Studi di classificazione. Gli studi di autenticazione e tracciabilità degli alimenti sono basati su tre schemi principali di classificazione: La premessa,

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1 Studi di classificazione

2 Gli studi di autenticazione e tracciabilità degli alimenti sono basati su tre schemi principali di classificazione: La premessa, quasi scontata, perchè uno studio di classificazione sia vincente, cioè permetta di autenticare o tracciare un alimento pregiato, è che siano disponibili campioni certificati, cioè di provenienza certa. Sulla base delle caratteristiche chimico-fisiche del materiale certificato è possibile costruire schemi di classificazione che prevedono una differenziazione geografica, varietale o tecnologica Introduzione in base alla provenienza geografica, differenziando alimenti prodotti in regioni diverse o a partire da materie prime provenienti da regioni diverse (notare la differenza) in base alla provenienza geografica, differenziando alimenti prodotti in regioni diverse o a partire da materie prime provenienti da regioni diverse (notare la differenza) in base alla varietà, differenziando alimenti per la cui produzione sono impiegate varietà botaniche o animali differenti in base alla varietà, differenziando alimenti per la cui produzione sono impiegate varietà botaniche o animali differenti in base al processo tecnologico, differenziando alimenti prodotti secondo procedimenti diversi in base al processo tecnologico, differenziando alimenti prodotti secondo procedimenti diversi

3 La classificazione geografica è straordinariamente importante dal punto di vista commerciale: basti pensare alla differenza di prezzo che ci può essere tra un tartufo bianco di Alba e un analogo prodotto di qualunque altra parte del mondo, oppure tra lo zafferano di San Gimignano o dell’Aquila (~ 3500 €/Kg) e prodotti analoghi meno pregiati. Questo esempio può essere esteso a centinaia e centinaia di alimenti, quantomeno a quelli protetti da DOP, DOC, DOCG e altre etichette. Va considerato che le produzioni di nicchia (es. pistacchio di Bronte, asparago di Santena, filetto baciato di Ponzone) hanno un valore aggiunto determinato proprio dall’essere riferite ad una zona geografica assai circoscritta e riconoscibile, oltre che dalla relativa complessità nel produrre l’alimento L'esigenza di legare il prodotto alla zona di origine o di produzione è quindi stringente Classificazione geografica

4 È importante sottolineare la differenza tra zona di provenienza delle materie prime e zona di produzione di un alimento pregiato. Dal punto di vista normativo può non esserci differenza. I disciplinari delle denominazioni di origine controllata o protetta possono fare riferimento ad una ben delimitata zona di origine delle materie prime E/O ad una zona di produzione. Spesso le norme hanno maglie sufficientemente larghe da permettere ai produttori di sfruttare questa ambiguità a loro vantaggio, producendo nella loro area alimenti a partire da materie prime provenienti da altre aree, magari ottenibili a prezzi inferiori Materie prime e produzione

5 Le specifiche sono molto restrittive: sia le materie prime, sia la produzione sono legate al territorio delimitato dalla DOCG. La conseguenza in campo analitico è che il disciplinare agevola la possibilità di tracciare o autenticare il prodotto finale Esempio A: il Barolo Il Barolo ha ottenuto il riconoscimento della DOCG nel 1980. È considerato il Re dei vini e il vino dei Re. La DOCG specifica che la produzione del Barolo deve osservare due caratteristiche specifiche: la zona di origine delle uve include il territorio totale o parziale di 11 comuni: Barolo, Castiglione Falletto, Serralunga d'Alba, Monforte d'Alba, Novello, La Morra, Verduno, Grinzane Cavour, Diano d'Alba, Cherasco e Roddi la zona di origine delle uve include il territorio totale o parziale di 11 comuni: Barolo, Castiglione Falletto, Serralunga d'Alba, Monforte d'Alba, Novello, La Morra, Verduno, Grinzane Cavour, Diano d'Alba, Cherasco e Roddi le operazioni di vinificazione e di invecchiamento obbligatorio devono essere effettuate nella zona delimitata dagli 11 comuni le operazioni di vinificazione e di invecchiamento obbligatorio devono essere effettuate nella zona delimitata dagli 11 comuni

6 Le specifiche sembrerebbero restrittive se non fosse che la materia prima, cioè il lardo, proviene da suini che possono essere allevati, oltre che in Valle d'Aosta, anche in Emilia Romagna, Piemonte, Lombardia e Veneto! È facile pensare che suini da allevamenti intensivi e di grandi dimensioni, come possono essere quelli dell’Emilia Romagna, abbiano un costo inferiore a quelli allevati localmente Esempio B: il lardo di Arnad Il lardo di Arnad ha ottenuto il riconoscimento della DOP nel 1996. Si tratta di un salume di grande pregio, apprezzato per il gusto delicato. La DOP specifica che la produzione deve osservare tre caratteristiche specifiche: è limitata al comune valdostano di Arnad è limitata al comune valdostano di Arnad l'alimentazione dei maiali esclude mangimi integrati a favore di castagne e ortaggi l'alimentazione dei maiali esclude mangimi integrati a favore di castagne e ortaggi la stagionatura va fatta con aromi locali la stagionatura va fatta con aromi locali

7 I parametri più usati negli studi di classificazione e tracciabilità degli alimenti sono i seguenti: Parametri utili per la classificazione parametri chimici parametri chimici elementi elementi rapporti isotopici rapporti isotopici composti (es. polifenoli, terpeni, ammine, ecc.) composti (es. polifenoli, terpeni, ammine, ecc.) parametri spettroscopici parametri spettroscopici assorbanze a determinate assorbanze a determinate UV-visibile, NIR, MIR UV-visibile, NIR, MIR

8 Attualmente la maggior parte degli studi di classificazione geografica sugli alimenti è relativa agli alcolici e in particolare al vino. Ciò è dettato da alcune considerazioni: Provenienza dei prodotti enologici per quanto formata da centinaia di sostanze diverse, la chimica del vino è abbastanza nota e questo permette di individuare numerosi marcatori validi a scopo di classificazione per quanto formata da centinaia di sostanze diverse, la chimica del vino è abbastanza nota e questo permette di individuare numerosi marcatori validi a scopo di classificazione si tratta di un alimento di grandissima diffusione e quindi di grande impatto commerciale si tratta di un alimento di grandissima diffusione e quindi di grande impatto commerciale è particolarmente soggetto a frode e ciò giustifica l’impegno nella ricerca scientifica per sviluppare metodi di autenticazione è particolarmente soggetto a frode e ciò giustifica l’impegno nella ricerca scientifica per sviluppare metodi di autenticazione molti ricercatori sono forti bevitori… molti ricercatori sono forti bevitori…

