose are present in nasopharyngeal tissue, serum and cerebrospinal fluid at 1–2 mM and 6–10 mM levels, respectively. Neisseria meningitidis

40 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 40 Molecular mimicry by Neisseria meningitidis. a | Glucose catabolism in N. meningitidis proceeds by the Entner–Doudoroff pathway and lactate catabolism feeds directly into the sialic acid pathway. Note the relative number of metabolic steps from glucose to phosphoenolpyruvate compared with that from lactate to phosphoenolpyruvate. b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS) on the N. meningitidis surface mimics the surface of eukaryotic cells, preventing deposition of the complement molecule C3. Inactivation of the lactate permease gene lctP results in C3-mediated cell lysis.

41 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 41 Interestingly, although both of these carbon sources are present in vivo, N. meningitidis catabolizes lactate at a faster rate than it does glucose, and mutants that are deficient for lactate transport are defective colonizers of nasopharyngeal tissue. Why might a bacterium preferentially metabolize a more oxidized substrate such as lactate over glucose? One likely explanation is that intermediates of lactate consumption feed directly into the sialylation pathway, thus enhancing sialic acid biosynthesis. This, in turn, leads to increased sialylation of the N. meningitidis outer membrane. As expected, a N. meningitidis strain that is unable to transport lactate (DlctP) is highly deficient for sialic acid modification of the outer membrane and is more susceptible to complement- mediated killing. Thus, for N. meningitidis, catabolism of a preferred carbon source in vivo is coupled to a unique immune- evasion strategy. Neisseria meningitidis

42 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Quando un microorganismo invade l’ospite E’ in grado di superare le difese di un individuo sano PATOGENO Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospite OPPORTUNISTA 42

43 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Attributi dei microorganismi che causano malattia Abilità di causare malattia o produrre lesioni progressive (Patogenicità) Grado di patogenicità, ovvero, malattia causata anche da batteri in numero piuttosto limitato (Virulenza). Queste proprietà possono essere suddivise in tossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche ed invasività: abilità nel penetrare i tessuti e di diffondere. Molti di questi caratteri sono controllati da plasmidi. 43

44 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Isole di patogenicità (PAI) I geni per i fattori di patogenicità, soprattutto se localizzati a livello cromosomico, possono essere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA: PAI I PAI probabilmente sono segmenti di DNA acquisiti orizzontalmente che differenziano i batteri che li posseggono dagli altri della stessa specie 44

45 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Infezione L’infezione è il processo attraverso il quale un microorganismo entra in relazione con l’ospite 45

46 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Infezioni Monomicrobica: un singolo patogeno Polimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobi Mista: aerobi ed anaerobi insieme Comunitaria: acquisita in ambiente non ospedaliero Nosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero 46

47 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Fasi di una proliferazione batterica 1) Adesione 2) Invasione 3) Produzione di metaboliti (crescita) 4) Produzione di tossine: enzimi degradativi tossine tipo A-B 5) Endotossine 6) Induzione di infiammazione 7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig) 8) Resistenza agli antibiotici 47

48 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Fattori che caratterizzano un microorganismo patogeno Adesività mediata da strutture specializzate ac. lipoteicoici nei gram-positivi proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.) produzione di capsula (slime) capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospite capacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi (invasività) capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospite produzione di esotossine 48

49 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Adesione Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione. Il processo è mediato da strutture poste sulla superficie esterna dei batteri note come adesine, per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia coli enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici (streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a loro volta, come già detto, strutture che legano le adesine ad esempio fibronectina disposta sulla superficie dell’epitelio orale. (Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione) 49

50 Perchè i batteri aderiscono? I batteri non adesi verrebbero eliminati Adesione: prima tappa della colonizzazione e della formazione del biofilm 3: Fase di adesione reversibile e irreversibile 50

51 Evidenze sperimentali del ruolo dell’adesione nella colonizzazione I batteri legano recettori isolati o analoghi dei recettori L’adesina purificata o un suo analogo lega il recettore L’adesione è inibita da: Analoghi dei recettori e delle adesine Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il recettore 51

52 Cosa utilizzano i batteri per aderire? Adesine batteriche Proteine espresse sulla superficie Fimbrie Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi teicoici (G+) Enzimi Enzimi batterici ancorano la cellula al substrato Enzimi batterici possono esporre recettori criptici 52

