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Estrazione del DNA batterico Centrifugazione della coltura batterica Le cellule vengono trattate con lisozima che degrada la parete. La lisi cellulare.

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1 Estrazione del DNA batterico Centrifugazione della coltura batterica Le cellule vengono trattate con lisozima che degrada la parete. La lisi cellulare si ottiene mediante differenti agenti chimico-fisici: - Calore - NaOH + SDS -Sonicazione

2 Trattamento con fenolo e/o fenolo-cloroformio per allontanare le proteine. In presenza di etanolo (70%) e Na + il DNA cromosomale si arrotola sulla bacchetta di vetro. In presenza di etanolo (70%) e Na + i frammenti di DNA precipitano e possono essere raccolti mediante centrifugazione.

3 I Plasmidi Molecole circolari che replicano indipendentemente dal cromosoma, DNA extracromosomiale. I plasmidi posseggono un propria origine di replicazione (ori). I plasmidi variano in dimensione da 1,5 kb a kb. Il numero di copie per cellula può variare da 1-25 (low copy number) fino a >100 (high copy number). I plasmidi possono conferire differenti fenotipi: - resistenza e sintesi di antibiotici; - degradazione composti aromatici; - fermentazione di zuccheri; - sintesi di tossine; - sintesi di batteriocina; - induzione di tumori nelle piante; - sintesi sistemi restrizione-modificazione del DNA; - resistenza a metalli pesanti. I plasmidi possono essere coniugativi (geni tra) o non-coniugativi.

4 Replicazione di derivati di ColE1 - RNA II regolatore positivo della replicazione. - RNAI e Rop regolatori negativi della replicazione. Mutazioni nel gene rop o nel RNA I determinano un incremento del copy number

5 pBR322 The pBR322 contains the Ap R and Tc R genes of RSF2124 (a ColE1 derivative carrying a transposon specifying amp resistance) and pSC101 respectively, combined with replication element of pMB1, a ColE1-like plasmid. There are 40 enzymes with unique cleavage sites on pBR322 (4361 bp). Replicazione di pSC101 L origine (ori) contiene da 3 a 7 copie di una specifica sequenza R (17-22 bp), detta iterone. RepA si lega ai box R1, R2, e R3. RepA si autoregola interagendo con le sequenze ripetute invertite IR1 e IR2 localizzate sul suo promotore. RepA funziona da regolatore negativo (RepA è in grado di prevenire linizio della replicazione legandosi agli interoni di 2 plasmidi in modo da unirli insieme e mutazioni a carico di questa proteina determinano un aumento del numero di copie per cellula del plasmide pSC101. pos. 1 Iteroni

6 Purification of Plasmids Takes advantage of distinct topological state of plasmids. - plasmids will be covalently closed, negatively wound circles when E. coli is lysed. - chromosomal DNA will be sheared into linear, non-topologically constrained fragments (because so big). This difference can be exploited to allow purification of plasmids: - difference in binding ethidium bromide, leading to different densities (CsCl banding – Radloff et al. 1967). - different rater of re-associate of two strands following denaturation by boiling or alkaline treatment. 1) Small size 2) Origin of replication (e.g. ColE1, very high copy 500 copies per cell) 3) Multiple cloning site (MCS), often embedded in a LacZ report gene for ease of selecting inserts 4) Selectable marker genes (antibiotic resistance) 5) Some are expression vectors have sequences that allow RNA polymerase to transcribe genes 6) DNA sequencing primers 7) Over expression of the cloned protein or expression of fusion proteins Features of many modern Plasmids

7 Alkaline denaturation Birnboim & Doly (1979) Cells + Lisozyme NaOH + SDS Na-Acetate pH 5.2 Ctg. Supernatant + Phenol /chloroform Aqueous phase + Et-OH Ctg. Ctg Plasmid DNA pellet

8 bound. Also, progressively EtBr higher concentrations shift DNA supercoiling from negative to positive. At 2 g of EtBr per ml, most of DNAs are completely relaxed. The arrow indicates the free rotation of linear DNA. Plasmid DNA purification by centrifugation on EtBr-CsCl gradient The density of DNA- EtBr complex decreases as more EtBr is bound Less EtBr can bind to covalently closed circular DNA (CCC) than to a linear or nicked circular DNA. In fact a CCC DNA molecule as a plasmid has no free ends and can only unwind to limited extend, this limiting the amount of EtBr

9 Isolating Plasmids by spin column Load supernatant with plasmids onto spin column. The pellet is washed with EtOH, causing the plasmid DNA to precipitate. The plasmid DNA binds the resin in the spin column under high salt conditions. Wash the column. Finally, the purified plasmid DNA is eluted in water. Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation

10 Quality and Quantity of Nucleic Acids Legge di Beer-Lambert A = ε x l x C 1.Quantity: A 260 = DNA1 O.D. = 50 μg/ml DNA O.D. x 50 (μg/ml) x dilution factor = XX μg/ml 2.Quality: A 280 = proteinPurity = A 260 /A 280 If ratio , then assume it is a good prep. If ratio > 2, then there is RNA contamination. If ratio < 1.6, then there is protein contamination. 1 O.D. = 40 μg/ml RNA 1 O.D. = 33 μg/ml oligonucleotide dove ε è detto coefficiente di assorbimento (estensione) molare C è la concentrazione molare della soluzione e l è il cammino ottico