9 Al giorno d'oggi la necessità di autenticare i vini dal punto di vista geografico è dettata dal fatto che la prevalenza commerciale delle regioni a vocazione enologica storicamente consolidata (Italia, Francia) è messa in discussione dalle regioni emergenti (California, Cile, Argentina, Australia, Nuova Zelanda) che producono vini a prezzi decisamente concorrenziali Per contrastare i fenomeni legati alla globalizzazione è obbligatorio puntare sulla qualità e sul riconoscimento della tipicità locale, proprietà che possono essere vanificate se sul mercato sono immessi prodotti non autentici Per questo motivo nazioni come Francia, Spagna, Germania (ma anche California, Australia) investono risorse nel campo della ricerca enochimica. L'Italia appare un gradino indietro

10 I disciplinari di produzione dei vini impongono regole di produzione precise, sia per quanto riguarda l’origine delle uve, sia per quanto riguarda il luogo di vinificazione e imbottigliamento. La possibilità di differenziare vini provenienti da regioni diverse è quindi legata sia alle caratteristiche del territorio, sia alle pratiche di vinificazione Nella classificazione dei vini i parametri più utili sono senza dubbio i rapporti isotopici, in particolare per gli elementi pesanti (Pb e Sr); studi in corso indicano l'utilità anche degli elementi leggeri (H, C, O). Oltre agli isotopi, sono impiegati vantaggiosamente parametri elementari (metalli in tracce e ultratracce) e molecolari (composti vari) I parametri più utili

11 L’utilizzo di variabili chimiche per la differenziazione dei vini risale alla fine degli anni ’70; i primi studi sono di Kwan e Kowalski (1978) che riuscirono a distinguere vini Pinot Noir di provenienza europea e americana sulla base del contenuto relativo di alcuni composti organici Molto spesso è possibile individuare nel vino sostanze caratteristiche delle varietà di uva impiegate, o in qualche modo legate al territorio nel quale crescono le viti. Questi analiti possono essere determinati per differenziare i vini In realtà raramente un solo elemento o composto è sufficiente ad ottenere una buona discriminazione; nella maggior parte dei casi è necessario prendere in considerazione più analiti e quindi più variabili, il che implica l’utilizzo di tecniche opportune (cromatografia, tecniche multielementari) e metodi matematici di analisi multivariata Determinazione di elementi e composti

12 Le classi di composti più utili per discriminare vini diversi sono le seguenti: elementi in tracce elementi in tracce composti volatili (terpeni, esteri, alcoli, ecc.) composti volatili (terpeni, esteri, alcoli, ecc.) composti polifenolici (antociani, flavonoidi) composti polifenolici (antociani, flavonoidi) aminoacidi aminoacidi Normalmente, i composti volatili sono più utili nella caratterizzazione varietale, cioè se si intende distinguere vini ottenuti da varietà diverse di Vitis vinifera; gli elementi, essendo più legati al terreno, sono invece maggiormente idonei per la differenziazione geografica. Altri composti, come i polifenoli e gli aminoacidi, sono utilizzati in entrambi i casi In molti casi è utile utilizzare più classi di analiti, es. elementi in tracce e aminoacidi: ciò aumenta le possibilità di discriminazione

13 Nella selezione delle variabili chimiche da utilizzare per la discriminazione, va sottolineato che ogni schema di classificazione fa storia a sè, nel senso che variabili impiegate per ottenere una buona separazione in un caso possono non essere effettive in un altro. Studi di letteratura nei quali erano utilizzati gli elementi metallici, sottolineano in certi casi l’uso di metalli alcalini (Li, Na, Rb) e alcalino-terrosi (Ca, Mg, Sr, Ba), in altri casi l’uso di metalli di transizione (Mn, Ni) o di lantanidi Ciò è dovuto alla grande complessità ed eterogeneità del vino come matrice chimica, che può riflettere le caratteristiche di terreni, varietà di uva e processi di vinificazione diversi da zona a zona Per questo motivo è difficile individuare variabili utili in qualsiasi schema di classificazione Scelta delle migliori variabili

14 La determinazione dei metalli nel vino è stata ed è tuttora impiegata con frequenza negli studi di provenienza dei vini. Relativamente recente è l'indicazione che gli elementi in tracce possano essere utili nella discriminazione dei vini e nell'eventuale determinazione della regione d'origine. I primi studi risalgono infatti al 1992: McCurdy e Medina determinarono con ICP-MS lantanidi e altri microelementi in vini di varia provenienza, verificandone la differenza di distribuzione. Il numero di campioni analizzati era però scarsamente significativo dal punto di vista statistico. Il lavoro ebbe infatti scarso seguito. In seguito ci sono stati molti lavori simili: metalli della prima serie di transizione (da Sc a Zn), metalli alcalini e alcalino-terrosi, lantanidi, semimetalli come Al sono stati utilizzati come variabili per poter differenziare vini di origine geografica diversa, ma a tutt'oggi non esiste un protocollo di analisi dei microelementi che permetta di ottenere una classificazione certa Gli studi di letteratura si concentrano su vini di regioni limitrofe, ottenuti da vigne su terreni diversi (più difficile), oppure vini di nazioni o continenti diversi (più semplice) Determinazione di metalli

