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Selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, Metodi altamente specifici METODI IMMUNOMETRICI complesso analita-anticorpo analita +

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Presentazione sul tema: "Selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, Metodi altamente specifici METODI IMMUNOMETRICI complesso analita-anticorpo analita +"— Transcript della presentazione:

1 Selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, Metodi altamente specifici METODI IMMUNOMETRICI complesso analita-anticorpo analita + anticorpo quantificazione del complesso analita-anticorpo quantificazione del complesso analita-anticorpo

2 L’avidità del legame analita-anticorpo si misura con la costante di affinità K aff. Un anticorpo idoneo per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una K eq > M -1 EDTA: acido etilendiaminotetracetico K M-EDTA AgEDTA 3- CaEDTA 2- FeEDTA 2- HgEDTA M M M M -1 Complesso METODI IMMUNOMETRICI Per confronto, si riportano le costanti termodinamiche di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante poliamminocarbossilico, che forma complessi chelati molto stabili con numerosi ioni metallici

3 1942Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluorescina. 1959Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche. 1969Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide. 1969Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA). 1971Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida. 1972Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT). 1975Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel METODI IMMUNOMETRICI: STORIA

4 Caratteristiche fondamentali di un anticorpo sono l’affinità (misurata in termini chimico-fisici dalla costante di equilibrio K) e la specificità (capacità di riconoscere l’analita, distinguendolo da molecole a struttura simile).Gli anticorpi più comunemente utilizzati per lo sviluppo di metodi immunometrici sono le immunoglobuline G (IgG). La regione variabile Fab è responsabile del legame altamente specifico con l’antigene; la regione costante Fc CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI catena pesante catena leggera variabile costante legame Ag sito legame Ag sito

5 Ponti disolfuro catena L catena H Digestione con Papaina Digestion e con Pepsina Riduzione con Mercaptoetanolo catena L catena H frammenti Fc Fab Fc F(ab’) 2 Sono stati messi a punto diversi protocolli di digestione delle IgG che permettono di ottenere specifiche porzioni della immunoglobulina. CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI

6 epitopo paratopo CDR antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena frammento Fab frammento Fc frammento Fab Catena H Catena L In dettaglio è mostrata la porzione Fab dell’anticorpo, con il sito di legame con l’antigene. CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI

7 macrofago Antigene T-dipendente T linfocita BB IgMIgEIgG B linfocita IgG Antigene T-indipendente CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita; IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene; IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari; IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi; IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.).

8 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO L’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole. AntigeneAnticorpo

9 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ANTIGENEANTICORPO Ponti idrogeno Legami ionici Interazioni idrofobiche Interazioni di Van der Waals Legami ionici

10 INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Forze non covalenti Forze elettrostatiche Legami idrogeno Forze di Van der Waals Forze idrofobiche Origine Attrazione tra cariche opposte Lo ioni idrogeno condiviso tra gruppi diversi crea parziali cariche opposte Le fluttuazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole generano polarità opposte su atomi vicini I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevol- mente con l’acqua e tendono a raggrupparsi insieme per escludere le molecole di acqua. L’attrazione coinvolge anche forze di Van der Waals

11 Si tratta di polimeri con tasche di legame selettive per l’analita. I polimeri sartoriali sono stati utilizzati per diverse applicazioni: metodi immunometrici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi, ecc.. POLIMERI “SARTORIALI” ( I ) MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

12 La scelta dei monomeri è critica per l’ottenimento di un polimero in grado di legare con buona selettività ed affinità l’analita. analita monomeri funzionali cross-linker complesso di pre-polimerizzazione analita-monomeri POLIMERI “SARTORIALI” ( II ) MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

13 POLIMERI “SARTORIALI” ( III ) MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

14 Vantaggi: Avidità e selettività di legame confrontabili con quelle degli anticorpi; Elevata stabilità fisica Disponibili in quantità illimitate e stabili per lunghi periodi di conservazione; Possibilità di utilizzare le particelle per impaccare delle colonne per cromatografia di affinità. POLIMERI “SARTORIALI” ( IV ) MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

