La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Cromatografia Scrittura del colore Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti,

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Cromatografia Scrittura del colore Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti,"— Transcript della presentazione:

1

2 Cromatografia Scrittura del colore Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo l’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica

3 Cenni storici  : nascita “Cromatografia” grazie a un botanico russo (M. Tswett)  1938: introduzione della T.L.C. e della cromatografia a scambio ionico  1941: cromatografia di ripartizione liquido- liquido  1944: cromatografia su carta  1950: cromatografia a fase inversa  1951: gas-cromatografia  1959: cromatografia a permeazione di gel  1965: cromatografia liquida ad alte prestazioni

4 Principi della cromatografia -la differente velocità di migrazione dei componenti costituenti una miscela (equilibrio dinamico) -Fase mobile (MP), liquida o gassosa -Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su vetro o alluminio o impaccata in una colonna Fase fissa A Fase mobile Fase fissa B Fase mobile Fase fissa C Fase mobile -Spostamento della fase mobile determina l’avanzamento del soluto in essa contenuto mentre le molecole che sono distribuite nella fase stazionaria resteranno momentaneamente ferme

5 X M  X s Soluto X migrerà con una velocità proporzionale a K x o coefficiente di distribuzione tra le due fasi (dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi) Il coefficiente di distribuzione del componente X è definito come: Quale componente ha K maggiore ? A: il campione viene iniettato all’entrata della colonna B  D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria ABCD Flusso del solvente K A ≠ K B ≠ K C

6 V A = 1 V M + V S K A [A] S = 0 A non ha alcuna affinità per la fase fissa e si muove con il fronte della fase mobile [A] M = 0 A non ha alcuna affinità per la fase mobile per cui si distribuisce completamente nella fase fissa senza spostarsi Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il cromatogramma

7 Se [X] f =0 allora V x è max e uguale alla V eluente e il Volume dell’eluente necessario a eluire X è pari al volume dello spazio interstiziale non occupato dalla fase fissa detto volume interstiziale o V m. Se [X] f ≠0 allora V x è < di V eluente e il Volume dell’eluente necessario a eluire X volume di ritenzione V R sarà maggiore del V m. Allora V R -V m = V R ’ o volume netto di ritenzione

8

9 Tempo di ritenzione t M = t 0 = tempo morto t R ’ = t R - t 0 = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso da un dato soluto nella fase stazionaria Il tempo di ritenzione t R è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.

10 Relazioni che quantificano l’interazione di un dato soluto con la fase stazionaria V R = t R. F V m = t 0. F F (velocità di flusso) FATTORE di CAPACITA’ V = velocità lineare media di migrazione di un soluto = L/t R U = velocità lineare media di flusso della fase mobile = L/t 0 V = u. (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile) V = u. [C M.V M /C M V M +C S V S ] C S V S /C M V M V = u. L/t R = L/t K V S /V M t R = t 0 (1 + K V S /V M ) = t 0 (1 + K’) Fattore di ritenzione o rapporto di distribuzione di massa

11 k’ dipende: dalla T° dalla natura delle fasi dalle caratteristiche dell’impaccamento dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria k’ non dipende: dalla lunghezza della colonna dal flusso La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t R ) B > (t R ) A. Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse a parità di eluente Fattore di separazione o Ritenzione relativa

12 Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi): 1)Altezza equivalente di piatto teorico H 2)Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Si può dimostrare che W = larghezza del picco W

13 Separazione ottimale a)separazione con scarsa risoluzione e basso N b)migliora la risoluzione ma è sempre basso N c)ottima risoluzione e buono N Si può dimostrare che:

14

15

16 risoluzione scarsa per scarsa efficienza e scarsa selettività buona risoluzione dovuta a buona efficienza e buona selettività risoluzione scarsa dovuta ad una basso selettività. buona risoluzione dovuta a buona selettività, ma efficienza non troppo elevata Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività).

17

18 Interazione soluto-fasi Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni: legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals formazione di composti di interazione attrazione coulombiana interazioni steriche In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico Meccanismi di separazione ripartizione adsorbimento scambio ionico esclusione affinità

19 Cromatografia Fase mobile: liquidaFase mobile: gassosa CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.) GAS-CROMATOGRAFIA (G.C.) Fase fissa: liquida CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE (L.L.C.) Colonna Strato sottile Carta Fase fissa: solida CROMATOGRAFIA di ASSORBIMENTO (L.S.C.) Colonna/strato sottile CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO (L.S.C.) Colonna/strato sottile GEL CROMATOGRAFIA Colonna/strato sottile CROMATOGRAFIA di AFFINITA’ Fase mobile: fluido supercritico CROMATOGRAFIA LIQUIDA SUPERCRITICA (S.F.C.)