15 Tra i diversi fattori che determinano il contenuto di elementi nel vino possiamo considerare: La distribuzione finale è quindi il risultato di una somma di fattori, alcuni dei quali sono caratteristici del territorio, altri risultano sono fuori controllo o non discriminanti. Sulla base delle considerazioni precedenti, possiamo suddividere gli elementi in tre gruppi, a seconda del loro potere discriminante come variabile chimica Comportamento dei metalli nella filiera contributo dal terreno su cui crescono le viti contributo dal terreno su cui crescono le viti capacità dell’uva di assumere sostanze minerali dal terreno capacità dell’uva di assumere sostanze minerali dal terreno contributi dai vari passaggi del ciclo produttivo, dall’uva al prodotto finito e imbottigliato (trattamenti preliminari alla vendemmia, reazioni di fermentazione, addizione di composti aventi funzioni varie, conservazione, imbottigliamento) contributi dai vari passaggi del ciclo produttivo, dall’uva al prodotto finito e imbottigliato (trattamenti preliminari alla vendemmia, reazioni di fermentazione, addizione di composti aventi funzioni varie, conservazione, imbottigliamento)

16 Sono elementi la cui concentrazione nel vino non è influenzata dal ciclo produttivo, ma è determinata dal contributo minerale del terreno e dalla capacità della vite di assumere sostanze minerali Elementi aventi contributi naturali Al, B, Ba, Li, Mn, Mo, Rb, Si, Sr e Ti si comportano in questo modo; occasionalmente, alcuni di questi elementi può avere contributi artificiali se sono impiegati trattamenti illeciti durante la vinificazione Al, B, Ba, Li, Mn, Mo, Rb, Si, Sr e Ti si comportano in questo modo; occasionalmente, alcuni di questi elementi può avere contributi artificiali se sono impiegati trattamenti illeciti durante la vinificazione Elementi presenti come tracce o ultratracce come i lantanidi o terre rare e i metalli della seconda e terza serie di transizione Elementi presenti come tracce o ultratracce come i lantanidi o terre rare e i metalli della seconda e terza serie di transizione

17 Elementi aventi contributi naturali e artificiali Ca e Mg sono costituenti naturali dei mosti, ma l’addizione di carbonati (come disacidificanti) aumenta la loro concentrazione nel vino Ca e Mg sono costituenti naturali dei mosti, ma l’addizione di carbonati (come disacidificanti) aumenta la loro concentrazione nel vino Cu e Zn sono assunti naturalmente dal terreno oppure da trattamenti fungicidi (miscela di Bordeaux, tiocarbamati di Zn) o dall’equipaggiamento di vinificazione Cu e Zn sono assunti naturalmente dal terreno oppure da trattamenti fungicidi (miscela di Bordeaux, tiocarbamati di Zn) o dall’equipaggiamento di vinificazione La concentrazione di Fe è dovuta in parte a contributi naturali (assunzione dal terreno, presenza di particelle residue di terreno nel mosto), in parte a contributi artificiali (equipaggiamento di vinificazione, contenitori in acciaio) La concentrazione di Fe è dovuta in parte a contributi naturali (assunzione dal terreno, presenza di particelle residue di terreno nel mosto), in parte a contributi artificiali (equipaggiamento di vinificazione, contenitori in acciaio) K è il catione predominante nell’uva, ma è anche addizionato come metabisolfito o carbonato durante la vinificazione K è il catione predominante nell’uva, ma è anche addizionato come metabisolfito o carbonato durante la vinificazione Na arriva dal terreno o da addizioni illecite come cloruro, nei trattamenti di salatura Na arriva dal terreno o da addizioni illecite come cloruro, nei trattamenti di salatura P è presente naturalmente come fosfati organici e inorganici, ma è addizionato ai come come sale di calcio o di ammonio P è presente naturalmente come fosfati organici e inorganici, ma è addizionato ai come come sale di calcio o di ammonio Sono elementi la cui concentrazione è la somma di fattori diversi, alcuni naturali, altri artificiali; questo comportamento è tipico di molti elementi

18 Sono elementi la cui concentrazione è quasi esclusivamente influenzata fonti artificiali Elementi aventi contributi artificiali Pb arriva prevalentemente da trattamenti fungicidi, contenitori stagnati o inquinamento ambientale (per vigne vicine a strade ad inteso traffico veicolare) e in minima parte dal terreno. Eccezioni possono essere i vini della Sardegna, le cui vigne sono spesso collocate vicino a miniere di piombo Pb arriva prevalentemente da trattamenti fungicidi, contenitori stagnati o inquinamento ambientale (per vigne vicine a strade ad inteso traffico veicolare) e in minima parte dal terreno. Eccezioni possono essere i vini della Sardegna, le cui vigne sono spesso collocate vicino a miniere di piombo Co, Cr, Ni e V, presenti nel vino in concentrazioni basse, arrivano più probabilmente dall’interazione di mosti e vino con contenitori metallici che da fonti naturali Co, Cr, Ni e V, presenti nel vino in concentrazioni basse, arrivano più probabilmente dall’interazione di mosti e vino con contenitori metallici che da fonti naturali

19 Dal punto di vista della tracciabilità, le variabili più promettenti sono gli elementi che hanno origine prevalentemente naturale, in quanto essi riflettono le peculiarità del terreno o della vite. Dal punto di vista dell’autenticazione, invece, possono avere potere discriminante anche elementi di origine mista, in quanto essi possono riflettere peculiarità del procedimento di vinificazione oltre che del terreno È importante, comunque, sottolineare la necessità di disporre di molte variabili per ottenere una buona discriminazione. Le tecniche di analisi maggiormente idonee sono quindi quelle multielementari, come la spettroscopia di massa con plasma (ICP- MS) o la spettroscopia di emissione atomica con plasma (ICP-AES) Le migliori variabili

20 Gli studi di provenienza geografica del vino sono numerosissimi in letteratura. I principali gruppi di ricerca in questo campo si hanno in Spagna, Germania e Francia; in Italia esiste un grosso centro di ricerca in campo enochimico a San Michele all’Adige Nell’effettuare gli studi di provenienza, si cerca in prima battuta di individuare l’elemento o gli elementi che permettono di discriminare in gruppi i vini analizzati. Se ciò non è possibile in maniera evidente, si cerca allora di elaborare i dati in modo da avere una rappresentazione migliore dal punto di vista visuale, con i metodi chemiometrici unsupervised (PCA e CA). Oltre a ciò, può essere utile impiegare metodi chemiometrici supervised, in modo da individuare le variabili, ovvero gli elementi, che discriminano maggiormente i gruppi di origine geografica diversa presi in considerazione Esempi di studi

