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METODI DI ANALISI CROMOSOMICA I CROMOSOMI SONO BEN VISIBILI DURANTE LA FASE CENTRALE DELLA DIVISIONE CELLULARE (METAFASE) E' NECESSARIO DISPORRE DI CELLULE.

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1 METODI DI ANALISI CROMOSOMICA I CROMOSOMI SONO BEN VISIBILI DURANTE LA FASE CENTRALE DELLA DIVISIONE CELLULARE (METAFASE) E' NECESSARIO DISPORRE DI CELLULE CHE SI DIVIDONO: TESSUTI IN ATTIVA PROLIFERAZIONE NEI MAMMIFERI TESSUTI ATTIVAMENTE PROLIFERANTI SONO DIFFICILMENTE ACCESSIBILI (GONADI, MIDOLLO OSSEO, TROFOBLASTO, TUMORI) E' NECESSARIO INDURRE ARTIFICIALMENTE LA DIVISIONE CELLULARE COLTURE IN VITRO GENETICA DI CELLULE SOMATICHE

2 COLTURE IN VITRO DI CELLULE SOMATICHE N.B.B.: SI SVILUPPANO TECNICHE CHE CONSENTONO DI MANIPOLARE IN VITRO CELLULE DI EUCARIOTI MULTICELLULARI IN ANALOGIA CON QUANTO GIA' SI PUO' FARE CON LE CELLULE BATTERICHE HARRISON1907COLTURE DI CELLULE DI RANA LEWIS1911 CARREL1912 YOUNGNER1953TECNICHE DI DISSOCIAZIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO EARLE1948 TERRENI DI COLTURA, EAGLE1955 FATTORI DI CRESCITA WHITE1963PER CELLULE DI MAMMIFERRO

3 APPLICAZIONI MORFOLOGIA E FISIOLOGIA DI TESSUTI ED ORGANI BIOCHIMICA CELLULARE VIROLOGIA (CRESCITA, ISOLAMENTO, TITOLAZIONE DI VIRUS ANIMALI) FARMACOLOGIA IMMUNOLOGIA (ANTICORPI MONOCLONALI) GENETICA (IBRIDI SOMATICI) CITOGENETICA (PATOLOGIA CROMOSOMICA CITOGENETICA ONCOLOGICA)

4 REPLICAZIONE, TRASCRIZIONE, TRADUZIONE RIPARAZIONE DEL DNA INTERAZIONI VIRUS-OSPITE DIFFERENZIAMENTO CELLULARE TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA INGEGNERIA RIPRODUTTIVA CELLULE STAMINALI, COLTURE DI TESSUTI E DI ORGANI MANIPOLAZIONE GENETICA TERAPIA GENICA CLONAZIONE

5 VANTAGGI CONTROLLO AMBIENTE FISICO- CHIMICO POPOLAZIONI CELLULARI OMOGENEE ESPOSIZIONE DIRETTA A DOSI CONTROLLATE DI SOSTANZE ECONOMIA DI TEMPO E MATERIALE ALTERNATIVA ALLA SPERIMENTAZIONE ANIMALE

6 SVANTAGGI NECESSITA' DI ATTREZZATURE SOFISTICATE (ASEPSI, TEMPERATURA, PRESSIONE, TENSIONE CO 2, O 2,) LIMITI ALLA QUANTITA'DI CELLULE COLTIVABILI CONSISTEMI NON INDUSTRIALI ( g) INSTABILITA' GENETICA DURANTE LA PROGRESSIONE IN VITRO PRESSIONI SELETTIVE VARIABILI ED INCONTROLLABILI PERDITA DEL DIFFERENZIAMENTO

7 DEFINIZIONI COLTURA PRIMARIA –COLTURA INIZIATA DA CELLULE, TESSUTI, ORGANI, PRESI DIRETTAMENTE DA UN ORGANISMO. –SI CONSIDERA UNA COLTURA PRIMARIA FINO AL PRIMO PASSAGGIO (TRIPSINIZZAZIONE). LINEA CELLULARE –E’ DERIVATA DA UNA COLTURA PRIMARIA. CEPPO CELLULARE –E’ DERIVATO DA UNA COLTURA PRIMARIA O LINEA CELLULARE PER SELEZIONE O CLONAZIONE.