20

21

22 RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte (gel di silice) o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile. ≡ Si-OH + R-SiCl H 2 O ≡ Si-O-Si(OH) 2 -R + 3 HCl La cromatografia di ripartizione è chiamata in fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, mentre è chiamata fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. Si tratta della tecnica più comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche

23 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.) In fase normale Fase stazionaria polare ≡ Si-O-Si(R) 2 -CN ≡ Si-O-Si(R) 2 -NH 2 Fase mobile a bassa polarità Solventi organici Soluzioni acquose (zuccheri, steroidi, amminoacidi, proteine e peptidi) In fase inversa Fase stazionaria apolare ≡ Si-O-Si(CH 3 ) 2 ≡ Si-O-Si-CH 2 -(CH 2 ) 6 -CH 3 ≡ Si-O-Si-CH 2 -(CH 2 ) 16 -CH 3 Fase mobile molto polare Soluzioni acquose o tamponate Miscele acqua/metanolo/acetonitrile (ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)

24

25 ADSORBIMENTO reversibili La fase stazionaria è un solido in polvere (gel di silice o allumina); sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela da separare (ma anche con le molecole d’acqua, disattivandolo). Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas- solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile. Per sostanze molto polari è preferibile usare gel disattivati, mentre per sostanze con bassa polarità si preferiscono le silici non modificate. Le fasi mobili più usate in ordine di polarità crescente e quindi di potere eluente sono: Esano, isottano, cloroformio, acetonitrile, metanolo, acqua.

26 SCAMBIO IONICO La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte (resine sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC) La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili (amminoacidi, nucleosidi, nucleotidi) Resina a scambio cationico: -SO 3 H, -COOH Resina a scambio anionico: -NH 2, -N(CH 3 ) 2 La fase mobile è un tampone anionico (acetato) o cationico (tris) contenenti ioni della stessa carica di quella dei campioni (capacità di spostamento, pH, t °)

27

28 Fase stazionariaFase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato Fase mobile: tampone citrato/acido citrico EluizioneEluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M. Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del pH si avvicinano al loro punto isoelettrico: a pH basso: acidi (es. Asp, Glu) a pH neutro: neutri (es. Gly, Val) a pH basico: basici (es. Lys, Arg) Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco corrisponde un amminoacido.

29 ESCLUSIONE DIMENSIONALE La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono separati in base alla dimensione delle loro molecole. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si comporta da setaccio, intervallo di PM). Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) o Gel permeazione (GPC) o Gel permeazione (GPC) per la separazione di sostanze insolubili in acqua o Gel filtrazione (GFC) o Gel filtrazione (GFC) per la separazione di sostanze solubili in acqua La tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)

30

31 AFFINITA’ reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC). Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori, cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni, anticorpi, ecc… Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a variazioni di pH e di temperatura. La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico

32

33

34

35 Cromatografia classica su colonna Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze. Il riempimento della colonna può essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica. Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto fluire attraverso la colonna.

36

37 Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna. I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione, ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria molto fine (3-10 m) e controllata: in tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo. Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente diventa molto lento. Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

38 HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori A B C A.crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d = 100 m, D = mm, L = cm) B.HPLC con riempimento pellicolare (d = m, D = 1-3 mm, L = cm) C.HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L = cm) d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna

39 LC classica: 1) dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC 2) velocità di flusso molto basse 3) tempi di analisi lunghi HPLC: 1) impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili 2) contropressioni maggiori 3) tempi d’ analisi contenuti Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi canali interparticellari. Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile). La pressione dipende da diversi paramentri: η = viscosità del solvente V = velocità lineare di flusso L = lunghezza della colonna K = costante legata alle caratteristiche fisiche del riempimento della colonna d = diametro della colonna 1 pascal = 1 newton/m 2 = 1x105 bar 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm 2

40 Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro interno di 1-5 mm. Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente sostituita. La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area superficiale (alcune centinaia di m 2 /g). Questa fase stazionaria viene generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie della silice. Fasi polari comuniFasi non polari comuni R = (CH 2 ) 3 NH 2 amminoR = (CH 2 ) 17 CH 3 ottadecile R = (CH 2 ) 3 CNcianoR = (CH 2 ) 7 CH 3 ottile La C18 (anche indicata con ODS) è la fase stazionaria di gran lunga più utilizzata in HPLC

41 riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione colonna cromatografica ed eventuale precolonna rivelatore per monitorare gli eluati PC per gestire il sistema e i dati

42 Eluizione isocratica e a gradiente Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante. Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni. SOLVENTEDEBOLE SOLVENTEFORTE FORZAINTERMEDIA GRADIENTE DI SOLVENTE

43 Sistemi di rivelazione Sensibilità adeguata al problema Buona stabilità e riproducibilità Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza Tempi di risposta rapidi Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti RivelatoreLOD (ng)SelettivitàUtilizzabile in gradiente? Assorbimento UV0.1-1selettivoSI Indice di rifrazione generaleNO Fluorescenza selettivoSI Elettrochimico0.01-1selettivoNO Conduttimetrico0.5-1selettivoNO Assorbimento IR1000selettivoSI Spettrometro di massa0.1-1generaleSI

44

45

46

47 GAS-CROMATOGRAFIA In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria. I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solamente da gas di trasporto(carrier). Condizione indispensabile per operare un’analisi gascromatografica su una miscela è che essa sia in grado di passare in fase vapore alla temperatura di lavoro.

48 VANTAGGI DELLA GC VANTAGGI DELLA GC Poco costosaPoco costosa Altamente sensibile ( g/mL)Altamente sensibile ( g/mL) RobustaRobusta RiproducibileRiproducibile RapidaRapida Separazione di mix complesse (100 analiti in GC-capillare)Separazione di mix complesse (100 analiti in GC-capillare) SVANTAGGI DELLA GC Non applicabile all’analisi di macromolecole, sostanze termolabili, altamente polari o idrofile Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.