21 In questo studio del 1994, 42 vini bianchi della Galizia (Spagna nordoccidentale) sono stati analizzati determinando Li, Rb, Na, K, Mn, Fe e Ca. I dati sono stati elaborati per differenziare vini di denominazione Vini galiziani di origine controllata Rias Baixas da altri due vini galiziani meno pregiati, Ribeiro e Valdeorras, che sono spesso utilizzati per possibili falsificazioni

22 Nel plot bivariato è mostrato lo spazio delimitato dagli elementi litio e rubidio: queste due variabili sono sufficienti per distinguere vini Rias Baixas (2) da altri vini (1); un campione sembra essere erroneamente etichettato In questo caso sono sufficienti due variabili per ottenere una buona separazione tra i gruppi considerati; si tratta però di un caso fortunato

23 L’analisi a cluster (sette variabili, 42 campioni) conferma il fatto che i due gruppi sia distinguibili chimicamente, sfruttando la determinazione degli elementi Rias Baixas non Rias Baixas anomali

24 In questo studio del 1996, sono stati confrontati 55 vini spagnoli e 57 vini inglesi attraverso la determinazione, mediante ICP-MS, degli elementi riportati in basso Vini spagnoli e inglesi All'interno del set di campioni, i vini sono di tipo diversi in quanto sono presenti rossi, bianchi e rosè. Risulta quindi un set piuttosto eterogeneo

25 La separazione tra i due gruppi, per la verità non troppo difficile da ottenere, è comunque buona e ottenuta mediante analisi discriminante

26 In questo studio sono stati analizzati 88 campioni di vini bianchi tedeschi, provenienti dalle regioni vinicole di Dienheim e Ingelheim (Assia) e Bad Dürkheim e Landau (Palatinato), tutte situate nella Germania centrale. I vini sono esemplari delle varietà Riesling, Silvaner e Weißburgunder. In tutti i campioni sono stati determinati 33 elementi con la tecnica ICP-MS, tra i quali sono stati risultati particolarmente significativi gli elementi As, Be, Cs, Li, Sn, Sr, Ti, W e Y (tracce) e B, Mg, Pb, Si (minori) Vini tedeschi

27 L’analisi a cluster (dendrogramma, sotto) indica che si possono già distinguere i vini provenienti dalle regioni dell’Assia (D e I) da quelli delle regioni del Palatinato (B e L)

28 L’analisi PCA (sx) conferma il risultato dell’analisi CA: sono distinguibili i due gruppi di vini dell’Assia e del Palatinato, ma non sono distinguibili separatamente le quattro regioni Utilizzando il metodo supervised dell’Analisi Discriminante Lineare (LDA) è possibile ottenere una buona discriminazione tra tutte le quattro regioni; con questo metodo, campioni incogniti proiettati in questo spazio possono essere correttamente classificati

29 In questo studio sono stati analizzati 95 vini provenienti dalle due principali regioni vitivinicole canadesi, la Okanagan Valley nella Columbia Britannica e la Niagara Peninsula in Ontario Vini canadesi I vini sono bianchi delle varietà Riesling, Pinot Blanc, Chardonnay e Gewürztraminer I terreni su cui crescono le viti dei due gruppi sono diversi (le zone sono molto lontane geograficamente), quindi potrebbe esserci una base geochimica per la discriminazione

30 La determinazione di Rb e Sr fornisce una prima discriminazione, anche se non ottimale L’analisi effettuata con ICP-MS ha generato numerose variabili, tra cui Al, Co, Mn, Mo, Rb, Sb, Sr, U, V e Zn sono state selezionate per l’analisi LDA che ha consentito di differenziare molto bene due gruppi di campioni

31 Oltre all’analisi dei vini, sono stati analizzati anche campioni di terreno dei vigneti della Okanagan Valley e della Niagara Peninsula. È interessante notare l’elevata differenza del contenuto di Sr nei terreni, che si riflette nella differenza del contenuto nei vini. L’aspetto geochimico dimostra quindi la sua importanza

32 Anche la birra è oggetto di studi chemiometrici, basati sulla determinazione elementare. Il valore commerciale delle birre non è paragonabile a quello dei vini ma ci sono comunque alcune marche di qualità superiore che possono essere imitate. La possibilità di riconoscimento è quindi interessante Studi sulla birra Nella birra l’origine di alcuni elementi è leggermente diversa rispetto al vino. Ca, K, Mg, Na e P possono originarsi nelle materie prime (orzo, luppolo) e nei lieviti; il luppolo è inoltre ricco di Fe, Mn e Zn. Al può derivare dall’uso delle lattine

33 In un primo esempio sono stati determinati Al, Ba, B, Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Sr e Zn in 32 campioni di birre di varie marche, suddivisibili in birre a basso contenuto di alcol, birre scure e birre lager L’analisi PCA dei dati ottenuti dall’analisi elementare offre una buona separazione tra birre a basso contenuto alcolico (LA), birre Lager (L) e birre scure (D). K, Mg, Mn e P sono le variabili maggiormente discriminanti

34 L’analisi LDA, effettuata su altri campioni di birra, mostra la possibilità di separare nettamente birre di quattro categorie commerciali: Lager (L), Stout o scure (S), birre di grano (W) e Ale o chiare (A). Gli elementi maggiormente discriminanti sono Fe, Cu, Mn, Mg, Ca e Na. Si noti che le birre Ale e le Stout risultano parzialmente sovrapposte: ciò è giustificato dal fatto che hanno un processo di birrificazione analogo LDA sulla birra

35 Un’ottima separazione si ha anche dal punto di vista delle materie prime. I tre gruppi di birre da orzo (B, barley), orzo miscelato con cereali (BC) e grano (W, wheat) sono facilmente distinguibili sulla base dell’analisi elementare

36 La tracciabilità può essere studiata mediante la determinazione degli elementi nei vari comparti della filiera del vino. Se la concentrazione di un elemento non viene alterata da fattori artificiali, è possibile che essa si ritrovi nel vino in maniera proporzionale alla concentrazione esistente nel terreno Per quanto riguarda la determinazione elementare, quasi mai un solo elemento può essere discriminante tra vini di provenienza geografica diversa. È più opportuno focalizzare l'attenzione sulla distribuzione di un insieme di elementi Studi di tracciabilità