15 Svantaggi: sono preparati in un solvente organico condizioni di polimerizzazione il processo di triturazione e setacciatura per ottenere particelle di polimero nell’intervallo dimensionale desiderato è lungo e laborioso e comporta una grossa perdita di polimero (circa 50%); rimozione dell’analita POLIMERI “SARTORIALI” ( V ) MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

16 Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da) e in questo caso viene chiamato antigene, altrimenti deve essere coniugato con una macromolecola. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. COME SI OTTIENE UN ANTICORPO L’antigene viene somministrato Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)

17 Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente anticorpi “eterogenei” detti: policlonali. È possibile ottenere anticorpi “omogenei” detti: monoclonali. Per questo occorre, dopo avere immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di cellule B attraverso la creazione di ibridomi. ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI

18 PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

19 Antisiero policlonaleAnticorpi monoclonali IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI

20 CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI VantaggiSvantaggi Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene Solitamente caratterizzati da elevata specificità Spesso caratterizzati da bassa affinità

21 Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: k a e k d sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e K eq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’analita. Anticorpi con K eq  L mol -1 sono adatti per lo sviluppo di metodi immunometrici. AbAn + An-Ab kaka kdkd K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq kaka kdkd = ASPETTI TERMODINAMICI INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

22 Riprendendo l’equazione: [An-Ab] eq [An] eq = K eq Ab t - K eq [An-Ab] eq SCATCHARD PLOT si definisce Ab t = [Ab] eq + [An-Ab] eq Riarrangiando l’equazione ed introducendo Ab t si ottiene: K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq kaka kdkd =

23 [An-Ab] eq [An] eq = K eq Ab t - K eq [An-Ab] eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, SCATCHARD PLOT

24 anticorpi monoclonali High affinity Low affinity Ab t K eq SCATCHARD PLOT anticorpi policlonali

25 [An-Ab] [An-Ab]/[An] Retta 1 Retta 2 Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla K eq massima ed alla K eq minima. La retta 1 viene estrapolata per [An-Ab] eq che tende a zero. La retta 2 viene estrapolata per [An-Ab]/[An] eq che tende a zero. EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO La K eq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo: eterogeneità specificità SCATCHARD PLOT

26 Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi. ANTIGENI ED APTENI anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene Sintesi derivato aptene braccio spaziatore aptene carrier +a) +

27 naphtalene antracene fenantrene acenaphtene acenaphtylene fluorene pyrene crysene Benzo[a]anthracene Benzo[a]pyrene dibenzo[a,h]anthracene fluorantene Benzo[e]pyrene Benzo[k]fluoranthene Benzo[b]fluorantene Indeno[1,2,3cd]pyreneBenzo[g,h,i]perylene ANTIGENI ED APTENI Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici

28 Specificità e struttura immunogeno Posizione e tipo di derivato utilizzato per la produzione dell’anticorpo 100%40%100% Scarsa specificità per mancanza anche dell’anello aromatico L’anticorpo è molto specifico per il BaP e gli altri IPA non interferiscono [BaP μg/L Segnale Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). Si definisce reattività crociata la tendenza dell’anticorpo a legare gli interferenti.

29 Tipo di derivato e specificità dell’Anticorpo Braccio spaziatore aptene proteina estrone estriolo C16 C17 Esempio: 17β-Estradiolo proteina

30 Esempio:produzione di un anticorpo anti-estradiolo. estradiolo C6 C16 C17 SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI estrioloestrone 3,8  1,2 % 5,6  2,0 % 48  8 % Reattività crociata 40  10 % 5,0  1,8 % 0,48  0,27 % estroneestriolo C6 C16 C17 Derivatizzazione La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno.