8 CLONE CELLULARE –POPOLAZIONE DI CELLULE DERIVATE DA UNA CELLULA SINGOLA PER MITOSI EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO (PE) –% DI CELLULE SEMINATE IN GRADO DI FORMARE COLONIE, MISURA DEL GRADO DI AUTONOMIA CELLULARE DENSITA' DI SATURAZIONE –NUMERO MASSIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO OTTENERE IN UNA PIASTRA/ FIASCA IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE INOCULO MINIMO –NUMERO MINIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO SEMINARE PER OTTENERE CRESCITA CELLULARE IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE

9 LABORATORIO DI COLTURE CELLULARI AMBIENTE STERILE: ASSOLUTA ASEPSI CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE (PREFERIBILMENTE DI SICUREZZA PER LA MANIPOLAZIONE DI MATERIALE CONTAMINATO) TERMOSTATI CON CONTROLLO DI TEMPERATURA, UMIDITA’, TENSIONE DI CO 2 E DI O 2 MICROSCOPIO ROVESCIATO (OBIETTIVI SOTTO AL PREPARATO) A CONTRASTO DI FASE ATTREZZATURA PER LA CRIOCONSERVAZIONE DELLE CELLULE

10 MATERIALE PER COLTURE CELLULARI TUTTO IL MATERIALE IN VETRO DEVE ESSERE: –LAVATO CON DETERSIVI APPOSITI ATOSSICI E SGRASSATO –STERILIZZATO IN STUFA A SECCO CON TEMPERATURE FINO A 300° O IN AUTOCLAVE A 120°-135° –IL MATERIALE CHE NON PUO’ SUBIRE TRATTAMENTI AD ALTA TEMPERATURA PUO’ ESSERE STERILIZZATO CON IPOCLORITO DI SODIO QUANDO E’ POSSIBILE E’ PREFERIBILE UTILIZZARE MATERIALE IN PLASTICA MONOUSO

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12 AMBIENTE CELLULARE SUBSTRATO FASE GASSOSA TEMPERATURA TERRENI

13 SUBSTRATO LA MAGGIOR PARTE DELLE CELLULE DI VERTEBRATI CRESCONO ADERENTI AD UN SUPPORTO SOLIDO CELLULE DRIVATE DAL TESSUTO EMATOPOIETICO CRESCONO IN SOSPENSIONE LINEE CELLULARI IMMORTALIZZATE IN VITRO O SPONTANEAMENTE TRASFORMATE POSSONO PERDERE PARZIALMENTE O COMPLETAMENTE LA ADESIVITA’

14 SUBSTRATO IL SUBSTRATO MIGLIORE E’ IL VETRO LE CELLULE PER ADERIRE AL SUPPORTO HANNO BISOGNO DI UNA SUPERFICIE CARICA LA PLASTICA USA E GETTA DEVE ESSERE PRETRATTATA: POLISTIRENE IDROFILO TRATTATO CON RAGGI  GRANDE VARIABILITA’ DELLA QUALITA’ DEL MATERIALE IN PLASTICA MONOUSO PER ALCUNE COLTURE I CONTENITORI VENGONO SATURATI CON SOSTANZE CHE FAVORISCONO LA CRESCITA

15 FASE GASSOSA TENSIONE DI O 2 –NELLA MAGGIOR PARTE DEI CASI E’ OTTIMALE LA TENSIONE DI O 2 ATMOSFERICA O DI POCO INFERIORE TENSIONE DI CO 2 –I TERRENI SONO GENERALMENTE TAMPONATI CON CARBONATO H 2 O + CO 2 H + + HCO 3 - NaHCO 3 - Na + + HCO 3 - –LO SCAMBIO DI CO 2 TRA FASE LIQUIDA E FASE GASSOSA MANTIENE IL pH DEL TERRENO COSTANTE

16 TEMPERATURA TEMPERATURA OTTIMALE PER CELLULE DI MAMMIFERO: 36.5°C +/- 0.5°C LE CELLULE RESISTONO A LUNGO A BASSE TEMPERATURE: –SOPRAVVIVONO BENE SENZA REPLICARSI A 4°C –SI CONGELANO IN AZOTO LIQUIDO A - 196°C NON TOLLERANO AUMENTI DI TEMPERATURA SUPERIORI AI 2°C

