Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il.

Presentazione sul tema: "Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il."— Transcript della presentazione:

1 Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa Le tecniche sono molto utilizzate in campo ambientale, biologico, farmaceutico, ecc., essendo particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica

2 La separazione dei componenti di una miscela si ottiene in seguito alle interazioni chimiche o fisiche che avvengono tra le molecole disciolte nella fase mobile e la fase stazionaria: queste interazioni possono avvenire con la superficie adsorbente del supporto solido, o con un liquido che ricopre il supporto in modo omogeneo o ancora con molecole ad esso legate in maniera covalente. Dal momento che i diversi componenti della miscela da separare interagiscono in maniera differente con la fase stazionaria, si muovono lungo la colonna cromatografica con velocità diverse: i composti che sono più “affini” alla fase stazionaria si muovono in media più lentamente di quelli che sono più “affini” alla fase mobile. La condizione base della cromatografia è l’instaurarsi di un equilibrio di ripartizione tra due fasi, di cui una mobile, che produce una velocità di migrazione dipendente dall’affinità relativa per le due fasi

3 La Nascita della Cromatografia
Mikhail S. Tsvett (1872–1919) La nascita della cromatografia si deve al botanico russo Mikhail Semenovich Tswett, che per primo la utilizzò nel 1903 per separare i pigmenti naturali contenuti in estratti vegetali. Scrive Tswett nel 1906: “Se una soluzione di clorofilla in etere di petrolio è filtrata attraverso una colonna di adsorbente – io utilizzo soprattutto carbonato di calcio, accuratamente pressato, all'interno di uno stretto tubo di vetro – allora i pigmenti, si separano, secondo la sequenza di adsorbimento, dall'alto in basso, in molte zone colorate […] Proprio come i raggi di luce nello spettro, i diversi componenti della miscela appaiono separati, sulla colonna di carbonato di calcio, secondo una legge e possono essere misurati sia in modo qualitativo che quantitativo. Io chiamo questa preparazione cromatogramma ed il metodo corrispondente lo chiamo metodo cromatografico. Ovviamente i fenomeni di adsorbimento fin qui descritti non sono ristretti ai soli pigmenti della clorofilla ed è lecito presumere che tutti i composti chimici, sia colorati che incolori, siano soggetti alle stesse leggi.” Michail Tswett, madre italiana e da padre russo, nasce ad Asti nel Sua madre morì poco dopo e Michail crebbe a Ginevra, dove ottenne il baccalaureato al Dipartimento di Fisica e Matematica nel 1893. Dottorato di ricerca in botanica nel 1896 per il suo lavoro sulla fisiologia cellulare. Nello stesso anno si trasferì a Pietroburgo. Nel 1897 divenne insegnante di un corso di botanica per donne. Nel 1902 divenne assistente di laboratorio all'istituto di fisiologia vegetale dell‘Università d Varsavia. Nel 1903 divenne professore associato e insegnò anche in altre università di Varsavia. Dopo l'inizio della prima guerra mondiale, il Politecnico di Varsavia fu evacuato a Mosca e nel 1916 a Leninskij Gorkij vicino a Mosca. Nel 1917 divenne professore di botanica e direttore degli orti botanici dell‘Università di Tartu (Jurjev) in Estonia. Nel 1918, quando le truppe tedesche occuparono la città, l'università fu evacuata a Voronez, nella Russia centromeridionale. Tswett morì per un‘infiammazione cronica alla gola il 26 giugno1919, all'età di 47 anni.

4 Nell’esperimento di Tswett, la fase stazionaria era carbonato di calcio mentre la fase mobile o eluente era etere di petrolio, un solvente organico composto da idrocarburi a basso punto di ebollizione. I composti da separare sono introdotti nella fase mobile e si ripartiscono lungo la colonna cromatografica in funzione della loro affinità relativa per la fase mobile e per la fase stazionaria. Tswett morì nel e non potè continuare la sua opera. Fun un vero peccato, perchè aveva intuito molte delle caratteristiche necessarie per rendere “efficiente” la cromatografia.