31 Metodi immunologici per ioni metallici Si produce un anticorpo contro un chelate metal-ion -protein: per esempio Me-EDTA-BSA L’anticorpo non riconosce il metallo ma l’intero complesso Me-EDTA Me Ү Me + EDTA proteina GSH Me Ү Si produce un anticorpo contro un complesso Me-Proteina o Me-Molecola organica: Il GSH, i suoi gruppi tiolici liberi legano fortemente il Hg(II).L’Anticorpo riconosce il complesso Me-GSH Me + GSH proteina

32 TRACCIANTI La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile Per esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile An + Ab An-Ab

33 TRACCIANTI La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità. 123 aggiunta reattivi reazione separazione libero legato analita tracciante Conc. analita Tracciante legato

34 Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare: un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA) un enzima (enzyme immunoassay, EIA) un substrato enzimatico un coenzima o un inibitore enzimatico una molecola fluorescente o un quencher Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. TRACCIANTI

35 SCELTA DEL TRACCIANTE Amplificazione enzimatica: 1 molecola di enzima 1000 molecole di prodotto Aumenta con: - attività enzimatica - rivelabilità del prodotto - amplificazione ciclica Luminescenza Analita—Enzima Substrato Prodotto Fotometria Fluorescenza Analita— 125 I emissione  1 disintegrazione/sec molecole (10 6 ) Analita—Chemilum. Reaz. chimica I c h I c aumenta con:  cl (resa quantica) f (rapporto molecole chemilum/analita) I c = f c cl  cl Analita—Fluoroforo I 0 h I f h ’ I f aumenta con: I 0 (intensità del raggio di eccitazione)  (coefficiente di estinzione) c (concentrazione) I f = I 0   F cd

36 Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa ( g) e facilmente rivelabile TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE SCELTA DEL TRACCIANTE – I emissioneMolecola chemiluminescente – I fluorescenteMolecola fluorescente – Amplificazione ciclica enzimatica – Fluorescenza – Luminescenza – AssorbanzaEnzima 0.1 – 10 x ≈ dpm 125 I MASSA (moli/tubo) SEGNALETRACCIANTE

37 SCELTA DEL TRACCIANTE TRACCIANTI LUMINESCENTI moli (Bronstein et al. 1989)Fosfatasi alcalina/ adamantil-1,2-diossietano- fenil-fosfato moli (Tsuji et al. 1986)Glucosio 6-fosfato deidrogenasi / perossidasi / isoluminolo < moli (Kricka et al. 1987) 8x moli (Motsenbocker 1988) Perossidasi / luminolo / enhancer Enzima: chemiluminescenza moli (Woodhead et al. 1982)Fluorescina 2x moli (Soini e Kojola 1983)Ioni europio (III)Fluorescenza moli (Geiger e Miska 1987) moli (Tanaka e Ishikawa 1986) Luc / luciferina con amplificazione enzimatica 5.6x10 16 fotoni/min/mg luciferasi (attività specifica) (Wulff et al. 1982) moli (Schram et al. 1981) Luciferasi da lucciola (Luc) / luciferina Bioluminescenza Limite di rivelazioneEsempiTipo di tracciante

38 Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. E S La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

39 Perché è possibile utilizzare un enzima come marcatore? Occorre ottimizzare la strategia di preoarazone del tracciante, cioè dell’antigene marcato. La sintesi dell’immunogeno viene eseguita in modo da ottenere un elevato rapporto di coniugazione aptene/proteina. La sintesi del tracciante enzimatico viene condotta in modo da ottenere un basso rapporto di coniugazione aptene/proteina. E METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

40 Un enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere: sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente si esprime in unità per mg (U/mg).