37 Il significato di distribuzione consiste nel prendere in considerazione globalmente le concentrazioni di un insieme di elementi anzichè di uno solo. Il concetto di distribuzione è legato ai rapporti relativi tra gli elementi dell'insieme Es. lantanidi, Fe e Cu nel terreno, nell'uva e nel vino Significato di distribuzione LaCeNdFeCu terreno 100 µg/Kg 200 µg/Kg 10 µg/Kg 1000 mg/Kg 100 mg/Kg uva 10 µg/Kg 20 µg/Kg 1 µg/Kg 10 mg/Kg 5 mg/Kg vino 1 µg/l 2 µg/l 0.1 µg/l 10 mg/l 1 mg/l rapporto La/X 10.510variovario

38 Il legame con il territorio può essere messo in evidenza attraverso la determinazione della distribuzione elementare in un vino. La vite assorbe dal terreno sostanze minerali necessarie per il suo metabolismo. Alcuni ricercatori ritengono che la distribuzione elementare presente nel terreno, o almeno parte della distribuzione (es. REE), si ritrovi inalterata anche nelle piante che si nutrono da quel terreno, e che quindi essa ne costituisca un’impronta digitale che si propaga alle piante e a frutti Questo aspetto in realtà è piuttosto controverso in quanto non del tutto acclarato; sembra che le piante assorbano le sostanze minerali in funzione non della concentrazione totale presente nel terreno, ma dell’entità della frazione biodisponibile degli elementi presenti, formata dallo ione metallico non complessato [Fe(H2O) 6 ] 3+ biodisponibile [Fe(Cl 6 )]- complessato  non disponibile  probabilmente non assorbito Determinazione di elementi

39 Tra gli elementi in tracce o ultratracce utili per la tracciabilità ci sono i lantanidi o terre rare (REE, rare earth elements), elementi metallici aventi comportamento chimico molto simile a causa della configurazione elettronica. Questa caratteristica fa sì che la distribuzione dei lantanidi presente nel terreno potrebbe rimanere inalterata nell’uva, nel mosto e infine nel vino. Elementi aventi comportamento chimico analogo dovrebbero rispondere conseguentemente a vari processi chimico-fisici che avvengono nella filiera del vino come precipitazione, complessazione, assorbimento dalle piante. Non dovrebbe esserci, quindi, frazionamento della distribuzione, cioè impoverimento o arricchimento di alcuni dei lantanidi È necessario considerare che, negli studi di tracciabilità, la concentrazione degli elementi tende a variare in intervalli anche molto ampi passando dal terreno all’uva, al mosto e infine al vino. Non si deve quindi valutare la possibilità di tracciare mediante dati assoluti di concentrazione, ma confrontando le distribuzioni relative I lantanidi

40 Lantanio nella filiera

41 Per valutare la possibilità di impiegare i REE nella tracciabilità della filiera del vino, consideriamo la distribuzione elementare in terreno, uva, mosto e vino provenienti dalla filiera di un campione di Gavi. I dati sono normalizzati sul lantanio, il più leggero dei REE Distribuzione elementare nella filiera

42 La distribuzione dei REE nella filiera del Gavi risulta abbastanza inalterata passando dal terreno all’uva al mosto. Nel vino si hanno deviazioni della distribuzione, ma ciò puo essere dovuto al fatto che le concentrazioni di REE nel vino sono particolarmente basse e quindi i dati potrebbero non essere sufficientemente affidabili Distribuzione di REE nella filiera

43 Nella filiera del Freisa si ha lo stesso tipo di andamento, cioè una distribuzione di REE inalterata dal terreno all’uva al mosto, con deviazioni nel vino Altra filiera

44 Se prendiamo in considerazione i primi tre REE, lantanio (1), cerio (2) e praseodimio (3), notiamo come le filiere di Barbera, Brachetto d’Acqui, Gavi e Freisa siano sostanzialmente tracciabili e anche differenziabili le une dalle altre Confronto tra filiere

45 Se in molti casi gli elementi costituiscono variabili sufficienti ad ottenere una buona discriminazione tra i gruppi considerati, in altri ciò non si realizza. In particolare, se si considerano vini provenienti da regioni vitivinicole non troppo distanti, è possibile che le differenze apportate dal terreno sia insignificanti o comunque minori di quelle apportate dal processo di vinificazione o dalla varietà di uva In questi casi è opportuno supportare i dati elementari con variabili di tipo diverso, per esempio altre classi di composti o parametri chimico-fisici. Sostanze come gli aminoacidi, i composti fenolici, i composti volatili e parametri spettroscopici come le coordinate del colore o dati NMR (es. Day, Zhang e Martin 1994 e 1995) sono spesso utilizzati contemporaneamente negli studi di provenienza geografica, generando un set di dati che l’analisi multivariata può sfruttare con maggior possibilità di successo Utilizzo di variabili diverse

46 In questo studio, ricercatori italiani hanno utilizzato 29 variabili analitiche per classificare correttamente 41 vini pugliesi di provenienza certa e provenienti dalle provincie di Foggia (Puglia settentrionale), Bari (Puglia centrale), Taranto e Lecce (Puglia meridionale) Vini pugliesi Le variabili comprendevano: elementi determinati con ICP- AES (Al, B, Ba, Cu, Fe, Mn e Zn) elementi determinati con ICP- AES (Al, B, Ba, Cu, Fe, Mn e Zn) anioni inorganici determinati con cromatografia ionica (Cl -, Br -, NO 3 -, PO 4 3- e SO 4 2- ) anioni inorganici determinati con cromatografia ionica (Cl -, Br -, NO 3 -, PO 4 3- e SO 4 2- ) cationi determinati con cromatografia ionica (Na +, NH4 +, K +, Mg 2+ e Ca 2+ ) cationi determinati con cromatografia ionica (Na +, NH4 +, K +, Mg 2+ e Ca 2+ ) acidi carbossilici determinati con cromatografia ionica (tartarico, citrico, malico e lattico) acidi carbossilici determinati con cromatografia ionica (tartarico, citrico, malico e lattico) analisi di routine (densità, grado alcolico, acidità totale, estratto secco, contenuto di ceneri) analisi di routine (densità, grado alcolico, acidità totale, estratto secco, contenuto di ceneri) parametri NMR ottenuti dallo spettro 1 H dei campioni parametri NMR ottenuti dallo spettro 1 H dei campioni