53 Morfologia delle adesine Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Type I fimbriae Afimbrial adhesin Curli 53

54 ADESINE BATTERICHE 54

55 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Adesività Adesione specifica e selettiva alle cellule epiteliali: adesine-recettore G-: proteine in fimbrie o pili G+: glicolipidi (ac. Lipoteicoici, [LTA]) + proteine (es. F di S.pyogenes) in fibrille Recettore su cellule: porzione glicidica di glicoproteine o glicolipidi o proteine di membrana Materiale capsulare ) Colonizzazione delle mucose 55

56 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Adesività Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati epiteli: Esiste uno spettro S. mitistutta la mucosa buccale S. salivariuslingua e gengive S. pyogenesfaringe e tonsille N. gonorrhoeae uretra V. cholerae intestino tenue E. coli ileo, colon,tratto urogenitale, ecc. Tossine ciliostatiche Colonizzazione delle mucose 56

57 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Fibronectina Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così l’adesione dei gram-negativi. La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi organici, viene escreta nelle cavità naturali dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un reticolo fibrillare. La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella differenziazione cellulare. 57

58 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Acquisizione di patogeni potenziali: malattia di base Durante il decorso di varie affezioni si determinano variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose) con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e riduzione della popolazione batterica gram-positiva Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica normale dell’orofaringe Variazioni con la durata della degenza (stesso reparto) 58

59 Dinamica delle Popolazioni Batteriche FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONE BATTERICA RESIDENTE La presenza di fibronectina in: ferite accidentali o causate da strumenti, sulla superficie di cateteri predispone all’invasività di cocchi gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che possiedono sulla loro superficie recettori per la fibronectina con la quale creano un legame molto stabile. La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri gram- positivi produttori di slime che li rende immuni da qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei macrofagi. 59

60 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Fibronectina: un modulatore della popolazione batterica residente Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel plasma Conseguenze Riduzione di fibronectina dalla superficie cellulare scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi colonizzazione da parte di bacilli gram-negativi Produzione di proteasi batterica e dell’ospite? Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di colonizzazione. 60

61 Immunità naturale e Immunità acquisita: Immunità naturale: dovuta non dal contatto con l’antigene ma dal genotipo. Es. malattie che colpiscono certe specie e non altre. Nell’uomo certe razze, certi gruppi etnici ecc. resistenza individuale diversa, nutrizione età, malattie varie. Immunità acquisita: passiva dovuta alla somministrazione di anticorpi specifici che danno una copertura temporanea, ma può consentire una immediata ed elevata risposta anticorpale. E’ passiva l’immunità acquisita dalla madre attraverso il flusso sanguigno ed il colostro. 61

62 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Immunità attiva e Immunità umorale Immunità attiva dovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiede tempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente Immunità umorale produzione attiva di anticorpi neutralizzano tossine e prodotti cellulari effetto battericida diretto o litico con il complemento bloccano l’abilità infettiva dell’agente agglutinano i batteri facilita la fagocitosi opsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie che possono limitare la fagocitosi 62

63 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sopravvivenza alla superficie delle mucose Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma questo anche nei tessuti profondi) i batteri si moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori attraverso la produzione di sostanze variamente tossiche. Queste proteine vengono secrete da appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri possono traslocare nel citosol della cellula eucariotica le proteine effettrici che interferiscono con il signalling eucariotico, compromettendo le funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi o alterano strutture particolari e causano necrosi 63

64 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Invasione Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri: collagenasi: distrugge il collageno coagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureus ialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo) streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina dal plasminogeno, dissolve i coaguli emolisine: lisano i globuli rossi proteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine dell’ospite. La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici, proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei fagociti). 64

65 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Penetrazione nei tessuti profondi Mucosa Sottomucosa Tessuti profondi Via ematica/linfatica Tutto l’organismo 65

66 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Penetrazione nei tessuti profondi Il danneggiamento dell’epitelio mucoso è per molti batteri la strada per raggiungere la sottomucosa, altri quali Salmonelle e Shigelle utilizzano peculiari meccanismi invasivi che consentono di penetrare direttamente nelle cellule dell’epitelio mucoso. 66