17 TERRENI pH OTTIMALE 7.4 RANGE TUTTI I TERRENI CONTENGONO UN INDICATORE DI pH: ROSSO FENOLO 7.4ROSSO 7.0ARANCIO 6.5GIALLO 7.6VIOLETTO 7.8VIOLA BASE DI TUTTI I TERRENI E’ UNA SOLUZIONE SALINA BILANCIATA (BSS) ADDIZIONATA CON: –AMINOACIDI ESSENZIALI –VITAMINE –SALI –GLUCOSIO –COMPONENTI ORGANICI (NUCLEOSIDI, PIRUVATO, LIPIDI)

18 SIERO TUTTE LE COLTURE CELLULARI NECESSITANO DI TERRENO ADDIZIONATO CON SIERO –BOVINO NEONATALE –BOVINO FETALE –DI CAVALLO –UMANO TERRENI COMPLETAMENTE DEFINITI: –SONO POCO UTILIZZATI –SONO EFFICIENTI SOLO IN POCHISSIMI CASI

19 COMPONENTI DEL SIERO PROTEINE: –ALBUMINA, FIBRONECTINA, TRANSFERRINA FATTORI DI CRESCITA: –FGF, PDGF, EGF, MSA (MOLTIPLICATION STIMULATING ACTIVITY), INSULINE LIKE GROW FACTOR ORMONI: –INSULINA, ORMONE DELLA CRESCITA, SOMATOMEDINE, IDROCORTISONE METABOLITI VARI: –AMMINOACIDI, CHETOACIDI MINERALI: –FERO, ZINCO, RAME, SELENIO  GLOBULINE

20 COLTURE PRIMARIE ESPIANTO PRIMARIO –LE CELLULE MIGRANO A PARTIRE DA UN FRAMMENTO DI TESSUTO DISGREGAZIONE DEL TESSUTO DIPENDE DALL’ABBONDANZA DEL MATERIALE DI PARTENZA: –MECCANICA –ENZIMATICA

21 REGOLE GENERALI STERILITA’ CHIRURGICA E STERILITA’ IN VITRO NON COINCIDONO IL MATERIALE PRELEVATO PUO’ ESSERE CONSERVATO PER 3-4 gg A 4°C IN TERRENO O SOLUZIONE FISIOLOGICA CONTENETE ANTIBIOTICI VA RIMOSSO TUTTO IL TESSUTO GRASSO O NECROTICO IL FRAMMENTO VA TAGLIATO CON UN BISTURI IL PIU’ FINEMENTE POSSIBILE NELLA COLTURA PRIMARIA LA CONCENTRAZIONE DI CELLULE DEVE ESSERE SEMPRE MOLTO ALTA SI DEVE SCEGLIERE UN TERRENO RICCO CON ALTA CONCENTRAZIONE DI SIERO FETALE SI IMPIANTANO MEGLIO TESSUTI EMBRIONALI

22 ALONE DI CRESCITA DA FRAMMENTO A 2 gg DALLA SEMINA COLTURA CONFLUENTE DOPO 7 gg COLTURA CONFLUENTE A 10 ggCOLTURA CONFLUENTE A 14 gg CELLULE EPITELIOIDI CELLULE FIBROBLASTOIDI

23 log 10 NUMERO DI CELLULE TEMPO IN COLTURA (generazioni cellulari) TEMPO IN COLTURA (generazioni cellulari) L’EVOLUZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE ESPIANTOESPIANTOPRIMARIOPRIMARIOESPIANTOESPIANTOPRIMARIOPRIMARIO COLTURA PRIMARIA LINEA CELLULARE CONTINUA I IISUBCOLTURASUBCOLTURAIISUBCOLTURASUBCOLTURA SENESCENZA E MORTE APOPTOSI CRISI TRASFORMAZIONE