49 Trattamento del campione Derivatizzazione: usata per sostanze altobollenti Reagenti sililanti HMDS esametildisilazano (zuccheri) TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici) BSA bistrimetilsililacetamide (alcoli, ammine, acidi carbossilici, fenoli, steroidi, alcaloidi) BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come BSA froma deivati poù volatili) Reagenti acilanti TFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli, fenoli, ammine) PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli, fenoli, ammine) HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli) Reagenti alchilanti TMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2, OH, barbiturici, sedativi, basi xantiniche, alcaloidi fenolici) BF 3 in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi) PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli, tioli e solfonammidi)

50 He, Ar, N 2 SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

51 SISTEMA DI INIEZIONE FUNZIONI: - Introduzione del campione - Evaporazione del campione - Ingresso del gas di trasporto - Collegamento alla colonna L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro. Nelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della miscela (T° °C). Nelle colonne capillari, la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a 100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.

52 COLONNE Per gas-cromatografia Le impaccate (acciaio, vetro o rame) contengono particelle solide inerti di appropriata granulometria, eventualmente imbevute della fase stazionaria liquida (diametro = mm; lunghezza = 6 m). Le impaccate (acciaio, vetro o rame) contengono particelle solide inerti di appropriata granulometria, eventualmente imbevute della fase stazionaria liquida (diametro = mm; lunghezza = 6 m). Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = mm; lunghezza = m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche ) grazie alla loro elevata lunghezza. “canalicoli” dell’impaccata unico “canalone” della capillare W COT= wall-coated-open-tubular S COT= support-coated-open-tubular

53

54 Le fasi stazionarie più usate in GC di adsorbimento sono: Gel di silice Allumina Carbone attivo Carbone grafitizzato Microparticelle sferiche di carbone Zeoliti Sali inorganici I supporti inerti più usati in GC di ripartizione sono: Terra di Diatomee Teflon Microsfere di vetro Le fasi stazionarie più usate (ancorate, legate) sono: Idrocarburi Esteri e poliesteri Polieteri Ammidi, ecc…. Influenza della temperatura sulla corsa cromatografica Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti della miscela. Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.

55 Per tali miscele un temperatura troppo alta consentirebbe una buona separazione dei componenti altobollenti ma ammasserebbe quelli più bassobollenti. Al contrario, una temperatura troppo bassa, non consentirebbe di separare quelli altobollenti.

56 Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede le seguenti tappe: Isoterma iniziale: indica quanto tempo si rimane a una determinata temperatura. Fase di rampa: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con quale velocità. Isoterma finale: indica il tempo che si deve restare alla temperatura più alta. Raffreddamento: si attua dopo la fine della registrazione del cromatogramma

57 45° 145° programma di T

58 Sistemi di rivelazione Sensibilità adeguata al problema Buona stabilità e riproducibilità Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza Tempi di risposta rapidi Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti RivelatoreSelettività Termoconducibilità TCDNon selettivo Insostituibile per l’analisi dei gas Ionizzazione di fiammaPoco selettivo Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalinaselettivo A Cattura di elettroni (ECD)Selettivo Organofosforici, diossine, benzodiazepine Spettrometro di massagenerale

59 Limite di linearità è la concentrazione massima al di là della quale il segnale non è più proporzionale alla concentrazione (con una tolleranza del 5%). Intervallo di linearità range di concentrazioni compresa tra il limite di rivelabilità e il limite di linearità. Intervallo di risposta dinamico intervallo di concentrazioni entro il quale il rivelatore risponde, anche se non in maniera lineare Limite di rivelabilità è la concentrazione minima che dà una risposta doppia del rumore di fondo Limite intervallo di risposta dinamico; oltre questa concentrazione non si possono fare misure

60 Riassumendo analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici  Gascromatografia analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili  Cromatografia liquida

61 La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un campo magnetico e da un campo elettrico oscillanti su due piani perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda. Parametri che descrivono la natura ondulatoria dell’onda: -Lunghezza d’onda : distanza tra i due massimi o tra i due minimi. -Ampiezza d’onda: in valore assoluto la distanza tra la direzione di propagazione dell’onda e il punto di max o di min. -Frequenza : numero di onde che passano un dato punto nell’unità di tempo. La descrizione quantitativa delle interazioni tra la radiazione e la materia è possibile solo se si considera la radiazione come formata da quantità discrete, chiamate FOTONI. L’energia dei fotoni è proporzionale alla frequenza della radiazione.

62 SPETTROSCOPIA E’ la disciplina che studia l’INTERAZIONE delle radiazioni elettromagnetiche con gli stadi quantici di energia della materia. In virtù di questa interazione, si determina una variazione dell’energia che può interessare nuclei, elettroni, atomi o molecole. assorbire la radiazione > il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO) emettere la radiazione < il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di EMISSIONE) diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN) Tutti questi tipi d’interazione possono avvenire solo per determinate l della radiazione incidente e quindi solo per determinate . h = E’-E” differenza di energia tra i due stati del sistema.