41 Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione. METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)

42 L’attività enzimatica viene misurata valutando la velocità della reazione enzimatica in condizioni di eccesso di substrato. Si può scegliere di misurare la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a 1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di eccesso di substrato. La velocità di una reazione enzimatica si esprime come quantità di substrato trasformato nell’unità di tempo. La misura del prodotto della reazione enzimatica è proporzionale alla concentrazione dell’enzima se: - l’andamento della reazione è lineare nel tempo - l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta dienzima. MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

43 Tempo μmol di prodotto formato x nmol di enzima 2x nmol di enzima 4x nmol di enzima 10 min20 min La comparsa del prodotto in un tempo lungo (10 o 20 minuti) non è proporzionale alla quantità di enzima. Occorre quindi considerare la velocità iniziale della reazione. MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

44 Secondo l’equazione di Michaelis-Menten: Vvelocità della reazione V max velocità massima della reazione (enzima saturato dal substrato) [S]concentrazione del substrato K m costante di Michaelis-Menten Se [S] >> K m, ne consegue che V = V max, quindi: tempo prodotto Quantità di enzima velocità iniziale della reazione MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

45 La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite fotometria. L’uso di substrati fluorescenti o luminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo. TRACCIANTI ENZIMATICI Luminescenza 2-naphthyl-  -D- galactopyranoside Fluorimetria4-metilumbelliferone Fotometria2-nitrofenolo  -galattosidasi LuminescenzaAMPPD Fluorimetria4-metilumbelliferone-fosfato Fotometria4-nitrofenilfosfatoFosfatasi alcalina LuminescenzaH 2 O 2 /luminolo FotometriaH 2 O 2 /cromogenoPerossidasi METODOLOGIA ANALITICA SISTEMA DI RIVELAZIONEENZIMA

46 SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile. I0I0 I b c A FOTOMETRIA

47 ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO          o-fenilendiammina2,3-diamminofenazina (DAP) arancio max =492 nm perossidasi H2O2H2O2 FOTOMETRIA

48 Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare  è il rapporto tra il numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti): dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di rilassamento non-radiativo. ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente. La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate, successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni. FLUORESCENZA

49       Assorbimento molecolare l 1 l 5 Energia l 1 ’ l 5 ’   Conversione interna Rilassamento vibrazionale   Fluorescenza   Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica (diagramma di Jablonski) FLUORESCENZA

50 La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato. Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni. CHEMILUMINESCENZA ReagentiIntermedio [ Prodotti ]* Prodotti + h stadio 1stadio 2 stadio 3

51 L'efficienza di un processo di chemiluminescenza,  CL, è definita dalla relazione:  CL = fotoni emessi molecole reagenti Se  Int = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio),  SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato)  Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni) l' efficienza del processo di chemiluminescenza è:  CL =  Int  SE  Em CHEMILUMINESCENZA

52 Ossidazione del luminolo (3-aminoftalidrazide) in ambiente alcalino mediante perossido d’idrogeno o altri agenti ossidanti, quali i perossidi organici. La reazione può essere catalizzata da enzimi quali la perossidasi, la microperossidasi e le catalasi, nonché da altre sostanze quali emoglobina, citocromo c, ione Fe 3+ e vari complessi di metalli di transizione. Il prodotto di ossidazione del luminolo é l'anione amminoftalato nello stato eccitato, che é responsabile dell’emissione ( max = 420 nm). Si possono usare "enhancer" quali il p-iodofenolo CHEMILUMINESCENZA

53 La reazione del luminolo può essere utilizzata per la misura dell’attività del tracciante enzimatico perossidasi, operando in eccesso di substrato. In alternativa, è possibile utilizzare il luminolo come tracciante. Sono stati sintetizzati derivati isoluminolo-antigene o isoluminolo-anticorpo. Biotina-isoluminolo Proteina-isoluminolo Generalmente è preferibile utilizzare l’enzima come marcatore, ottenendo così: l’amplificazione del segnale una cinetica di emissione caratterizzata da uno stato stazionario. CHEMILUMINESCENZA

54 Decomposizione dell'adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato (AMPPD) catalizzata dall'enzima fosfatasi alcalina (AP) in ambiente acquoso. L'AMPPD, che contiene un anello di tipo diossietano, viene defosforilato in presenza dell'enzima. Il prodotto della reazione si scinde in due frammenti carbonilici, uno dei quali é in uno stato eccitato e può dare luogo a luminescenza. CHEMILUMINESCENZA