24 UNA COLTURA PRIMARIA SUBISCE FORTI PRESSIONI SELETTIVE CHE NE CONSENTONO L’ADATTAMENTO IN VITRO UNA COLTURA PRIMARIA E’ ETEROGENEA UNA LINEA CELLULARE E’ OMOGENEA E NON NECESSARIAMENTE UGUALE ALLA COLTURA DA CUI DERIVA SE NON VENGONO USATI ACCORGIMENTI PARTICOLARI CRESCONO CELLULE PARZIALMENTE INDIFFERENZIATE CON MORFOLOGIA FIBROBLASTOIDE (FGF NEL SIERO) SI OSSERVA INSTABILITA’ GENOMICA ED ACCUMULO DI MUTAZIONI

25 MANTENIMENTO DELLA COLTURA QUANDO LE CELLULE RAGGIUNGONO LA CONFLUENZA VENGONO STACCATE DAL SUPPORTO, CONTATE, RISOSPESE AD UNA DILUIZIONE OPPORTUNA E PIASTRATE IN NUOVI CONTENITORI (CELLULE CHE CRESCONO IN SOSPENSIONE VENGONO SEMPLICEMENTE DILUITE E RISEMINATE) PER STACCARE LE CELLULE SI USA UN ENZIMA PROTEOLITICO: LA TRIPSINA QUESTA OPERAZIONE SI CHIAMA PASSAGGIO IN VITRO VENGONO FATTI CAMBI REGOLARI DI TERRENO

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27 CURVA DI CRESCITA TEMPO (ore) log 10 NUMERO DI CELLULE CRESCITA LOGARITMICA: MASSIMO INDICE MITOTICO SE LE CELLULE NON VENGONO REOLARMENTE DIVISE SI HA UN DEPERIMENTO DELLA COLTURA ED UN RALLENTAMENTO DELLA CRESCITA: DIMINUISCE L’INDICE MITOTICO, SI ARRIVA ALLA NECROSI tripsinizzazionetripsinizzazione

28 PASSAGIO IN COLTURA –OGNI VOLTA CHE LA LINEA VIENE SUBCOLTIVATA –SOLO IN ALCUNI CASI COINCIDE CON UNA GENERAZIONE CELLULARE –FIBROBLASTI DIPLOIDI SI DIVIDONO 1/1 QUINDI UN PASSAGGIO IN COLTURA COINCIDE CON UN RADDOPPIAMENTO: NUMERO DI PASSAGGI E GENERAZIONI CELLULARI COINCIDONO LINEE CELLULARI A VITA DEFINITA SI ESAURISCONO DOPO GENERAZIONI LINEE CELLULARI IMMORTALIZZATE O TUMORALI CRESCONO INDEFINITAMENTE

29 CLONAGGIO CELLULARE SEMINA DELLE CELLULE AD UNA DENSITA’ CHE PERMETTA LA CRESCITA DI CELLULE SINGOLE PERFETTAMENTE ISOLATE LA DENSITA’ MINIMA CHE CONSENTE LA CRESCITA DI SINGOLE CELLULE E’ MOLTO VARIABILE DA OGNI CELLULA DERIVA UNA POPOLAZIONE DI CELLULE FIGLIE “IL CLONE” GENETICAMENTE IDENTICHE ALLA CELLULA PROGENITRICE (SE NON SONO INTERVENUTE MUTAZIONI) I CLONI CELLULARI POSSONO ESSERE ISOLATI ED AMPLIFICATI CON VARIE PROCEDURE IL CLONAGGIO E’ UN’OPERAZIONE INDISPENSABILE PRIMA DI OGNI ESPERIMENTO, SOPRATTUTTO DI GENETICA, PER ESSERE CERTI DI AVERE UNA POPOLAZIONE CELLULARE OMOGENEA

30 INOCULO MINIMO –NUMERO MINIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO SEMINARE PER OTTENERE CRESCITA CELLULARE IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE DENSITA’ DI SATURAZIONE –NUMERO MASSIMO DI CELLULE CHE SI POSSONO OTTENERE IN UNA PIASTRA/ FIASCA IN CONDIZIONI SPERIMENTALI NOTE EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO –% DI CELLULE SEMINATE IN GRADO DI FORMARE COLONIE, MISURA DEL GRADO DI AUTONOMIA CELLULARE INIBIZIONE DA CONTATTO –INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE DOVUTA AI CONTATTI TRA CELLUILE: LA CRESCITA SI ARRESTA QUANDO FORMANO UN MONOSTRATO PIU’ O MENO CONTINUO