67 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o resistenza al killing dei fagociti) moltiplicazione Tempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?) (situazione simile a chemostato*, ma effetto del s.i.) Siderofori ecc. Tropismo d’organo * sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano scorie 67

68 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Capsula Contrasta gli effetti potenzialmente nocivi dell’interazione adesine-recettore fagocita Maschera le adesine, varia la carica di superficie batterica Ostacola la deposizione di C3b e l’ancoraggio di Ab Strategia + comune nei G+ Nei G- mancata produzione di fimbrie Colonizzazione delle mucose 68

69 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi Una volta all’interno di fagociti professionali, alcuni batteri patogeni sono in grado di evadere dal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi), mentre altri sono in grado di moltiplicarsi all’interno del fagosoma alterando la membrana impedendo la fusione con il lisosoma, oppure produzione di catalasi e SOD per contrastare i meccanismi di killing ossigeno-dipendenti, eliminado i derivati dell’ossigeno molecolare provvisti di azione microbicida (perossido di idrogeno, anione superossido etc). 69

70 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 70

71 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa. 71

72 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 72

73 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Produzione di metaboliti Sono costituiti da prodotti originati dalla crescita batterica in seguito alla demolizione di composti complessi, molti di questi, come l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o comunque composti organici possono esercitare un effetto tossico sulle cellule. 73

74 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Potere aggressivo dei batteri Sostanze non tossiche: capsula, coagulasi, catalasi (H 2 O 2 ) SOD (O 2 - ), collagenasi, ialuronidasi ecc. Sostanze tossiche: Esotossine: esocitate, proteiche Endotossine: legate al batterio LPS Divisione non netta i.e. endotossine proteiche: V. cholerae 74

75 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Differenze tra esotossine ed endotossine ESOTOSSINE Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate concentrazioni nei terreni Polipeptidi PM Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente distrutta col calore>60° Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti titoli di antitossina che neutralizza la tossina Convertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi, calore ecc. Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in mg o meno Non producono febbre nell’ospite 75

76 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Differenze tra esotossine ed endotossine ENDOTOSSINE Parte integrante della parete dei gram-negativi Complesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la porzione responsabile della tossicità Stabile al calore>60° per ore senza perdere tossicità Non stimola la formazione di antitossina La parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la produzione di anticorpi (Antigene somatico O) Non è convertibile in anatossina Debolmente tossico per animali anche a dosi di mg Spesso causa febbre 76

77 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Classificazione delle esotossine TOSSINE CITOLITICHE Attive sulla membrana delle cellule TOSSINE NEUROTROPE Attive sulle cellule del sistema nervoso TOSSINE ENTEROTOSSICHE Attive sulle cellule della mucosa intestinale TOSSINE PANTROPE Attive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica 77

78 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Tossine emolitiche Formazione di pori attraverso la membrana Attività fosfolipasica che idrolizza la fosforilcolina della membrana Fig 7.3 LA placa 78

79 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie cellulare Tossina esfoliativa  sindrome cute ustionata Tossine emolitiche (emolisine o citolisine) 79

80 Dinamica delle Popolazioni Batteriche TOSSINE ENTEROTOSSICHE Citotossiche che causano danni evidenti alle cellule Citotoniche danni non evidenti Colerica è il prototipo ( daltons) Subunità A e 5-6 subunità B identiche Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della A La A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva in modo permanente l’adenilciclasi questo provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti (perdita di acqua attraverso il lume intestinale) Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e S. enteritidis 80

81 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 81

82 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Tossina pertossica 82

83 Dinamica delle Popolazioni Batteriche L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1. Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con un meccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degli amminoacidi sulla catena peptidica nascente. Tossina della pertosse. Proteina ( D) composta da 5 subunità. La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno della membrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolge attività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gs mantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosse interagisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente. 83

84 Dinamica delle Popolazioni Batteriche TOSSINE PANTROPE Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di D unita da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti A e B che restano uniti da S-S. Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale il frammento A penetra all’interno. Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando la traslocazione sul ribosoma. Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP, non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta. 84

85 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Esotossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare 85