5 La cromatografia è nata dunque all’inizio del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, ma già il suo inventore era consapevole delle sue potenzialità applicative Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett Tswett scrisse in russo i rendiconti dei suoi esperimenti, per cui la sua opera rimase a lungo sconosciuta

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7 Twsett era uno spirito inquieto e mobile, in quanto rimangono tracce di suoi soggiorni - spesso con collaborazioni scientifiche - in università tedesche, olandesi, belghe e francesi. Nel 1910 era apparsa una sua importante opera di, intitolata "Cromofille dei regni vegetale e animale", in cui erano descritte dettagliatamente sia le tecniche sperimentali , scritto però in russo. Il chimico tedesco Willstätter si era fatto tradurre per uso privato il libro di Twsett e questa traduzione, passata nelle mani del suo allievo Kuhn. Nel1930, ad appena 22 anni, Edgard Lederer era giunto per il suo lavoro di postdottorato sui pigmenti della carota ad Heidelberg, nel laboratorio diretto da Kuhn , messo sulla strada giusta dalla lettura di un libro sui carotenoidi dell'americano L.S. Palmer, edito nel 1922, dove si faceva riferimento al volume di Twsett. La scienza è spesso influenzata da avvenimenti casuali: Sorprendentemente, nel 1930 Lederer venne in possesso della 'traduzione privata‘ del libro di Tswett e così riprese il cammino della cromatografia.