11 Trasformazione cellule batteriche Metodo del Calcio cloruro. Il CaCl 2 forse provoca la precipitazione del DNA sulla cellula batterica o modifica la parete migliorando il legame del DNA. Elettroporazione L'elettroporazione è una tecnica per introdurre il DNA nelle cellule applicata a protoplasti e funziona anche con le cellule animali, batteri e lieviti. L'elettroporazione consiste in una repentina scarica elettrica (millisecondi) operata in un piccolissimo contenitore che racchiude protoplasti vegetali e molecole di DNA in una sospensione liquida. La scarica apre simultaneamente la membrana plasmatica in numerosi punti (pori), permettendo alle molecole di DNA di penetrare nella cellula. Espressione geni plasmidici (37°C)

12 Construction and identification of recombinant pBR322 plasmids

13 Screening by replica plating 2) Replica plating on plates containing tet + amp 1) Master plate containing tet only 3) Cells on the replica plate are allowed to grow into colonies. Any colony present on the master plate but missing from the replica plate carries a recombinant pBR322 with DNA inserted within amp gene

14 The polylinker encodes for 18 additional amino acids that do not eliminate the function of -galactosidase Cloning Transformation (lacZ - strain) Selection on plates containing amp + IPTG + X-gal Blue colonies active -gal no insert White colonies inactive -gal insertion of foreign DNA pUC19

15 Lattosio = 4-O-( -galattopiranosil)-D-glucopiranosio galattosio glucosio enzima -galattosidasi lattosio galattosio + glucosio IPTG Isopropyl- -D-thyiogalactospyranoside Gratuitous inducer è utilizzato per indurre lattività del lac operon poiché si lega e inattiva il repressore lac, senza essere degradato dallenzima X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D- galactopyranoside Substrato cromogenico; a seguito dellazione enzimatica produce un precipitato di colore blu-indaco cleavage

16 Expression vectors pPLa2311 vector Foreign DNA is cloned into EcoRI under the control of P L promoter. Ampicillin sensitivity can be used for screening of positive clones. The vector is inserted into an E. coli strain that carries on the chromosome a temperature sensitive cI gene. At 32°C cI gene is active and produces repressor At 42°C inactivation of cI and expression of the inserted gene Standard protocol Grow cells at 30°C Shift the cells at 42°C for 10 min Grow the cells at 37°C for 30 min Collect the cells and start protein purification Located 5-10 nucleotides upstream the AUG [5-UAAGGAGG-3] It should take into consideration problems related to codon usage

17 Overproduction of a toxic gene (hns) After deletion of its own promoter the hns gene is cloned into the pPLc2833 vector which is used to transform an E. coli strain, carrying on the chromosome a mutated (Ts) cI gene. H-NS overproduction is checked by PAGE-SDS C M C = crude extract of uninduced cells 1-3 = different aliquots of crude extract of induced cells M = protein marker Time (min) Control sample (uninduced cells growing at 30°C) Induced cells H-NS

18 Vettori pET -Il gene dellRNA pol. di T7 (gene 1) viene inserito su cromosoma di E. coli sotto il controllo del promotore lac. -Il gene di interesse è clonato su vettore pET sotto il controllo del promotore di T7. -Linduzione si ottiene fornendo IPTG (analogo dellallolattosio) che legandosi al repressore LacI fa sicché questultimo non riconosca loperatore lacO. -Il gene lacI è inserito sul cromosoma di E. coli. -Il lisozima di T7, codificato dal plasmide pLysS, è in grado di legarsi alle rare molecole di RNA pol. di T7 prodotte in assenza di induzione e di inattivarle. -La presenza delloperatore lacO tra il promotore di T7 ed il gene clonato consente di ridurre ulteriormente lespressione (ad es. gene tossico) in assenza di IPTG.

19 Glutathione-S-Transferase fusion protein (1988) GST fusion protein is purified under non-denaturating conditions by adsorption to glutathione-agarose column which is subsequently eluted with glutathione. His-tag expression vector (pBAD/His plasmid) P BAD arabinose inducible promoter EK site Enterokinase cleavage site (Asp 4 -Lys) A,B,C MCS in all 3 reading frames Epitope antibody recognition araC repressor Factor X Thrombin IPTG induction using DE3 strain

20 Regolazione del promotore pBAD Cambiamenti conformazionali a carico del repressore AraC in seguito alla presenza di arabinosio determinano lattivazione del promotore pBAD La coda di istidine si lega alla colonna che contiene ioni nichel immobilizzati Purificazione della proteina ricombinante CL e FT Proteine che non si legano alla resina. W1-W5 Lavaggi con bassa concentrazione di imidazolo. E1-E2 Eluizione con elevata concentrazione di imidazolo. Proteina purificata Repressione Attivazione

21 Functional promoter is cloned into polylinker of pKK232.8 Crude cellular extracts Selection of transformed cells on plate LB+cam CAT assay Vector for promoter analysis pKK is a vector harbouring the promoterless cat gene (reporter gene). The cat gene encodes the enzyme chloroamphenicol acetyl transferase. Cat expression phenotype cam r

22 CAT Assay 1= reaction performed without crude extract 2= mix containing the different products derived from the acetylation reaction 3-12= samples TLC = chloroform: methanol (19:1)


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