86 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti componenti A e B che sono secreti separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio, possiedono tutte un attività catalitica ADP- ribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio l’actina. C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp. Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella. induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e il blocco del ciclo cellulare Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi. 86

87 Dinamica delle Popolazioni Batteriche TOSSINE NEUROTROPE Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNC Botulinica attiva sulle cellule del sistema periferico La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida (meccanismo non noto) La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a livello presinaptico (paralisi spastica) 87

88 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia GABA 88

89 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 89

90 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 90

91 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Tossina botulinica Sulla base del valore di LD50 di circa 1 ng/kg [3], poche centinaia di grammi di questa tossina potrebbero teoricamente uccidere ogni essere umano presente sulla Terra (a scopo comparativo, la stricnina richiederebbe 400 tonnellate per uccidere ogni essere umano). Generalmente le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento ingerito.LD50[3] stricnina

92 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 92

93 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Endotossina Glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l’idrosolubilità e la struttura 93

94 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Endotossina LPS si lega a proteina di memb. CD14 (recettore) dei macrofagi Le LBP prodotte dal fegato e presenti in circolo si combinano con LPS e catalizzano il suo trasferimento sul macrofago e il legame con CD14 Recettori Tlr presenti sui macrofagi in contatto con LPS legato a CD14, trasducono il segnale di membrana  rilascio citochine 94

95 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Endotossina In passato si riteneva che LPS agisse direttamente sulle membrane biologiche Oggi si sa che: stimola i macrofagi al rilascio di sostanze che sono le reali effettrici dell’attività tossica Attiva la cascata del complemento Attiva la cascata della coagulazione 95

96 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 96

97 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Effetti dell'endotossina - febbre (attivazione di IL-l) -neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi -ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi -ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di liquidi -anormale perfusione di organi essenziali -attivazione del complemento - disseminata coagulazione intravascolare -reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata) 97

98 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Superantigene Alcune tossine particolari liberate da alcuni patogeni attivano le cellule T senza richiesta di antigene, si legano al recettore di queste cellule sia a quello del complesso maggiore di istocompatibilità che può scatenare una risposta immune nei confronti delle stesse cellule, quindi molto rischioso. Esempi di queste tossine sono quelle dello shock tossico di S.aureus e quelle eritrogeniche di S.pyogenes. 98

99 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia superantigeni Enterotossine stafilococciche TSST (Tossina dello Shock Tossico) T. pirogeniche streptococciche Devono parte della loro tossicità a: Specifica attività enzimatica (es. attivazione interleuchina Sono fortemente pirogene Interagiscono con i L T, attivazione e moltiplicazione in % amplificata (2-20% vs % normale Ag) 99

100 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia A.L’antigene convenzionale, internalizzato ed elaborato dalla cellula viene esposto nel contesto del MHC II al riconoscimento del TCR con specifica capacità combinatoria A.Il superantigene lega direttamente, senza precedente internaliz. ed elaboraz., le proteine del MHC II e il TCR 100

101 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Infiammazione Si ha in risposta di infezione batterica, ma in particolare per i virus, si ha un eccesso di risposta immune in proporzione al processo infettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, ma anche streptococchi (febbre reumatica) 101

102 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 102

103 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 103

104 Dinamica delle Popolazioni Batteriche IgA Le IgA o immunoglobuline secretorie si trovano in tutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Si formano, attraverso la cattura, da parte delle cellule M (microfold) che sono localizzate nei pressi delle placche del Peyer, di corpi estranei, virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule non hanno attività fagocitaria, presentano quindi l’antigene ai macrofagi sottostanti che lo digeriscono e lo presentano alle cellule T che elaborano le IgA specifiche, in questo modo l’organismo ha immunoglobuline per contrastare l’invasione dei microorganismi più frequentemente presenti. 104

105 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 105

106 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 106 IgA La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.