8 Richard Kuhn (1900-1967) Edgar Lederer (1908-1988)

9 "for their invention of partition chromatography"
Ancora prima del suo ingresso all'Università di Cambridge Archer Martin era affascinato sia dagli aspetti chimico-fisici della distillazione, sia dalle grandi colonne con cui le operazioni di separazione venivano realizzate nell'industria chimica. In realtà la sua vocazione era sospesa fra la biochimica e l'ingegneria chimica, ma la prima ebbe il sopravvento e nel 1933, dopo un anno di tirocinio post-laurea nel laboratorio di chimica-fisica, Martin entrò nel Dunn Nutritional Laboratory della sua Università, per cercare di isolare la vitamina E, allora sconosciuta. Fu qui che nello stesso anno avvenne il suo primo incontro con la cromatografia: Winterstein, che si trovava in visita in Inghilterra proveniendo dal laboratorio di Kuhn a Heidelberg, tenne una dimostrazione sulla separazione dei caroteni con una colonna di solfato di calcio. Secondo la testimonianza dello stesso Martin egli fu colpito dalla relazione fra il cromatogramma e le colonne di distillazione, tuttavia - per il momento - il suo interessamento non andò oltre. Per un po' di tempo 'giocò' con marchingegni costruiti con imbuti separatori posti in serie (fino a sei), poi cominciò a progettare macchine che potessero eseguire un'estrazione in controcorrente. La macchina 'finale' era costituita da 45 tubi da mezzo pollice, lunghi circa un metro e mezzo, assemblati verticalmente e connessi in modo tale che ciascuno di loro potesse alternativamente iniettare (dall'alto) la fase pesante nel tubo successivo e ricevere (dal basso) la fase leggera proveniente dal tubo precedente. Le novanta valvole a biglia che impedivano ai liquidi di rifluire "facevano un rumore come quello del mare sulla ghiaia". Così Martin fu in grado di separare la vitamina E in diverse frazioni, completando la sua tesi di dottorato.            La passione per le macchine non abbandonò Martin nemmeno dopo il suo incontro nel 1937 con Richard Synge, che aveva appena ottenuto una generosissima borsa di studio dell'International Wool Secretariat. La vocazione di Synge, decisamente orientata verso la biochimica, era stata rafforzata dalle lunghe ore di laboratorio, durante le quali Norman Pirie, un chimico fisico che allora stava lavorando sul virus del mosaico del tabacco, alleviava il noioso rigore delle tecniche di separazione con "aneddoti caustici tratti dalla storia della biochimica". Synge definì questa forma di insegnamento utile "per sviluppare la capacità di critica in chi ne possedesse un rudimento". Nel 1937 Synge aveva visto il suo primo cromatogramma, ottenuto dai pigmenti del riccio di mare: "tutti stavano a guardare con gli occhi sgranati ma nessuno avanzava una spiegazione di come potessero avvenire quelle indubbie separazioni". I due giovani familiarizzarono subito: nella loro collaborazione Synge aveva portato con sè il problema - collegato alla borsa di studio - della composizione in amminoacidi delle proteine della lana, e Martin aveva messo a disposizione la sua abilità teorico-pratiche nella progettazione e costruzione delle sue macchine per la separazione in controcorrente fra liquidi immiscibili. Synge aveva già studiato la distribuzione dei derivati acetilati degli amminoacidi fra cloroformio e acqua, ma le  macchine realizzate da Martin non erano adatte ai due solventi proposti da Synge, così che il 'progettista' si mise al lavoro, prima a Cambridge, poi a Leeds, presso i Wool Industries Research Laboratories. La sua nuova macchina richiedeva una settimana di lavoro continuo per una separazione, doveva essere continuamente sorvegliata, in una stanza satura di vapori di cloroformio, da uno dei due ricercatori. Malgrado tutte queste difficoltà i due portano a termine questa ricerca nel 1940, ma nel frattempo si era aperto un orizzonte del tutto diverso. Pescando ancora fra i suoi ricordi Synge ha raccontato che Martin interpretava secondo la teoria della ripartizione controcorrente i risultati che occasionalmente ottenevano con cromatografie su colonna, e che - ad un certo punto - si chiesero se non era il caso di tener ferma una fase liquida e di porre il campione al punto di entrata della fase mobile "come se fosse un cromatogramma". Synge si dice sicuro che fu "questo scarto verbale che ci spinse a passare alla cromatografia liquido- liquido". La nuova direzione fu imboccata di gran carriera, con un nuovo apparato progettato da Martin e con della silice presa dalla custodia di una bilancia, macinata, setacciata e impregnata di acqua. Gli amminoacidi acetilati erano posti all'imbocco della colonna ed eluiti con cloroformio; poiché non si vedeva alcuna banda, dopo il primo giorno di prove i due ricercatori aggiunsero metilarancio alla fase stazionaria e poterono seguire il percorso degli amminoacidi come bande colorate di rosso. Già con questo apparto primitivo trenta centimetri di colonna erano più efficaci di tutte le macchine realizzate fino ad allora. Nei mesi successivi cercarono di migliorare le prestazioni della silice (Martin: "non capivamo mai nei dettagli quanto stavamo facendo"), e finalmente presentarono i loro primi risultati ad una riunione londinese della Biochemical Society, il 7 giugno 1941. Nel novembre di quello stesso anno Martin e Synge mandarono due articoli fondamentali  al Biochemical Journal. Nel primo venivano poste le basi della teoria della cromatografia di partizione, la cui efficacia era saggiata con miscele di quattordici amminoacidi; nel secondo, scritto in collaborazione con A.Gordon, erano descritti i risultati ottenuti dagli idrolizzati acidi di alcune proteine, ed erano discusse le diverse teorie proposte a proposito dei legami presenti negli amminoacidi basici. Con questi lavori si apriva alla chimica delle proteine un nuovo, vastissimo orizzonte, e tuttavia la collaborazione di Martin e Synge non doveva essre fertile sono in questa direzione. Malgrado ogni sforzo le loro colonne non erano in grado di separare gli amminoacidi dicarbossilici e quelli basici. Essi si rivolsero così alla cromatografia su carta, di cui c'erano parecchi precedenti in letteratura, specie nel campo della chimica dei coloranti. Gordon trovò sul Beilstein una reazione con la ninidrina che permetteva di evidenziate le macchie di amminoacidi sulla carta. Anche qui, dopo vari tentativi, giunsero a mettere a punto una tecnica la cui sensibilità era tale che per un certo periodo le macchie corrispondenti ad alcuni amminoacidi ebbero una "barba rosa". Ci volle qualche tempo prima che Martin, Synge e Gordon capissero che era il rame contenuto nell'aria stessa di Leeds che formava dei complessi contaminanti con i loro amminoacidi. Archer Martin ( ) Richard Synge ( The Nobel Prize in Chemistry 1952 was awarded jointly to Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge  "for their invention of partition chromatography"