55 I metodi immunometrici possono essere classificati in: segnale log concentrazione analita Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione, la curva dose-risposta ha forma sigmoidale. segnale concentrazione analita Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la curva dose-risposta è lineare. CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI

56 I metodi immunometrici possono essere distinti in: Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida. CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI

57 CARATTERISTICHE DEI METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

58 IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I) Fisica (adsorbimento)Chimica Biotina-avidinaProteina AAnticorpo IgG anti- coniglio (Fc specifico) da capra IgG anti- analita da coniglio METODI ETEROGENEI

59 IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO Fisica (adsorbimento) L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH forza ionica; temperatura; tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica le interazioni aspecifiche possono essere notevolmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP). METODI ETEROGENEI

60 Proteine legate  g/sfera Aspecifici % Riproducibilità media  DS Capacità legante % polistirene1.5<  idrazide  alchilammina  METODI ETEROGENEI METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE

61 IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO Anticorpi di cattura Fc specifici Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per legare l’antigene Anticorpi di cattura Fab specifici Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene METODI ETEROGENEI

62 I metodi immunometrici possono essere distinti in: Competitivi (modulazione di attività) Non competitivi (amplificazione di attività) CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI

63 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Anticorpo immobilizzato Antigene Tracciante Substrato enzimatico DIRETTI METODI ETEROGENEI COMPETITIVI

64 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

65 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

66 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

67 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

68 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

69 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI ETEROGENEI COMPETITIVI DIRETTI

70 123 aggiunta reattivi reazione separazione libero legato analita tracciante Conc. analita Tracciante legato METODI ETEROGENEI COMPETITIVI Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo.

71 Analita libero Analita immobilizzato Anticorpo anti-analita E Anticorpo anti-IgG marcato METODI ETEROGENEI COMPETITIVI INDIRETTI

72 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Anticorpo immobilizzato Antigene Tracciante Substrato enzimatico DIRETTI METODI ETEROGENEI COMPETITIVI Enzima: ELISA (Enzyme Linked immunoassorbent assay)

73 Per sviluppare un metodo competitivo per un aptene occorre coniugare l’aptene: ad una proteina carrier per la produzione dell’immunogeno ad un enzima per la produzione del tracciante. Occorre quindi sintetizzare un derivato dell’aptene, in modo da: introdurre nell’aptene un gruppo reattivo in grado di reagire con le proteine introdurre il gruppo reattivo sull’aptene al termine di un braccio spaziatore, in modo che l’aptene venga poi inserito ad una certa distanza dalla superficie della proteina e possa liberamente essere riconosciuto e legato dall’anticorpo. SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI

74 Nei sistemi omologhi lo stesso derivato dell’aptene viene utilizzato per la sintesi dell’immunogeno e del tracciante. Nei sistemi eterologhi immunogeno e tracciante sono sintetizzati utilizzando:  due apteni simili ma non identici, con lo stesso ponte inserito nella stessa posizione (eterologia di aptene);  lo stesso aptene, ma con un diverso ponte che unisce l’aptene alla proteina (eterologia di ponte);  lo stesso aptene e lo stesso ponte, ma inserito in una posizione differente dell’aptene (eterologia di posizione). I sistemi eterologhi permettono di ottenere anticorpi con affinità maggiore per l’analita rispetto al tracciante, quindi di migliorare il limite di rivelazione del metodo. SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI

75 Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo. METODI OMOGENEI COMPETITIVI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I)

76 S S P Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. Sono stati proposti due sistemi. conc. analita attività enzimatica METODI OMOGENEI COMPETITIVI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II) 1° sistema:

77 S S P conc. analita attività enzimatica METODI OMOGENEI COMPETITIVI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III) Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. 2° sistema:

78 L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola. Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, la luce emessa sarà parallela a quella assorbita. luce assorbitaluce emessa fluoroforo METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I)

79 Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato (  ) e dal movimento rotatorio della molecola. Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenutaLa polarizzazione viene persa METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II)

80 Per eseguire la misura, il campione viene eccitato alternativamente con luce polarizzata orizzontalmente e verticalmente. Il grado di polarizzazione (P) viene calcolato come: dove: I VV = segnale quando si misura l’emissione sul piano parallelo a quello di eccitazione (si eccita sul piano verticale, si misura sul piano verticale). I HV = segnale quando si misura l’emissione sul piano perpendicolare a quello di eccitazione (si eccita sul piano orizzontale, si misura sul piano verticale). METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III)

81 A valori costanti di  (tempo di emivita dello stato eccitato) il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende solo dal tempo di rilassamento rotazionale della molecola (  ).  = 3  vM / RT dove  è la viscosità del mezzo, v è il volume specifico parziale (mL/g) ed M è il peso molecolare del fluoroforo, R è la costante dei gas e T è la temperatura. Maggiore è il peso molecolare del fluoroforo, maggiore sarà il suo tempo di rilassamento rotazionale (~ 4,3 nsec per la fluorescina e ~ 100 nsec per una immunoglobulina). METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV)

82 La relazione che lega il grado di polarizzazione (P) al tempo di rilassamento rotazionale della molecola (  ) ed al tempo di emivita dello stato eccitato (  ) è: (1/P – 1/3) = (1/P 0 – 1/3)(1 + 3  /  ) dove P 0 è il valore di polarizzazione limitante, cioè il massimo grado di polarizzazione che si ottiene quando tutte le molecole sono ferme nello spazio. Combinando questa equazione con la precedente: 1/P = 1P 0 + {1/P 0 – 1/3} x RT/vM x   Il valore di polarizzazione misurato fornisce quindi una misura diretta delle dimensioni del fluoroforo a temperatura e viscosità costanti. METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V)

83 Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di rotazione di circa 100 ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 1 ns. Metodi immunometrici competitivi omogenei sono stati sviluppati. Il tracciante legato all’anticorpo mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Si può quindi ottenere una curva dose-risposta senza la necessità di separare la frazione di tracciante libero da quello legato prima della misura. METODI OMOGENEI COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI)

84 S S P1 P2 In presenza di piccole quantità di analita, il tracciante interagisce con l’enzima immobilizzato sull’anticorpo, che trasforma P1 in un prodotto misurabile (P2). S S P1 Q In presenza di elevate quantità di analita, il tracciante, che non si lega all’anticorpo, interagisce con un enzima in soluzione che trasforma P1 in un prodotto non misurabile (Q). Questo riduce il segnale di fondo. L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad un enzima. METODI OMOGENEI COMPETITIVI ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay)

85 La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). Riducendo la concentrazione dell’anticorpo e del tracciante è possibile ottenere un limite di rivelazione più basso. Tuttavia, per la legge di azione di massa, a basse concentrazioni di reagenti la velocità di formazione del complesso si riduce, quindi l’accuratezza del metodo sarà inferiore. L’equilibrio che si instaura è: An + Ab An-Ab + An* An*-Ab K An K An* Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*] i = costante [Ab] i = costante [Ab] i < [An] i + [An*] i PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI

86 segnale log concentrazione analita Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI

87 AbAn + An-Ab Ka Kd Dove: [Ab] eq = concentrazione di anticorpo libero all’equilibrio [An] eq = concentrazione di analita libero all’equilibrio [An-Ab] eq = concentrazione di complesso analita-anticorpo all’equilibrio Si indica con: Ab t = concentrazione totale di anticorpo = [Ab] eq + [An-Ab] eq T = concentrazione totale di analita = [An] eq + [An-Ab] eq ovvero = [An] i + [An*] i (dove An è l’analita nel campione e An* è l’analita marcato) R = [An-Ab] eq /T, cioè frazione di analita legato. Questa è la variabile che viene di solito determinata nei metodi immunometrici. PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO

88 che può essere risolta per R (frazione di analita legato) in funzione di [An] i, [An*] i, Ab t e K. Se tre di queste variabili sono costanti, è possibile osservare l’effetto della quarta sull’andamento di R. PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO si può scrivere come: K eq = [An-Ab] eq [An] eq [Ab] eq K eq = [An-Ab] eq (Ab t -[An-Ab] eq ) (T-[An-Ab] eq ) dividendo per T e sapendo che [An-Ab] = RT: K eq = R (Ab t -RT) (1-R) poiché T = [An] i +[An*] i e riarrangiando: K eq (1<-R) (Ab t -R[An] i -R[An*] i ) = R R 2 - R + = 0 ([An] i +[An*] i +Ab t +1/K) ([An] i +[An*] i ) Ab t ([An] i +[An*] i ) si ricava l’equazione:

89 EFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPO Una riduzione di Ab t sposta la curva a concentrazioni di analita più basse (confronto tra curve verde e blu). Un aumento di K aumenta la sensibilità (confronto tra curve blu e rossa). K=10 10 L mol -1 Ab t = M K=10 10 L mol -1 Ab t =10 -9 M K=10 10 L mol -1 Ab t = M K=10 10 L mol -1 Ab t =10 -9 M K=10 11 L mol -1 Ab t = M K=10 11 L mol -1 Ab t = M K=10 10 L mol -1 Ab t = M Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M) Curve teoriche di legame per un metodo immunometrico competitivo ,0 0,8 0,6 0,4 0,2 R, frazione di antigene legato PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO

90 R, frazione di antigene legato Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M) An*=0 An*=10ng/mL An*=30ng/mL An*=100ng/mL K=10 10 Lmol -1 Ab t =3X M ,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Una riduzione di An* aumenta la sensibilità del metodo. EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An* PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO

91 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%) yAyA yByB yCyC xAxA xBxB xCxC xAxA xBxB xCxC xAxA xBxB xCxC  y =  10% RISPOSTA DOSE

92 Le reazioni analita-anticorpo sono caratterizzate da elevata specificità, definita come la capacità dell’anticorpo di legare selettivamente l’analita e non altre specie (interferenti) simili. La specificità dell’anticorpo non è sempre assoluta. Si definisce reattività crociata la sua tendenza a legare gli interferenti. Tra i vari modi per misurarla, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. [An-Ab]/[An] [An] ab SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

93 B/B 0 log concentrazione analita La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B 0 (rapporto tra segnale dello standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B 0 è il segnale ottenuto in assenza di analita B è il segnale a concentrazione x di analita B/B 0 rappresenta quindi la frazione di tracciante che è stato spiazzato in presenza della concentrazione x di analita 1. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

94 c a a/2 y x b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N a c a+d 2 y x d b = fattore di pendenza(*) x = dose y = B L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

95 LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose- risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

96 Si utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da ottenere il massimo segnale dall’analita. Determinazioni anche a basse concentrazioni di analita. Segnale Concentrazione analita La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con- centrazione di analita. METODI NON COMPETITIVI

97 Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag][Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab* Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei METODI NON COMPETITIVI

98 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Anticorpo di cattura immobilizzato Antigene Tracciante Enzima Substrato enzimatico Anticorpo di rivelazione METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

99 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

100 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

101 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

102 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

103 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

104 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

105 DIRETTIINDIRETTI

106 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida Antigene di cattura immobilizzato Anticorpo Tracciante Enzima Substrato enzimatico Anticorpo specie- specifico METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

107 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

108 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

109 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

110 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

111 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

112 Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

113 Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc... substrato prodotto intermedio prodotto finale METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