31 CELLULE CHE HANNO BASSO INOCULO MINIMO HANNO ALTA DENSITA’ DI SATURAZIONE POSSONO NON AVERE INIBIZIONE DA CONTATTO ED HANNO ALTA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO COLTURE PRIMARIE SONO DELICATE ED ESIGENTI: GENRALMENTE HANNO –ALTO INOCULO MINIMO –BASSA DENSITA’ DI SATURAZIONE –BASSA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO –INIBIZIONE DA CONTATTO PER LINEE TUMORALI O IMMORTALIZZATE IN VITRO E’ VERO IL CONTRARIO

32 CURVA DI CRESCITA CELLLE HeLa FIBROBLASTI UMANI CRESCITA LOGARITMICA PLATEAU log 10 NUMERO DI CELLULE TEMPO LE CELLULE VENGONO CONTATE AD INTERVALLI REGOLARI DEVONO ESSERE CONTATE SOLO LE CELLULE VIVE SI CALCOLA LA VELOCITA’ DI RADDOPPIAMENTO OPERATIVAMENTE: SI SEMINANO CLONI E SI CONATA IL NUMERO DI CELLULE PER COLONIA AD INTERVALLI REGOLARI OPPURE SI TRIPSINIZZANO LE CELLULE E SI FA UNA COLORAZIONE VITALE (CON IL COLORANTE TRIPAN BLEU)

33 CICLO CELLULARE G 2 GAP 2 MMITOSI G 1 GAP 1 SSINTESI DURATA DEL CICLO CELLULARE = TEMPO DI RADDOPPIAMENTO CALCOLO DELLA DURATA DI CIASCUNA FASE DEL CICLO CELLULARE NUMERO DI CELLULE NELLA FASE NUMERO TOTALE DI CELLULE X DURATA DEL CICLO

34 FASE M –LE CELLULE IN MITOSI SI RICONOSCONO DALLA MORFOLOGIA –INDICE MITOTICO = FRAZIONE DI CELLULE IN MITOSI, E’ UN INDICE DELLA VELOCITA’ DI CRESCITA FAE S –LE CELLULE VENGONO ESPOSTE PER BREVE TEMPO IN COLTURA A H 3 TIMIDINA, FISSATE, ANALIZZATE PER AUTORADIOGRAFIA –SI CONTANO LE CELLULE MARCATE G 1 E G 2 –DOPO SINCRONIZZAZIONE DELLA COLTURA SI CALCOLA LA DURATA DELL’INTERVALLO TRA M ED S E TRA S ED M –OPPURE SI USANO CITOFLUORIMETRI A FLUSSO CHE MISURANO IL CONTENUTO DI DNA DELLE CELLULE

35 INTENSITA’ DI FLUORESCENZA CONTENUTO DI DNA NUMERO DI CELLULE G1G1 G 2 + M S CALCOLO DELLA DURATA DELLE FASI DEL CICLO CELLULARE CON CITOFLUORIMETRI A FLUSSO

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41 TRASFORMAZIONE CELLULARE: PROPRIETA’ DELLE CELLULE TRASFORMATE CARATTRISTICHE DI CRESCITA –IMMORTALI (CRESCITA INDEFINITA) –ANCORAGGIO INDIPENDENTI –PERDITA INIBIZIONE DA CONTATTO –CRESCITA SU MNOSTRATI CONFLUENTI DI “FOCI” –INOCULO MINIMO RIDOTTO ALTA DENSITA’ DI SATURAZIONE –LIMITATA RICHIESTA DI SIERO –INDIPENDENZA DA FATTORI DI CRESCITA –ALTA EFFICIENZA DI PIASTRAMENTO –BREVE TEMPO DI RADDIPPIAMENTO

42 CARATTERISTICHE GENETICHE –ALTA FREQUENZA DI MUTAZIONE SPONTANEA –ANEUPLOIDIA –ETEROPLOIDIA –INSTABILITA’ GENOMICA GENERALIZZATA PROPRIETA’ NEOPLASTICHE –TUMORIGENE –ANGIOGENICHE –AUMENTATA SECREZIONE DI PROTEASI –INVASIVE

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