63

64 SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO Processo mediante il quale una sostanza rimuove selettivamente alcune frequenze dalla radiazione elettromagnetica. Lo spettro non è altro che la rappresentazione grafica delle transizioni energetiche permesse (Regole di selezione) sotto forma di righe. 1.Transizioni elettroniche E TOT = E e + E v + E r + E t 2.Transizioni vibrazionali 3.Transizioni rotazionali 4.Transizioni traslazionali

65 Infrarosso lontano, microonde TRANSIZIONI RotazionaliVibrazionaliElettroniche Infrarosso Visibile, Ultravioletto, Raggi X Onde Radio Variazioni di energia troppo deboli per essere osservate se non sotto un intenso campo magnetico STATI di SPIN INDOTTI MAGNETICAMENTE EPR (elettroni) NMR (nuclei)

66 La legge dell’assorbimento o Legge di Beer E’ la legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche in generale e con particolare riferimento alle soluzioni. A = . b. C A = assorbanza o frazione di energia assorbita b = cammino ottico (cm), spessore della soluzione attraversata dal raggio c = concentrazione (mol/L) della specie in esame  = assorbività o coefficiente di estinzione molare o di assorbimento molecolare (IUPAC), cioè l’assorbanza a concentrazione e spessore unitari. (, dal solvente, dalla natura chimica della specie che assorbe; non dipende in generale dalla temperatura) Se  è costante e b (cammino costante) allora l’equazione assume la forma A = kc e quindi del tipo y = mx.

67 Altro modo per descrivere il fenomeno dell’assorbimento consiste nell’usare la definizione di Trasmittanza T =   T = trasmittanza I 0 = intensità della radiazione incidente I = intensità della radiazione che esce dal campione Questa grandezza è legata all’Assorbanza secondo la relazione: A = log 1/T = log I 0 /I Se T% = 100T A = log 100/T% = 2-log T% oppure T% = 10 2-A A varia tra 0 e infinito mentre T% varia tra 0 e 100.

68 Fattori che possono determinare deviazioni dalla linearità: -Concentrazione della soluzione (10 -2 /10 -7 ), se troppo concentrata si può avere una variazione dell’indice di rifrazione e quindi di , così come si possono formare coppie ioniche o complessi o aggregati. -Variazioni di pH, perché influenza l’equilibrio tra due forme della stessa sostanza, aventi  diverso ad una stessa. -Temperatura, perché influenza sempre un eventuale equilibrio; tuttavia variazione nell’ordine di ±5 °C non comportano particolari problemi. -Solvente, perché la polarità del solvente influisce sulla distribuzione elettronica nella molecola analizzata. Ad es solventi polari o con alta costante dielettrica esercitano un effetto batocromo. -Co-presenza di fenomeni di fluorescenza (emissione) e diffusione della radiazione. -Fattori strumentali (ampiezza della banda passante)

69 Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza d’onda per la misura dell’assorbanza Una sostanza assorbe in modo diverso le varie radiazioni, cioè a diverse corrispondono vari . Lo spettro di assorbimento che si ottiene è uno spettro a bande caratterizzato dalla presenza di massimi (picchi di assorbimento) e minimi. Ogni sostanza ha un suo spettro caratteristico ed è proprio individuando la posizione dei massimi caratteristici che si realizza l’analisi qualitativa. L’analisi quantitativa viene invece fatta scegliendo un’opportuna, detta lunghezza d’onda analitica, scelta in modo che corrisponda ad un max o ad un min.

70 Transizioni elettroniche e cromofori L’assorbimento nel campo UV- VIS è dovuto a transizioni elettroniche da orbitali di legame a orbitali di non-legame o di anti-legame a più alto contenuto energetico e questo è possibile solo se la radiazione possiede un’energia pari al E tra i due livelli. ππ*π* nπ*π* Le prime sono caratteristiche dei sistemi insaturi e le seconde di eteroatomi con doppietti liberi; sistemi di questo tipo sono indicati come cromofori. C=C, C ≡C, C=O, C≡N, C=S, N=O, N=N, polieni, aromatici, ecc…

71 Effetto dei sostituenti Effetto Batocromo: diminuisce il E della transizione, alzando il contenuto energetico dell’orbitale legante o diminuendo quella dell’orbitale anti-legante o non- legante. Il picco (l’assorbimento) viene spostato a maggiori (sostituenti e- ricchi o donatori). Effetto Ipsocromo: effetto opposto al precedente; aumenta il E e quindi diminuisce la dell’assorbimento (sostituenti e- poveri o elettronegativi). Effetto Ipercromico: risulta aumentato  o per aumento della probabilità che avvenga quella data transizione o per aumento della superficie del cromoforo; aumenta l’assorbanza ma rimane costante la a cui il composto assorbe. Effetto Ipocromico: effetto opposto al precedente; diminuzione di  e quindi dell’assorbanza.

72 Rivelatore UV a fissa Vantaggi e svantaggi Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm. Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a fissa. Rivelatore UV a variabile Vantaggi -Versatilità: possibilità di selezionare da 190 a 800 nm. -Elevata sensibilità: potendo scegliere la ottimale (max assorbanza) per un analita. -Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti. -Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una alla quale la miscela solvente non assorbe.

73 Dopo un’ora

74 Separazione di una tossina proteica, della tossina coniugata con la biotina e dell’avidina (fattore antinutrizionale) Avidina Glicoproteina dell’albume che impedisce l’assorbimento della biotina Biotina (IUPAC) Vitamina H o I (tedesca) Vitamina B 7 (anglosassone) Vitamina B 8 (francese)

75 Lo spettrometro di massa può fornire informazioni qualitative e quantitative sui componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno spettro di massa, le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate. Gli ioni sono quindi accelerati per mezzo di un campo elettrico e vengono poi separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z). L’accoppiamento HPLC-MS è una tecnica relativamente “giovane” e sempre più utilizzata. Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS può servire come rivelatore universale (o comunque come un rivelatore che risponde ad un’estesa gamma di soluti) e sensibile. L’accoppiamento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60), ma soltanto dalla metà degli anni ’70 appaiono le prime pubblicazioni scientifiche. Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si utilizzano solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es. acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento. Spettrometro di Massa

76 analita Camera di ionizazione fascio ionico Campo elettrico acceleratore Campo magnetico analizzatore 1) il sistema di entrata 2) la sorgente ionica, il cuore dello spettrometro, in cui le molecole neutre vengono trasformate in ioni e si frammentano 3) l’analizzatore, in cui gli ioni vengono separati in funzione del rapporto massa/carica (m/z) 4) il rivelatore, in cui gli ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo amplificazione, al registratore che converte le informazioni contenute nei segnali in uno spettro.