107 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Infezioni polimicrobiche Possono essere più gravi di quelle causate da un singolo patogeno quando le interazioni tra le singole specie trasformano un’infezione mista in una INFEZIONE SINERGICA 107

108 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico E’ un fenomeno comune e importante nella produzione di infezioni miste di aerobi ed anaerobi specie in tessuti a lento ricambio o drenaggio o dove l’eliminazione dei patogeni è rallentato 108

109 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico E’ un fenomeno ben documentato nelle infezioni sperimentali intraddominali tessuti molli setticemie dentali ginecologiche 109

110 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico E’ un fenomeno ben documentato nelle infezioni sperimentali Da peritoniti sono stati isolati i vari microorganismi in coltura pura: Rinoculati in animali Singola specie: innocua Coltura mista: palese infezione 110

111 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico (ipotesi) Favorevoli modifiche dell’ambiente Provvedere a nutrienti essenziali Provvedere a fattori di virulenza Modulare la risposta immunitaria Protezione reciproca nei confronti degli agenti antibatterici 111

112 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Favorevoli modifiche all’ambiente Il consumo di O 2 da parte dei batteri aerobi nella popolazione mista produce condizioni favorevoli alla proliferazione degli anaerobi, i quali a loro volta proteggono i batteri aerobi dalla fagocitosi Il basso pH dovuto al metabolismo di molti aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli per lo sviluppo di anaerobi e acidofili 112

113 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Favorevoli modifiche all’ambiente Molte specie aerobie che producono capsula (E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae) raramente producono ascessi se agiscono come unico patogeno mentre il Bacteroides fragilis (anaerobio) produce una capsula che è in grado di promuovere la formazione di ascessi 113

114 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Favorevoli modifiche all’ambiente ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTO La formazione sinergistica di un ascesso provvede: una barriera alla diffusione degli agenti antibatterici una barriera ai fattori dell’immunità dell’ospite allo sviluppo di più specie batteriche che: >elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi, cinasi anti aminoglicosidi ecc.) >causano strette condizioni di anaerobiosi che compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni così come la fagocitosi 114

115 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Provvedere a nutrienti essenziali (commensalismo) Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone) che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per esprimere la virulenza S.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguis I treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico) liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi) Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla popolazione microbica normale (PMN) Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato dagli altri commensali 115

116 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Provvedere a fattori di virulenza Fusobacterium necrophorum elabora una leucocidina che protegge Corynebacterium pyogenes dall’attività battericida dei leucociti. (C.pyogenes produce un fattore di crescita per F.necrophorum) S.aureus produce ialuronidasi che esalta l’attività necrotica degli streptococchi anaerobi e conduce alla distruzione dei tessuti 116

117 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Modulazione della risposta immunitaria Nelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività di: opsonizzazione chemiotassi dei neutrofili produzione di ossigeno batteriocidia Attraverso il meccanismo di: diminuzione delle opsonine del siero produzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico) tossici per la fagocitosi produzione di leucocidine 117

118 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Protezione reciproca nei confronti degli agenti antimicrobici B.fragilis e altre specie anaerobie producono β- lattamasi Nelle infezioni miste questi enzimi proteggono le specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi antibiotici (patogenicità indiretta) B.fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante popolazione batterica mista 118

119 Dinamica delle Popolazioni Batteriche INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico Strategie terapeutiche L’eliminazione selettiva di un componente della popolazione mista fa fallire il sinergismo batterico Farmaci a spettro ristretto Eliminazione di tutti i patogeni in causa Antibiotici ad ampio spettro usualmente β-lattamici in caso di allergie: macrolidi o altri agenti 119

120 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola la fagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae) Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersi dalle difese in generale S.aureus Fibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggere l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti opportunisti) Compromettere la funzionalità dei fagociti e delle cellule ciliate: Bordetelle Produzione di enzimi citotossici: S.aureus, S.pyogenes, Pseudomonas spp. A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi (Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma e lisozima (Gonococchi, Micobatteri) 120

121 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrina Sfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula (pneumococchi) Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella meningite infantile Cattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficie esterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum) Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig che provoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus) 121

122 Dinamica delle Popolazioni Batteriche

123 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite Fase aerobia (aerobi, >>>ATP) Fase anaerobia (aerobi, <<

124 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione lenta Fase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig e a molti antibiotici, tasso di crescita Induzione di forme filamentose Quorum sensing, attivazione di alcune funzioni cellulari mediate da ferormoni (in funzione del numero) Attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile 124

125 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 125 S. pneumoniae S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state of genetic competence under conditions of high cell density in response to a secreted signaling peptide (QS). Only a fraction of the S. pneumoniae cells become competent in response to the peptide autoinducer and elaborate a bacteriocin that causes the lysis of noncompetent cells. The lysed cells release not only transforming DNA and nutrients but also pneumolysin and other factors important for virulence. S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose which facilitates invasion of its host.