10 LONGITUDINAL DIFFUSION AND RESISTANCE TO MASS
TRANSFER AS CAUSES OF NONIDEALITY IN CHROMATOGRAPHY J. J. VAN DEEMTER, F. J. ZUIDERWEG Koninklijke/Shell-Laboratorium, Amsterdam (N.V. De Bataafsche Petroleum Maatschappij) and A. KLINKENBERG N. V. De Bataafsche Petroleum Maatschappij, The Hague (Received 1 February 1956) Chem. Engng Sci. 5, , 1956.

11 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzando colonne di farina fossile. M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in un estratto di foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche il nome cromatografia che significa "scrittura mediante il colore". R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione di carotenoidi e xantofille. 1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia su strato sottile 1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sulla cromatografia di ripartizione. Essi introdussero la teoria dei piatti basata su di un'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione controcorrente. 1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per lo sviluppo della cromatografia di ripartizione. Nello stesso anno, in collaborazione con A.T.James realizza la cromatografia gas-liquido. 1956 J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica. 1958 E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile. 1966 Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad alta prestazione. Verso la fine degli anni 20 l’opera di Tswett venne riscoperta e tradotta in inglese. Lo sviluppo della cromatografia potè così riprendere.

12 Giddings sviluppa ulteriormente la teoria della cromatografia ed inventa la field flow fractionation
J. Calvin Giddings ( )

13 R.A. Dewar (1908-1981) I.G. McWilliam (1933) V. Pretorius (1928-1989)
Il rivelatore a ionizzazione di fiamma fu inventato indipendentemente da due gruppi di ricercatori in Australia e Sud Africa

14 Nel 1957 M:J.E. Golay realizza le colonne capillari di vetro e ne sviluppa la teoria

15 -James Lovelock in 2005 James lovelock, genio multiforme, formula nel 1979 l’ipotesi Gaia, il pianeta vivente. È anche l’inventore del rivelatore a cattura di elettroni

16 Basi del procedimento cromatografico
Il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico. La fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che deve essere immiscibile nell’eluente. La fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana. La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione Kd=Cs/Cm)

17 Visualizzazione della separazione
Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluato (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempo di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo

18 Forma generale delle isoterme di adsorbimento

19 ISOTERME DI RIPARTIZIONE
Picco gaussiano

20 ISOTERME NON LINEARI

21 PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA
Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m): Xm  Xs Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è definito come: A: il campione viene iniettato all’entrata della colonna B  D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria A B C D Flusso del solvente

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23 Tempo di ritenzione Il tempo di ritenzione tR è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse: il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, tM il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo tR > tM

24 Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k’. Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’. poiché CS / CM = KA . VS / VM = ψ; k’A = KA × ψ. Ma k’ è anche uguale al rapporto dei tempi, per cui La quantità è uguale alla concentrazione x il volume. * Il rapporto tra le quantità è uguale al rapporto dei tempi che la specie chimica passa nelle due fasi: (tR-tM) e tM Rispettivamente La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B> (tR)A.