77 Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico

78

79 1) M + e - M + + 2e - M 1 + M 3 + 2) M + M 2 + M 4 +, etc massa relativa Abbondanza relativa Ogni molecola ha una frammentazione unica e caratteristica che, come una vera e propria impronta digitale, ci permette di identificare e di risalire alla molecola madre. Normalizzazione dei picchi

80 1)Formazione ione molecolare (parente) 2)Formazione ioni di frammantazione 3)Formazione di ioni di riarrangiamento (trasposizione) AB + e- [AB] e- PM [AB] +. [A] + + [B]. catione radicale [A] + [C] + + [D] catione molecola neutra [AB] +. [EF] +. + [D] ione radicale molecola neutra Informazioni sulla struttura (identificazione dei composti) La presenza di picchi isotopici, aventi quindi rapporto m/z = M+ + 1 (o 2, 3, 4, ecc…) con intensità proporzionale all’abbondanza isotopica naturale

81 Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti) perché un picco sia effettivamente lo ione molecolare: -Picco a massa più alta -Ione ad elettrone dispari (ione radicalico) -Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona delle masse alte dello spettro in base a perdite logiche di specie neutre. Grado di insaturazione (n° di anelli + n° di = legami) = X – ½ Y + ½ Z + 1 C x H y N z O n C 6 H = 4 (1 anello + 3 = legami) C 7 H 5 O7 – ½ = 5,5

82 Regola dell’azoto Ione molecolare pari = 0, 2, 4, …. n° di N Ione molecolare dispari = 1, 3, 5, ….n° di N (azoto ha massa pari ma valenza dispari) Analisi dei picchi isotopici -M+2: stessa intensità di M1 atomo di Br -M+2: 33% intensità di M1 atomo di Cl -M+2: 4% intensità di M1 atomo di S -M+2, M+4, M+6,…..2, 3,….atomi di Br, Cl,..

83

84 Frammentazione Ioni neutri non vengono rivelati ma possono essere individuati indirettamente dalla differenza di massa tra lo ione molecolare e lo ione frammento vicino. Es. -Perdite di 1, 2, 3 sono plausibili -Perdite tra 4-14 no -Perdita di 15 palusibile (CH 3 ) -Perdite tra no Tipi di ionizzazione Elettronica (E.I.) Chimica (C.I.) I.di campo (F.I.) Disassorbimento di campo (F.D.)

85 1)E.I. Gli ioni vengono generati per interazione con e- ad alta energia emessi da un filamento di tungsteno o renio portato all’incandescenza per riscaldamento elettrico. (Alta frammentazione, bassa intensità dello ione molecolare) 2)C.I. Gli ioni vengono generati per interazione con ioni derivanti dalla ionizzazione elettronica di un gas reagente (metodo soft di ionizzazione); metano, isobutano, ammoniaca. (Oltre alla ionizzazione si ha il trasferimento di un protone per cui si formerà [MH] + ; minore frammentazione) 3)F.I. e F.D. in entrambi i metodi gli ioni sono generati da un forte campo elettrico che si instaura a causa della forte differenza di potenziale tra due elettrodi (metodo soft di ionizzazione); cambia il sistema di introduzione del campione che nell’F.D. è deposto direttamente in soluzione sull’anodo (miglioramento dell’efficienza, picco [M] + o [MH] + intensi)

86 E.S.I. Electro spray ionization E’ il metodo di ionizzazione che più di frequente si trova accoppiato all’LC, potendo utilizzare campioni liquidi o solidi, scarsamente volatili o termolabili (soft ionization). Molecole con PM relativamente alto Presenza di legami deboli e labili Elevata sensibilità Il campione liquido viene spruzzato sotto pressione e le goccioline caricate dal potenziale applicato al capillare. Nella camera di evaporazione, il gas e il riscaldamento fanno evaporare e desolvatare le goccioline cariche. Aumenta la densità di carica fino all’esplosione in goccioline più piccole caricate positivamente o negativamente.

87 Quattro barre cilindriche parallele due caricate positivamente e due negativamente collegate a due a due ad un generatore di potenziale elettrostatico e a un generatore di radiofrequenze (variabile nel tempo). Gli ioni subiscono l’azione combinata dei due campi. Per un certo valore del rapporto Potenziale elettrostatico/radiofrequenza solo ioni aventi un determinato rapporto m/z riescono a passare oltre al quadrupolo e arrivare al rivelatore. Occorre fare una scansione, cioè far variare il potenziale elettrostatico e la radiofrequenza ma mentenere costante il loro rapporto. Semplicità costruttivarange di masse più stretto Minor costominore risoluzione Tollera pressioni maggiori (LC, GC) Maggiore velocità di scansione