126 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza La vita dei microorganismi è prevalentemente sessile e solo una frazione minima (<0,1 %) mantiene uno stato planctonico 126

127 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza La semplice adesione ad una superficie, attiva nel microorganismo l’espressione di molti geni che codificano sia per tutti i prodotti deputati alla vita sessile sia quelli che sono coinvolti nei meccanismi di patogenicità e virulenza 127

128 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza Una volta che i batteri sono adesi, essi si organizzano in microcolonie. Questo fenomeno implica la presenza di un biofilm, ove i microorganismi sono immersi, costituito da polisaccaridi e prodotti metabolici che, come già detto, mediano adesività tra i microorganismi e gli epiteli e tra i batteri stessi. 128

129 Biofilm : una resistenza fenotipica Dunne WM Jr. Clin Microbiol Rev 2002;15:

130 Fasi del biofilm rilascioorganizzazione adesione Salvatorelli G. et al.Biofilms: stato dell’arte l’INTERNISTA, 10 (4), 2002 Biofilm : una strategia batterica Dunne WM Jr. Clin Microbiol Rev 2002;15:

131 Biofilm : i riflessi negativi !.. Protezione vs anticorpi Ridotta attività PMN nessuna fagocitosi Rilascio di enzimi inattivanti gli ATB Solo gli elementi planctonici sono distrutti : normali processi di difesa antibiotici Lewis K et al : Antimicrob Agents Chemother 2001;45:

132 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza Il biofilm rappresenta un nido di microorganismi anche quando tutte le forme planctoniche sono state uccise. Questo spiega perché i cateteri colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni con scarse possibilità di successo terapeutico. 132

133 Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nature Rev. Drug Discov. 2: , 2003 Potera C. Forging a link between biofilms and disease. Science 283: , 1999 Impianto su superfici mucose Center for Disease Control and Prevention stima che la formazione di biofilm sia implicata almeno nel 65-80% di tutte le infezioni di tutte le infezioni croniche e/o recidivanti. croniche e/o recidivanti. Biofilm i n patologia umana 133

134 Biofilm batterici e Infezioni recidivanti Endocarditi: valvole naturali o artificiali Quadri legati a inserzione di cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali Otiti,sinusiti Prostatiti, uretriti,cistiti infezioni vie biliari Fibrosi cistica Riacutizzazioni di BPCO Costerton JW e al :science 1999;284 :

135 “ Biofilm “ su superfici inerti 135

136 “ Biofilm “ su superfici inerti 136

137 Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: Prevenire la formazione di biofilm Disgregare biofilm, già esistenti Eradicare i microrganismi negli strati più profondi del biofilm Attacco al Biofilm 137

138 Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003 La strategia terapeutica deve tener conto che gli antibiotici attualmente in uso sono stati sviluppati e studiati per agire contro batteri planctonici e non organizzati in biofilm Attacco al Biofilm 138

139 Attacco al Biofilm Eradicare le cellule planctoniche ! responsabili dell’episodio acuto, per ritardare : colonizzazione, potenziale produzione di biofilm recidivare dell’infezione Kobayashi H. Int J Antimicrob Agents 2001 ; 17:

140 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza Nel loro insieme queste osservazioni indicano che la fase planctonica è quella che favorisce la disseminazione della vita microbica, mentre la fase sessile all’interno del biofilm è favorevole alla sopravvivenza. 140

141 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Altre strategie batteriche Il biofilm come fattore di patogenicità e virulenza Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla presenza nell’ambiente di un fattore prodotto dagli stessi microorganismi autoinducente che a sua volta dipende dal numero dei batteri, il fenomeno è noto come quorum sensing 141

142 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia Quorum Sensing 142

143 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri Quorum sensing E’ stato identificato nel 1970 su un batterio luminescente il Vibrio fischeri che colonizza un cefalopodo. Il microorganismo è presente in mare ad una concentrazione di circa 100 cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del pesce raggiunge cell/ml e diviene luminescente. 143