47 Le analisi PCA (sx) e CA (sotto) sulle 29 variabili mostrano una classificazione buona dei vini nei gruppi attesi (nord, centro e sud della Puglia) La parziale sovrapposizione dei tre cluster richiede però il trattamento con metodi supervised come l’analisi LDA

48 L’analisi LDA consente di ottenere una perfetta separazione tra i tre gruppi. Il modello matematico permette di riconoscere esattamente alcuni campioni utilizzati per testare la classificazione Le variabili con maggior potere discriminante sembrano essere i metalli e i segnali NMR dovuti agli aminoacidi presenti

49 Naturalmente l'uso dell'analisi elementare nella classificazione geografica degli alimenti non è limitato agli alcolici. Un alimento che si presta bene a studi di classificazione mediante il profilo dei metalli è il miele, prodotto che può risentire delle peculiarità del terreno e quindi essere idoneo allo sviluppo di schemi di classificazione geografica Classificazione geografica del miele Il presupposto della classificazione è ovviamente la specificità del terreno su cui crescono le piante che fungono da substrato per le api; va tenuta in considerazione la grande variabilità di composizione che può derivare dalle varietà botaniche implicate. Nondimeno, sono attualmente in corso numerosi studi per autenticare mieli tipici di alcune zone in rapporto a imitazioni o comunque prodotti di minor qualità

50 In questo studio, sviluppato dagli stessi ricercatori citati per la classificazione dei vini Rias Baixas, sono differenziati mieli di produzione galiziana (1) che si fregiano della denominazione di origine protetta, e mieli di varia origine (2) che possono essere commercializzati come falsi Miele galiziano galiziani a minor costo. La classificazione è basata sulle variabili Li, Rb, Na, K, Mg, Zn, Cu, Fe e Mn determinate mediante spettroscopia atomica La classificazione ottenuta mediante CA è mostrata nel dendrogramma (dx) ed è soltanto discreta. Ci sono differenze significative tra i due gruppi, in particolare per il contenuto di Cu, Li e Mn che riflettono la grande acidità del suolo galiziano

51 Al'interno del set di dati c'è grande variabilità dovuta alle possibili differenze dal punto di vista botanico (mieli ottenuti da piante diverse) e ciò rende non del tutto efficiente la classificazione con CA. Migliori risultati si ottengono mediante PCA (dx) impiegando le prime tre PC

52 Come si è già dimostrato in precedenza, l'analisi isotopica è potenzialmente la tecnica più efficiente negli studi di tracciabilità degli alimenti e quindi particolarmente idonea per la classificazione degli stessi. In effetti risulta essere quella più promettente in campo agroalimentare, seppure con un numero di applicazioni limitato dall'elevato costo della strumentazione Negli esempi sul vino si è mostrata la validità degli isotopi pesanti nel collegare il terreno al prodotto finale, ma anche gli isotopi leggeri si sono in certi casi dimostrati utili Analisi isotopica

53 Nella figura a fianco sono riportati i valori di  18 O per vini provenienti da: Le differenze risultano essere significative Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo)Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo) Paesi europei temperati (Francia, Italia)Paesi europei temperati (Francia, Italia) Paesi europei freddi e umidi (Germania, Austria)Paesi europei freddi e umidi (Germania, Austria)

54 Nella figura sono riportati i valori di 87 Sr/ 86 Sr per vini da tavola (T) e vini fortificati (R) provenienti da alcune regione vinicole: Il risultati indicano che vini provenienti da regioni diverse hanno valori di 87 Sr/ 86 Sr statisticamente differenti, e quindi il parametro isotopico può costituire una promettente impronta digitale dell’origine del vino portoghesi: portoghesi: Douro (R1) Douro (R1) Dão (R2) Dão (R2) Bairrada (R3) Bairrada (R3) Borba (R4) Borba (R4) Madeira (R5) Madeira (R5) francesi: francesi: Bordeaux (R6) Bordeaux (R6)

55 Nel grafico sono evidenziati i valori di r.i. per campioni di vino provenienti dall’Europa, dalla California e dall’Australia. I vini europei sono difficilmente distinguibili, ma è interessante la netta discriminazione tra vini europei ed extraeuropei Confronto tra vini europei e non

56 Anche in questo studio si rileva una certa differenza tra vini europei ed extraeuropei

57 Valori di letteratura

58 Isotopi del boro In questo studio recentissimo si dimostra che il rapporto isotopico 11 B/ 10 B può essere utilizzato a supporto della classificazione geografica del vino. Il grafico sottostante confronta i rapporti isotopici, misurati mediante ICP-MS, in vini rossi provenienti dal Sudafrica (le tre regioni vinicole Robertson, Stellenbosch e Swartland) da Bergerac in Francia (Fr) e da Valpolicella in Italia (It) La separazione è buona; naturalmente è necessario validare il metodo tenendo conto dell'impiego di fertilizzanti e dell'acqua di irrigazione, che possono contenere boro di origine diversa. Sono quindi necessari numerosi campioni

59 Attraverso l'analisi dei rapporti isotopici di C, N e S si può avere uno strumento utile per verificare la provenienza geografica della carne, in particolare di quella bovina, e avere informazioni sul tipo di alimentazione del bestiame In questo recente studio sono stati messi a confronto campioni di carne bovina proveniente da bestie allevate in USA, Brasile e Nord Europa. Le Classificazione geografica della carne differenze nella marcatura isotopica della carne sono causate principalmente dall'alimentazione e riflettono le proporzioni di piante con cammino fotosintetico C 3 e C 4 nella dieta degli animali. Nello stesso studio si vedrà come sia possibile, per le stesse ragioni, differenziare carne da bovini allevati con metodi biologici o con metodi intensivi al'interno di una stessa regione geografica, l'Irlanda

60 La determinazione del rapporto isotopico 13 C/ 12 C contro 15 N/ 14 N fornisce un risultato sorprendente: l'ottima separazione tra campioni di provenienza americana ed europea. Ciò è legato senza dubbio all'impiego quasi esclusivo, nell'alimentazione dei capi americani, di piante C 4 come il granturco o erbe subtropicali: ciò causa valori di  13 C meno negativi (tra -12 e -8) per le carni provenienti dal continente americano C'è buona separazione anche tra campioni di carne irlandese e campioni di altra provenienza europea