88

89 7-idrossicumarina (Umbelliferone) Attività: chemoprevenzione del cancro 6,7-dimetossicumarina (Scoparone) Attività: antiossidante, vasorilassante, antiasmatico Psoralene (furanocumarina lineare) Attività: cura di eczemi e psoriasi Angelicina (furanocumarina angolare) Attività: antiinfiammatoria CUMARINA (1,2-BENZOPIRONE) Warfarin (Cumadin®) Attività: anticoagulante Interferisce con le funzioni della vitamina K, coinvolta nell’attivazione Dei fattori della coagulazione del sangue

90 Analisi GC-MS della 5,7-dimetossicumarina standard M + - CH 3 = 191 M + - CO = 178 M + - CH 3 CO = 163 M + - CH 3 CO – CH 3 = 148 M + - CH 3 CO – CO = 135 M + - CH 3 CO – CH 3 CO = 120 OCH 3 H 3 CO

91 Identificazione della 5,7-dimetossicumarina nell’ESTRATTO in METANOLO OCH 3 H 3 CO 5,7-dimetossicumarina

92

93 Cromatografia Cromatogramma Analisi qualitativaAnalisi quantitativa tempo di ritenzione (spettro di massa) area del picco

94 -t r sostanza X e t r sostanza nota (standard) -Iniettare una certa quantità (10-20%) della sostanza presunta, pura, nel campione in esame: se il picco di X risulta aumentato vi è buona probabilità di aver individuato l’identità dell’incognito. -Stessa cosa viene ripetuta usando condizioni sperimentali diverse; se anche in questo caso l’arricchimento fa aumentare il picco allora siamo quasi certi dell’identità della sostanza. -Se ho accoppiato uno spettrometro di massa si può evitare questa procedura macchinosa. ANALISI QUALITATIVA

95 ANALISI QUANTITATIVA  L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle aree dei picchi, dal momento che esiste proporzionalità diretta tra la misura effettuata e la concentrazione che la determina (almeno in certi range).  Sono metodi comparativi cioè basati sulla relazione matematica tra il parametro misurato (risposta o segnale) e la concentrazione dell’analita.  Quindi richiedono la calibrazione mediante soluzioni standard.  Dopo opportuna elaborazione delle aree, si risale alla concentrazione percentuale dei componenti.  Il calcolo dell’area del picco viene fatta direttamente dal computer e viene stampata sul cromatogramma.  Alla base comunque ci sono delle regole per mezzo delle quali è possibile risalire alle aree dei picchi.  Necessità di determinare quantitativamente tutti i componenti di una miscela o solo alcuni o al limite uno solo (necessità quindi di avere risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).

96 massa picco massa 1 cm 2 area picco Ritagliare il picco e pesarlo, confrontandolo con il peso di 1 cm2 della stessa carta. -Metodo laborioso -Precisione Metodi geometrici -Gaussiana -Triangolazioni Importante è la pulizia del picco (simmetria e mancanza di sovrapposizioni)

97 Si applica il metodo della gaussiana calcolando l’ampiezza del picco a metà altezza e considerando i due picchi come separati. In questo caso l’ampiezza a metà altezza è ricavabile dalle semi- ampiezze. L’integrazione elettronica ricostruisce la funzione matematica del picco maggiore, ne calcola l’area e la sottrae all’area totale (area del picco minore)

98 I metodi per la calibrazione possono essere divisi in due gruppi:  Uso di Standard Esterni (analizzati separatamente dal campione).  Uso di Standard Addizionati ad ogni campione (Standard Interni o aggiunti). Standard esterni Una serie di standard di questo tipo è costituita da unità che contengono quantità note e differenti di analita. Si inietta un volume noto e preciso del campione e si registra il cromatogramma; poi, si prepara una soluzione a concentrazione nota del componente da determinare e si inietta lo stesso volume, registrando il cromatogramma. S(A) c /S(A) s = C c /C s C c = C s. S(A) c /S(A) s

99 -E’ importante fare in modo che le concentrazioni comparate (campione e standard) non differiscano troppo tra loro. -Occorre una grande accuratezza e riproducibilità nel misurare il volume da iniettare. -Iniezioni ripetute, sia del campione che dello standard, e poi fare una media delle aree -Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di tempo piuttosto breve per evitare le deviazioni dovute a variazioni ambientali o strumentali. Costruzione di rette di taratura o calibrazione Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e crescenti dell’analita e si riportano su un grafico A/[] i valori letti sul cromatogramma; si dovrebbe ottenere una retta passante per lo zero (se ci sono deviazioni significative allora si aumenta il numero delle soluzioni standard). Si inietta la soluzione campione e si registra il valore dell’area. Si interpola la concentrazione incognita del campione.

100 Le soluzioni standard devono simulare al meglio la matrice del campione, e quindi devono contenere tutti i reattivi (e nelle stesse concentrazioni) contenuti nella soluzione campione. Questo comporta ricontrollare le rette di taratura ogni volta che le soluzioni dei reattivi vengono preparate di fresco. -Conoscenza della matrice -I vari componenti la matrice non causino interferenza con il campione

101 Standard aggiunti Anche in questo caso possiamo distinguere due metodiche:  Metodo delle aggiunte standard o multiple Consiste nel preparare soluzioni dell’analita contenenti volumi noti e crescenti di soluzione standard della stessa specie da analizzare. Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle aggiunte: a) Introdurre una certa quantità di soluzione incognita in più matracci (3-4), aggiungere in ogni matraccio volumi diversi di soluzione standard (a concentrazione da 10 a 100 volte maggiore) e poi portare a volume con la soluzione incognita. Quindi di riportano in un grafico A/[] i valori ottenuti dalle diverse soluzioni mL4 mL3 mL2 mL Sol. STANDARD

102 C agg A A0A0 A4A4 A3A3 A2A2 A1A1 C eff C1C1 C4C4 C2C2 C3C3 0 CxCx 0C 1 +C x C 4 +C x C 3 +C x C 2 +C x Y = mx Y = mx + q C x sarà data dall’intercetta sull’asse delle x (differenza tra i due zeri) cambiata di segno e sarà inferiore rispetto alle concentrazioni degli standard. In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del tutto rigoroso, perché il contenuto di analita varia leggermente all’interno delle diverse soluzioni così come la concentrazione finale dello standard aggiunto.