114 SISTEMAINDICATORI i 1 /i 2 SUBSTRATIPRODOTTI P 1 / P 1 Enzimi vicinali Esochinasi / GPDasi ATP/glucosi o NAD+ Glucosio 6-fpsfato Gluconolattone-6- fosfato + NADH Enzimi vicinali GOasi/ POasi Glucosio/ Donatore H ossidato Perossido/ Donatore H ossidato

115 METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato) alta %P anticorpo analita marcato (in eccesso) bassa %P [analita] %P

116 La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è lineare. Segnale Concentrazione analita Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

117 Segnale concentrazione analita PARAMETRI QUANTITATIVI Sensibilità pendenza della curva Intervallo dinamico Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard del bianco

118 EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) B/B 0 concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione :

119 CARATTERISTICHE Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Specificità intrinseca superiore Limite di rivelazione più basso Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Modulazione di attività (MA) (Metodi competitivi) METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)

120 I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura. INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI

121 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti) VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

122 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

123 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

124 Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche - errori precisione e accuratezza - tempi di esecuzione rapidità VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

125 POSSIBILI FORMATI ANALITICI In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori,...) Piastre microtiter Analizzatori automatici

126 Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua Fase pre-analitica: 1 -diluire il campione d’acqua 1/10- 1/100 v/v con tampone 2 –si aggiunge un eccesso di EDTA Dosaggio immunoenzimatico Si utilizza un anticorpo monoclonale che riconosce il complesso Cd-EDTA Metodi immunologici per ioni metallici

127 Curva di calibrazione Incubazione: 60 min. at 37°C Rivelazione Chemiluminescente del tracciante HRP: H 2 O 2 /luminolo/enhancer Campione Tracciante: Cd(II)-EDTA-HRP Anticorpo immobilizzato Lavaggio Microtiter pozzetti [Cd(II)], μg/L Signale CL Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua Metodi immunologici per ioni metallici

128 GSH campione GSH GS- Hg GSH GS- Hg GSH GS- Hg GSH GS- Hg anticorpo ҮҮ GSH GS- Hg GSH GS- Hg Add HRP-Ab anticorpo ҮҮ ҮҮ HRP substrato Segnale Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale Campioni liquidi : Analisi diretta (solo diluizione) Campioni solidi : Estrazione di Hg(II) con HCl/HNO 3 poi si tampona a pH=7 The extract is added to the microtiter wells where the BSA-GSH is immobilized: the Hg ions bind the glutathione This complex is detected using an antibody anti-BSA-glutatione-Hg and with a secondary HRP labeled antibody Metodi immunologici per ioni metallici

129 : Limite di rivelazione: 0.4 μg/l Specificità: altamente specifico per Hg(II): Quantità richiesta per dare un ‘interferenza (ppm) Mercurio 0.36 Piombo >150,000 Arsenico >55,000 Nichel >43,000 Bario >100,000 Argento > 79,000 Cadmio >82,000 Sodio >17,000; Cromo > 38,000 Stronzio >64,000 Rame > 47,000 Tallio >150,000 Oro > 144,000 Zinco >48,000 Ferro >41,000 Caratteristiche analitiche Metodi immunologici per ioni metallici Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale

130 DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo Ab anti-ferritina marcato con HRP min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione 60 min 37 °C

131 DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

132 Production Of Monoclonal Antibodies Immunisation with antigen Cell line –myeloma P3– NSI/I – Ag4 – 1 X63 – Ag Ab 1 Ab 2 Ab n Ab titre from serum Spleen suspension Fusion with P.E.G. Selection with H.A.T. Screen for Ab – secreting hybrids Clone Ab secreting hybrids Clone 1 Clone 2 Clone n Serum/ascitic fluid containing Ab n In vivo Ab 1 Ab 2 Ab n

133 Production of Stable Antibody Secreting Hybrid 1 st Cloning Hybrid AbHybrid Ab n Hybrid Non Secretor Cell division Hybrid Ab 1 Hybrid Non-Secretor 2 nd Cloning Stable antibody secreting hybrid


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