144 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri Quorum sensing I batteri elaborano un prodotto specie specifico (omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove permane e si accumula. Quando la concentrazione raggiunge un limite condizionato dal numero dei batteri presenti si ha induzione del gene bersaglio. 144

145 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Quorum sensing Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in molte specie ed è tutto da valorizzare. E’ un sistema molto economico per rivelare la propria presenza solo quando il numero è sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi (nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di patogenicità e virulenza, ecc.) 145

146 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Quorum sensing Applicazioni E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi caratteri di patogenicità. Si possono rendere innocui i patogeni eliminando il loro sistema quorum sensing? 146

147 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Quorum sensing Applicazioni Trovare composti che funzionano come gli autoinduttori ma bloccano il gene Furanone è stato trovato in un’alga ha dimostrato di interferire con il quorum sensing di Serratia liquefaciens. 147

148 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 148 I Gram-positivi causano effetti simili ma usano mediatori diversi

149 Dinamica delle Popolazioni Batteriche La scoperta dei sistemi quorum sensing nei batteri gram-negativi ha non solo approfondito le nostre conoscenze sulla patogenesi delle infezioni causate da questi organismi ma potrebbe anche provvedere ai mezzi per il trattamento di queste comuni ed importanti infezioni Hartman and Wise

150 E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratteristiche molto diverse da quelle che mostrano in coltura in laboratorio L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e alla sopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati a moltiplicarsi nell’uomo o negli animali Questi microorganismi hanno sviluppato risposte sofisticate alle variazioni ambientali 150

151 Quando le condizioni ambientali non sono idonee alla crescita, i batteri entrano in una fase programmata di sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno attivo e rende il batterio più resistente. Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle capacità adesive Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana, degli aa della parete Cambiamento di forma Topologia del cromosoma 151

152 152

153 I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI AMBIENTALI MEDIANTE Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei nutrienti presenti in concentrazioni ridotte Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo scopo di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in concentrazioni ridotte Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrienti presenti in eccesso Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo scopo di evitare possibili blocchi Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la crescita bilanciata 153

154 VBNC viable but non culturable (Xu et al. 1982) I batteri in stato VBNC sono metabolicamente attivi ma non sono in grado di attuare i processi divisionali che portano alla formazione di colonia sui terreni di coltura normalmente utilizzati per il loro rilevamento 154

155 FATTORI CHE INFLUENZANO L’ATTIVAZIONE DELLO STATO VBNC Scarsità di nutrienti Temperatura Luce Salinità Pressione idrostatica Ossigeno 155

156 ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE POSSONO ATTIVARE LO STATO VBNC Aeromonas Agrobacterium Alcaligenes Campylobacter Enterobacter Pseudomonas Rhizobium Salmonella Shigella Vibrio Yersinia Enterococcus Escherichia Helicobacter Klebsiella Legionella Micrococcus 156

157 SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA VITALITA’ BATTERICA Conta Vitale Diretta (DVC) Immunofluorescenza - Conta Vitale Diretta (DFA-DVC) Colorazione con cloruro di tetrazolio (CTC) Colorazione con “Live/Dead bacLight Viability kit” Ricerca di RNA messaggero (RT-PCR) Ricerca di antigeni specifici dello stato VBNC 157

158 Le cellule non coltivabili (VBNC, stressate) possono rappresentare un problema per la salute pubblica se non rilevate con saggi adeguati 158

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164 a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladder epithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immune effectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in the exposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant to neutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cells to begin the process again. Filamentation of bacteria in response to environmental cues. 164

165 Filamentation of bacteria in response to environmental cues. b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species, including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulates filamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists. Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in the environment and the depletion of non-Flectobacillus species 165

166 Filamentation of bacteria in response to environmental cues. c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number of similar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteria respond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although a mechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that this morphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from the host immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell division is restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue. 166

167 Filamentation of bacteria in response to environmental cues. d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β ‑ lactam antibiotics in vitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive. The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example, Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics of similar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The mechanisms and consequences of this response have not yet been explored. 167

168 168

169 INVASIONE CELLULARE da parte di batteri enteropatogeni 169

170 Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo? I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in cellule che non sono fagociti professionisti. I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale, aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la barriera naturale, estremamente impermeabile, rappresentata dalle cellule epiteliali Esempi: Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis Shigella spp. Salmonella spp. Listeria monocytogenes 170