103 Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a concentrazione C x e 1 mL a concentrazione ad es 1000 ppm, mentre matraccio 4 abbiamo miscelato 96 mL a concentrazione C x e 4 mL a concentrazione 1000 ppm. Quindi gli incrementi effettivi differiscono leggermente. Infatti ammettendo che C x = 20 ppm e che 1 ppm = 1 mg/L = 1 g/mL allora C x = 20 g/mL Quantità dell’analita X nei diversi matracci: -20  g/mL. 99 mL = 1980  g = 1,98 mg -20  g/mL. 98 mL = 1960  g = 1,96 m g -20  g/mL. 97 mL = 1940  g = 1,94 mg -20  g/mL. 96 mL = 1920  g = 1,92 mg Quantità dello standard aggiunto nei diversi matracci: 1000  g/mL. 1 mL = 1000 mg = 1,00 mg 1000  g/mL. 2 mL = 2000 mg = 2,00 mg 1000  g/mL. 3 mL = 3000 mg = 3,00 mg 1000  g/mL. 4 mL = 4000 mg = 4,00 mg Queste quantità si trovano alla fine nei matracci da 100 mL

104 L’incremento in termini di massa ad es per il matraccio 1 è pari a 1 mg, ma in termini di concentrazione sarà: (1,98+1,00) (mg) (100) (mL) (1000) (mL/L) = 29,8 (mg/L o ppm) 29,8-20,0 = 9,8 ppm e non 10 ppm (1,00) (mL) 1000 (mg/L) (100) (mL) = 10,0 (mg/L o ppm) Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es al matraccio 4, il cui incremento in termini di concentrazione sarà: (1,92+4,00) (mg) (100) (mL) (1000) (mL/L) = 59,2 (mg/L o ppm) 59,2-20,0 = 39,2 ppm e non 40 ppm Possiamo però calcolare lo scarto % e vedere che per ogni matraccio rimane costante: 9, = -2,0 % 39, = -2,0 % Matraccio 1 Matraccio 4

105 b) Per evitare l’approssimazione del metodo precedente, si può aggiungere in ogni matraccio un volume noto ed esatto V x della soluzione dell’analita a concentrazione incognita C x e aliquote (in mL) di soluzione standard crescenti indicate con n 1, n 2, n 3, ecc…; alla fine si porta al volume finale V t (ad es. 100 mL) con un solvente opportuno. n 1 + V x n 2 + V x n 4 + V x n 3 + V x A = K Cn i con K = b Cni = concentrazione data dal campione e da un’aggiunta iesima dello standard. A = K V x C x VtVt n i C s VtVt + A A0A0 A4A4 A3A3 A2A2 A1A1 n1n1 n4n4 n2n2 n3n3 A = 0 A = K CsCs VtVt +nini VxCxVxCx VtVt K Y = mx + q 0 = K CsCs VtVt + VxCxVxCx VtVt K nxnx nXnX C x = VxVx CsCs (-n x )

106 Metodo delle aggiunte standard Vantaggi e Svantaggi Permette di effettuare l’analisi quantitativa in matrici complesse o incognite Si può applicare a tutte le tecniche analitiche sia spettrofotometriche, elettrochimiche e cromatografiche E’ necessario un a curva di calibrazione per ogni analita da determinare E’ necessario un volume maggiore rispetto a quello impiegato con la retta di taratura con standard esterno E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno N.B. Prima di effettuare la curva di taratura o di applicare il metodo delle aggiunte è necessario analizzare il bianco. Il bianco ideale è costituito dalla soluzione conteente tutti i componenti il campione ad eccezione dell’analita stesso. In questo modo si può ottenere il segnale relativo ad una “concentrazione zero” dell’analita. E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno

107  Metodo dello standard interno Questo metodo viene usato prevalentemente in cromatografia. Consiste nel preparare una serie di soluzioni standard contenenti concentrazioni note e variabili dell’analita e le stesse quantità di un’altra sostanza (standard interno). Si costruisce una curva di calibrazione riportando in ascisse il rapporto ponderale o di concentrazione dell’analita e dello standard (P a /P is o [X]/[IS]) e in ordinate il rapporto delle aree (A a /A IS ). Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno alla soluzione a concentrazione incognita e si effettua la determinazione. Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite l’equazione della retta al rapporto dei pesi o delle concentrazioni. Conoscendo la quantità di standard interno aggiunto, è possibile risalire alla quantità di analita. 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 P A /P IS 0 0,5 1,0 1,5 2,0 A A /A I S [a]/[IS]

108 P A /P IS si ricava per interpolazione dal grafico Q IS è la quantità di standard interno aggiunta (in peso) Esempio Se la quantità di standard interno aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le aree ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione dal grafico precedente si ricava che il rapporto P A /P IS risulta essere 1,25. Quindi dalla relazione sopra citata ricaviamo che la quantità di analita sarà: 1,25 x 200 = 250 mg Se poi vogliamo conoscere la concentrazione basta considerare il volume di campione a cui è stato aggiunto lo standard.