61 Numerose classi di composti organici sono state impiegate negli studi di classificazione geografica. Generalmente questi studi sono volti alla semplice autenticazione, mentre è spesso impossibile impiegare queste sostanze per la tracciabilità, se non in maniera correlata con gli aspetti varietali o tecnologici Tra i vari tipi di composti organici utili si possono citare: Composti organici polifenoli polifenoli aminoacidi aminoacidi carboidrati carboidrati alcoli alcoli composti terpenici composti terpenici ammine biogene ammine biogene

62 Un alimento di discreto interesse commerciale e di non difficile adattabilità agli studi di classificazione è il sidro, bevanda alcolica ottenuta dalla fermentazione del succo di mela. Il sidro si produce in numerose nazioni con Francia, Spagna e Gran Bretagna in primo piano; esistono differenze economiche legate al territorio Nella composizione del sidro una parte importante gioca il profilo dei Il sidro polifenoli, che influenzano vari aspetti della sua qualità, come il colore, l'amarezza, l'astringenza e l'aroma. Inoltre essi sono inibitori dello sviluppo di microorganismi ed evitano alcuni difetti che si originano dall'azione di batteri lattici, oltre ad avere, come è ampiamente noto, proprietà salutistiche per la loro attività antiossidante Il profilo polifenolico del sidro dipende dalla varietà delle mele impiegate e dalle procedure di elaborazione. Ci sono cinque classi principali di polifenoli: flavan-3-oli, diidrocalconi, flavonoli, derivati dell'acido idrossicinnamico e antocianine

63 Le regioni tradizionalmente note per la qualità del loro sidro sono Bretagna e Normandia in Francia, e Asturie e Paesi Baschi in Spagna. In questo studio sono presi in considerazione campioni di sidro provenienti dai Paesi Baschi e dalla Francia. In queste due regioni la tecnica di produzione del sidro è differente e ciò si riflette nelle proprietà organolettiche dei prodotti finali e, quindi, nelle loro proprietà chimiche. Il sidro basco è secco, mentre il sidro francese contiene zuccheri residui e ha quindi una gradazione alcolica inferiore Lo studio è basato su 165 campioni di sidro delle annate 1998 e 1999. Il profilo polifenolico è determinato mediante HPLC con cui sono ricavate 27 variabili: 25 composti polifenolici, la concentrazione totale e il grado medio di polimerizzazione delle procianidine (flavan-3-oli polimerici) Sidro francese e basco

64 L'analisi CA mostra una buona separazione, con pochi campioni non rientranti nei due gruppi. In generale i sidri baschi hanno un contenuto polifenolico inferiore, il che indica che la tecnica di produzione impiegate nei Paesi Baschi causa una perdita maggiore dei polifenoli nativi dalle mele, probabilmente per fenomeni ossidativi

65 L'analisi PCA conferma la buona classificazione, pur mantenendo un piccolo gruppo di outliers. I sidri dei Paesi Baschi mostrano una maggiore omogeneità, mentre quelli francesi risentono forse della possibile differenza tra prodotti della Bretagna e della Normandia cubi: Paesi Baschi x: Francia

66 In effetti un'analisi CA limitata ai soli campioni francesi mostra una certa separazione tra sidri bretoni e sidri normanni, anche se non tale da permettere un'eventuale classificazione geografica tra i prodotti delle due regioni francesi

67 Composti organici nel miele Una buona classificazione di mieli provenienti da diversi paesi europei (sx) può essere ottenuta mediante analisi Py-MS (Pyrolysis Mass Spectrometry) che permette di identificare numerosi composti organici di varie classi La separazione diventa invece difficoltosa se si impiegano i costituenti principali del miele, cioè i carboidrati e in particolare gli oligosaccaridi (dx)

68 Il composto 3,5,4’-triidrossistilbene, più noto come trans-resveratrolo, appartiene alla classe degli stilbeni che sono composti derivati dagli acidi polifenolici. Questa sostanza, presente in molte piante ma in misura prevalente nell’uva, è diventata oggetto di numerosissime ricerche per le sue ormai accertate virtù medicamentose Il Resveratrolo L’origine di questo interesse sta nel fatto che la sua presenza è stata identificata in formulazioni erbali della tradizione popolare giapponese; attualmente, si ritiene che abbia proprietà antiinfiammatorie e anticoagulanti utili per la protezione dall’aterosclerosi e dalle malattie cardiovascolari In più, sembra che il resveratrolo possa inibire eventi cellulari associati all’insorgere e al procedere di tumori e ridurre la morte cellulare per stress ossidativi In definitiva, si tratta di uno dei composti più nobili presenti nel vino

69 Dal punto di vista biochimico, la sintesi del resveratrolo è causata in risposta a infezioni microbiche o stress nella vite, ma paradossalmente si produce anche per trattamenti chimici come l’applicazione di erbicidi e fungicidi, o per esposizione alla luce UV Nell’uva, la sintesi del resveratrolo è localizzata prevalentemente nelle cellule della buccia. Nella vinificazione in rosso, quindi, la macerazione con le bucce fa sì che i vini rossi abbiano livelli di resveratrolo maggiori rispetto ai vini bianchi Nei vini americani il livello di resveratrolo è inferiore a 1 mg/l, mentre nei vini europei la concentrazione è maggiore, soprattutto per quelli italiani, francesi e spagnoli Il contenuto di resveratrolo, oltre a caratterizzare positivamente un vino per le virtù citate, può essere utilizzato a scopo di classificazione varietale e tecnologica in quanto la concentrazione finale nel vino dipende dalla varietà di uva e dalle condizioni enologiche; in una certa misura esso fornisce informazioni utili anche per la classificazione geografica Il Resveratrolo nel vino

70 In questo studio è stato determinato il contenuto di trans-resveratrolo in campioni di vino di tutte le denominazioni di origine controllata esistenti Resveratrolo in vini greci in Grecia. L’informazione che se può trarre, oltre che a scopo di autenticazione varietale e geografica, consiste nel valutare quale tecnica enologica e quale vitigno massimizzino il contenuto di questo composto nel vino La determinazione del trans- resveratrolo non è semplice per via della relativa stabilità del composto; essa avviene mediante trattamento SPE del campione di vino per isolare la frazione contenente i composti fenolici, e successiva analisi cromatografica con HPLC per separare e quantificare gli stilbeni