171 Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-intestinale 171

172 La barriera dell‘epitelio intestinale 172

173 Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di linfociti B circondato da linfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino tenue. L’epitelio sovrastante le placche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passaggio di particelle nel tessuto linfoide sottostante. La superficie basolaterale invaginata forma una superficie dove migrano linfociti e macrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nella tasca. 173

174 Fattori che determinano se il batterio sarà internalizzato o no: Natura del recettore sulla cellula ospite Forza dell’interazione Capacità del batterio di inviare segnali che stimolano o antagonizzano l’internalizzazione 174

175 STUDI IN VITRO E IN VIVO Colture cellulari Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’invasione batterica: sistema eccellente, riproducibile e non complicato, ma con diverse limitazioni Modelli animali Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vitro, possono essere poi verificati in modelli animali 175

176 Meccanismi di invasione cellulare Trigger Zipper Yersinia, ListeriaSalmonella, Shigella 176

177 Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non professionisti in vitro Sono coinvolte almeno due proteine di superficie: Internalina (InlA): proteina di superficie che è ancorata covalentemente alla parete InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete 177

178 in vivo I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os con Listeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA Listeria wt causa una malattia sistemica in topi transgenici che esprimono caderina E umana negli enterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci di attraversare la barriera intestinale efficientemente Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contrario di cellule che esprimono E-cadherina umana, non permettono ingresso di Listeria via inlA la specie specificità è dovuta a differenze in un singolo aa 178

179 Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria 179

180 180

181 Motilità dipendente dalla polimerizzazione di actina Polimerizzazione dell’actina con formazione di code Si muove nel citoplasma Invade le cellule adiacenti ActA: proteina di 90 kDa, determina il reclutamento e l’assemblaggio dei filamenti Localizzata ad una estremità del batterio Velocità: 1um/sec 181

182 I batteri a contatto con la membrana plasmatica continuano a muoversi Producono protusioni che si estendono nella cellula adiacente: listeriopodi Si forma una vescicola con due membrane e la cellula si libera nel citoplasma Listeriolisina PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC) Metallo proteasi: trasforma il precursore di PC- PLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa) Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli diversi nei due compartimenti che formano il vacuolo Pseudopodi: 40 um Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal vacuolo secondario Per la fuoriuscita dai vacuoli: 182

183 plcB hlyA actA hlyA plcA inlA/B inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi); actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi) 183

184 184

185 The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virulence plasmid VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidica VirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa. Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes spa surface presentation of invasion plasmid antigens spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica. IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta 185

186 IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)- ABCD Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi FATTORI DI VIRULENZA plasmidici IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo IpaA (30 kDa) IpaB (62 kDa), IpaC (42 kDa), e IpaD (35 kDa) in condizioni non secretorie sono accumulate nel citoplasma legate ad una proteina di 18 kDa (IpgC) che ne impedisce l’aggregazione e la digestione VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidica VirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa. 186

187 IcsA ( VirG) : una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica. IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta FATTORI DI VIRULENZA spa surface presentation of invasion plasmid antigens mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes. spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula 187

188 Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa: invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa proteins and surface presentation of antigens A 37°C, VIRF e VIRB attivano operon spa, mxi e ipa invasion plasmid antigens ipa, surface presentation of invasion plasmid antigens spa, membrane excretion of Ipa mxi, virulence vir genes. 188

189 Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa: invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of antigens 189

190 190

191 191

192 Cytoskeletal rearrangements induced during Shigella invasion of epithelial cells. Shigella secretes the effector proteins, such as IpaB, IpaC, IpaA and VirA, into host cells. IpaB and IpaC are integrated into the host membrane, and IpaC modulates Cdc42- dependent filopodial formation which, in turn, may cause activation of Rac1 and lamellipodial formation. IpaA binds vinculin, and the resulting IpaA−vinculin complex promotes depolymerization of actin filaments, which is thought to be required for modulation of lamellipodial formation. VirA binds / -tubulin heterodimers and induces MT destabilization. VirA-induced MT destabilization would in turn lead to MT growth and stimulation of the Rac1 activity, and thus evoke the local membrane ruffling. 192


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