109 Lo standard interno deve soddisfare certi requisiti: -Non essere presente nella miscela da analizzare -Essere ben risolto dagli altri componenti -Avere un t r diverso ma non troppo lontano da quello dell’analita -Essere strutturalmente simile al composto da analizzare in modo che la risposta strumentale sia uguale o simile. -Non contenere impurezze -Non reagire con i vari componenti della miscela analizzata

110 Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano una linea retta Nella pratica, raramente tutti i dati sperimentali sono allineati perfettamente lungo una linea retta; per questo occorre trovare la retta migliore che interpola i punti sperimentali attraverso un’analisi di regressione lineare usando il metodo dei minimi quadrati. Viene cioè calcolata l’equazione della retta che minimizza la somma dei quadrati delle distanze verticali tra i punti e la retta stessa. L’equazione è chiamata equazione di regressione ed è del tipo y = mx + q dove m, il coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di regressione. Tale retta, considerata la migliore, passa anche per il centroide o centro di gravità che corrisponde al punto (X medio, Y medio ), valori corrispondenti ai valori medi di tutti i dati sperimentali x i e y i. X Y....

111 Per stabilire fino a che punto la retta trovata possa essere usata al fine di prevedere un valore di Y conoscendo un determinato valore di X, e viceversa, cioè per stabilire se la retta è realmente la migliore, si calcola il coefficiente di determinazione o di correlazione lineare r 2. r 2 può assumere valori in valore assoluto compresi tra 0 e 1. Se r 2 = 1 allora esiste una relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore di y. Se r 2 = 0 allora non esiste alcuna relazione lineare tra x e y. Valori compresi tra 0 e 1 indicano la “bontà” dell’equazione di regressione calcolata. Difficilmente le rette di calibrazione hanno valori di r 2 inferiori a 0,98 e in ogni caso mai al di sotto dello 0,95.

112 Determinazione quali-quantitativa Resveratrolo Famiglia Fitoalexine -Forma trans -Forma cis -Forma glicosilata (3) Antiossidante naturale presente nell’uva, nel succo d’uva e nel vino rosso -GC-MS: derivatizzazione con bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetammide -HPLC: in fase normale con eluizione isocratica o in fase inversa con eluizione a gradiente -Nel 1999 LC-MS (E.S.I.) in modalità di ione negativo (C 18 – eluente: MeOH/CH 3 COONH 4 (55/45 v/v) 20mM) -LC-MS (C.I.) in modalità di ione positivo (C 18 – eluente: MeOH/HCOOH) m/z=229 [M+H] +

113 Spettro di frammentazione del resveratrolo derivatizzato ottenuto per C.I. m/z = 444 (10  g/L) Spettro di frammentazione del resveratrolo ottenuto con electro spray ionization m/z = 227 (200 p g/L)

114 Determinazione per HPLC-UV del trans e cis resveratrolo in preparazioni commerciali e sua stabilità alla luce e alla temperatura -HPLC Gilson a due pompe con miscelatore -Colonna C18 5 M, lunghezza 250 mm, ID 4,6 mm -eluizione isocratica -eluente miscela acqua/acetonitrile -Flusso 1 mL/min -Prove eseguite in triplicato -Iniezione di 20 L Scelta della analitica -Trans: 306 nm e 320nm -Cis: 295 nm Ottimizzazione % Acetonitrile

115 Conc. % v/v T(min) mediad.s.K’log K’ 20 26,0625,93225,89925,960,08510,741, ,96912,9912,97112,9770,01164,870, ,9157,9267,9247,9220,005862,60, ,6625,6615,4675,6570,008391,560, ,5284,4934,5014,5070,01831,040,02 20 L in triplicato di una soluzione preparata diluendo 100 L della soluzione Standard A in matraccio da 100 mL (5,53 g/mL) con metanolo Soluz. Standard A 10,53 mg/10 mL Retta di Calibrazione Costruita da diluizione Soluz. Standard A 25, 50, 75 e 100 L Portati a 10 mL con metanolo Area 1Area 2Area 3Area 4mediaµg/mLd.s.c.v.% ,

116 Stabilità del trans-resveratrolo esposto a lampada fluorescente

117 Area 1Area 2Area 3MediaT (h) µg/m LC% ,705, ,725, ,9589, ,8888, ,384,581, ,3124,2476, ,665, ,67362,4544,4 Stabilità a -20 °C al buio Stabilità a t.a. al buio Stabilità a t.a. con lampada 40 Watt Stabilità a t.a. con lampada 100 Watt

118 Stabilità a t.a. con lampada UV 254 nm Stabilità a t.a. con lampada UV 365 nm CONCLUSIONI Il trans-resveratrolo è risultato stabile sia a -20 °C che a t.a. quando mantenuto al riparo dalla luce, unica causa di isomerizzazione. Questa si verifica sempre quando la soluzione è esposta a radiazioni provenienti da fonti diverse. Inoltre è proporzionale al tempo di esposizione, alla potenza e alla usata.


Scaricare ppt "Cromatografia Scrittura del colore Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti,"

Presentazioni simili


Annunci Google