71 Analisi chemiometriche: CA L’analisi a cluster sui dati mostra una prima suddivisione degli stessi in un gruppo contenente i campioni della Grecia settentrionale e alcuni gruppi contenenti i campioni della Grecia meridionale e delle Isole In media i vini del sud mostrano un livello superiore di resveratrolo, forse perchè sono prodotti in condizioni di esposizione solare più favorevole, in particolare per quelli provenienti da Rodi, Creta e Paros Dal punto di vista varietale, il vitigno Mandilaria è quello che dà vini più ricchi in resveratrolo ed è presente in tutti i vini delle isole Il livello di resveratrolo in 29 vini greci varia tra 0.550 e 2.534 mg/l, valori relativamente elevati in confronto a quanto riportato in letteratura

72 Analisi chemiometriche: PCA Nell’analisi delle Componenti Principali sono stati aggiunti ai dati dei vini greci i dati di vini spagnoli, portoghesi, francesi e giapponesi, in modo da verificare la possibilità di differenziare i vini locali da quelli esteri Dal grafico PC1-PC2 si nota che la maggior parte dei vini esteri si collocano al centro (A) mentre i vini della Grecia del sud e Isole formano due gruppi separati (B e C), così come i vini della Grecia del nord (D e E)

73 Un metodo di classificazione differente dai precedenti nei quali si sfruttano variabili formate da elementi o composti, consiste nell'impiegare parametri spettroscopici, in cui lo spettro di assorbanza o di riflettanza di un campione è la sorgente di variabili: ogni lunghezza d'onda costituisce infatti una variabile. È il caso, per esempio della tecnica Near-Infrared Spectroscopy (NIRS), cioè spettroscopia nel Vicino Infrarosso. Questa tecnica per lungo tempo è stata poco Metodi spettroscopici utilizzata dagli spettroscopisti perchè fornisce spettri di difficile interpretazione, privi di picchi e ricchi di bande larghe. Conseguentemente l'assegnazione delle bande a specifici gruppi funzionali è complesso. Tuttavia, attraverso il trattamento chemiometrico dello spettro NIR di un alimento è possibile ricavarne informazioni utili per la classificazione Spettro NIR di uno zafferano

74 Lo zafferano, ricavato dalle stigma essiccate del Crocus sativus, è noto per essere una delle spezie più costose sul mercato internazionale. La qualità commerciale dello zafferano è determinata dalle specifiche raccomandate dall'ISO Un esempio: lo zafferano (International Organization for Standardization). La qualità può essere fortemente influenzata dal trattamento dei fiori, es. a seconda delle condizioni di raccolta, di essiccamento, di conservazione o di miscelazione con parti meno nobili della pianta come lo stelo

75 Per verificare la qualità dello zafferano esistono molti test analitici, tra cui la misura di assorbanza UV-visibile a determinate per la determinazione di aroma, amarezza e potere colorante. Per esempio, l'assorbanza a 440 nm è usata per quantificare i glicosidi della crocetina (sx, β-gentobioso- crocetina), un carotenoide che costituisce il principio colorante dello zafferano

76 Le oggettive difficoltà di produrre lo zafferano con elevata qualità rendono il suo prezzo altamente variabile a seconda del tipo di trattamento e, in ultima analisi, della provenienza geografica. Lo zafferano prodotto con metodi tradizionali è generalmente di migliore qualità e quindi di maggior costo Classificazione geografica di zafferano In questo studio sono confrontate alcune caratteristiche chimico-fisiche di campioni di zafferano provenienti da Grecia, Spagna e Iran. Manca, purtroppo, un confronto con lo zafferano più caro del mondo, quello italiano. La differenziazione è ottima sulla base di variabili chimiche (dx, analisi LDA su glicosidi della crocetina), la cui determinazione con HPLC è però complessa. Ottimi risultati si possono avere con una tecnica alternativa e più semplice da applicare, ovvero impiegando lo spettro NIR tra 4000 e 10000 cm -1 dei campioni di zafferano: anche in questo caso si ha una separazione sufficiente tra i tre gruppi presi in considerazione

77 Studi misti La composizione degli alimenti è generalmente assai complessa, e ci sono molti casi in cui l'applicazione di un solo gruppo di parametri non porta ad una classificazione geografica di prodotti alimentari che sia soddisfacente. In tali frangenti è possibile ricorrere a più gruppi, es. parametri spettroscopici e variabili chimiche, in modo da poter sfruttare l'informazione legata ad aspetti diversi della natura degli alimenti studiati. Altre variabili utili possono essere quelle sensoriali

78 Vini francesi Certamente un tentativo di classificazione geografica relativo a vini francesi sembra destinato a naufragare in partenza, tale è la variabilità e la complessità del sistema Nondimeno, in questo studio sono presi in considerazione 22 vini rossi provenienti da quattro importanti regioni vinicole della Francia: Bordeaux, Borgogna, Beaujolais e Valle del Rodano I vini sono stati caratterizzati mediante dati chimico-fisici (quadro acido, alcoli, esteri, pH, polifenoli totali e colore) e sensoriali (parametri analitici e descrizioni complesse) per un totale di 51 variabili. Lo studio, pur nella sua complessità e relativa scarsità di successo nella classificazione, è interessante per il tentativo di accoppiare dati di natura diversa, in modo da individuare correlazioni

79 L'analisi sui 16 parametri sensoriali mediante PCA mostra un certo insuccesso nel classificare correttamente i quattro gruppi dal punto di vista geografico, ma individua comunque interessanti correlazioni tra i campioni e le variabili sensoriali attraverso la sovrapposizione del grafico degli scores e quello dei loadings

80 L'analisi sui 35 parametri chimico-fisici mostra una buona separazione dei vini bordolesi dagli altri, che risultano invece scarsamente differenziabili Il confronto tra il grafico degli scores (sopra) e il grafico dei loadings (dx) permette di individuare le variabili maggiormente discriminanti