25 tR – tM / tM = VR - VM / VM = KA × VS / VM
Se con Q indichiamo la portata della fase mobile (in inglese “flow rate”), Q = V/t; t =V/Q, ed essendo Q=costante, se indichiamo il volume di ritensione con VR ed il volume di fase mobile con VM, abbiamo tR – tM / tM = VR - VM / VM = KA × VS / VM VR - VM = KA × VS; V’R = KA × VS

26 RELAZIONI TERMODINAMICHE
La costante di equilibrio tra le fasi può essere messa in relazione con la energia libera del processo (funzione di Gibbs) log K = - ΔG0/2,3RT E ricordando la relazione tra K e k’ log k’ = log VS/VM - ΔG0/2,3RT Log k’ = logψ - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R

27 log VR’ = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R – log Vs
Ma anche log K = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R log VR’ = - ΔH0/2,3RT + ΔS0/2,3R – log Vs

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29 EQUILIBRI CHIMICI SECONDARI
Quando più di un processo contribuisce alla ritenzione, trascurando gli effetti di correlazione, possiamo scrivere: k’ = Σi ψi Ki = Σi k’ i Se fi e fj sono, rispettivamente, la frazione di soluto in forma i e j si ha: k’ = fi k’i +fj k’j Es. AH ↔ A– + H+ ; Ka = [A–] [H+] / [AH] ; f– = [A–] / [AH] + [A–] f– = 1/{1 + ([H+] / Ka)} ; k’ = 1/{1 + ([H+] / Ka)} k’ A–+ (1 - f–) k’ AH

30 Dispersion Forces Ud = 3hν0α2 /4r6
London's dispersion forces arise from charge fluctuations throughout a molecule resulting from electron/nuclei vibrations. Ud = 3hν0α2 /4r6 where (α) is the polarizability of the molecule, (ν0) is a characteristic frequency of the molecule, (h) is Plank's constant, and (r) is the distance between the molecules

31 Dipole-Dipole Interactions
The interaction energy (UP) between two dipolar molecules is given, to a first approximation, by Up =2α2µ2 /r6 where (α) is the polarizability of the molecule, (µ) is the dipole moment of the molecule, and (r) is the distance between the molecules.

32 Dipole-Induced-Dipole Interactions

33 Ionic Forces

34 Interazione soluto-fasi
Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni: In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals formazione di composti di interazione attrazione coulombiana interazioni steriche

35 Hydrophobic and Hydrophilic Interactions
n-heptane and water are immiscible, not because water molecules repel n-heptane molecules, they are immiscible because the forces between two n-heptane molecules and the forces between two water molecules are much greater than the forces between a n-heptane molecule and a water molecule. Thus, water molecules and n-heptane molecules interact very much more strongly with themselves than with each other.

36 Molecular Forces and Chromatographic Selectivity
To choose a suitable stationary phase for a particular separation it is necessary to select a substance with which the solutes will interact relatively strongly. If the solutes to be separated are predominantly dispersive, then a hydrocarbon-like stationary phase would be appropriate.

37 Chromatogram of the Hydrocarbons Contained in Unleaded Gasoline Using a Dispersive (Non-polar) Stationary Phase

38 Two separations by GC illustrate the different selectivity that can be obtained by using dispersive or polar stationary phases Polyethylene Glycol (polar) Carbopack (dispersive)

39 IONIC INTERACTION

40 Meccanismi della separazione
In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in: Il meccanismo di esclusione dimensionale è dovuto solo all’ingombro sterico è non prevede interazioni con la fase stazionaria. adsorbimento ripartizione scambio ionico affinità esclusione

41 Adsorbimento La fase stazionaria è un solido di granulometria piccola, impaccato in colonna o steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica

42 Ripartizione La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile

43 Scambio ionico La fase stazionaria è costituita da un polimero o da silice contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC) La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili

44 Affinità In questo caso si utilizzano reazioni di tipo chimico o biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC) La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico

45 Esclusione dimensionale
La fase stazionaria è un solido poroso o un gel. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) con le varianti Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua e Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua La tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni

46 CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI
Non è più usata

47 Equilibrio tra le fasi Dc = C1/C2, dove C indica la somma della concentrazione delle varie forme in cui può essere presente la sostanza che si ripartisce tra le fasi. Equilibrio prima dopo Concentrazione C1 Volume V V1 Concentrazione C C2 Volume V V2 FASE 1 FASE 2