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Terapia Genica. Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere: in.

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1 Terapia Genica

2 Insieme di procedimenti atti a a curare o ad alleviare una malattia modificando geneticamente le cellule dei pazienti. Può essere: in vivo ex vivo Terapia genica Il materiale è trasferito nelle cellule direttamente nel paziente Le cellule sono prelevate per inserirvi “in vitro” il materiale genetico e poi reintrodotto nel paziente

3 Terapia genica in vivo ed ex vivo

4 TERAPIA GENICA IN VIVO I geni clonati sono trasferiti direttamente nei tessuti del paziente. Rappresenta l’unica alternativa per tessuti in cui le cellule non possono essere coltivate “in vitro” in numero sufficiente (cellule cerebrali) e/o non possono essere reimpiantate nel paziente. Uso di liposomi e vettori virali. Impianto di cellule produttrici del vettore (VPC), infettate “in vitro” con un retrovirus ricombinante, in modo che le cellule VPC trasferiscano il gene alle cellule circostanti. Si richiede il trasferimento di un gene clonato in cellule patologiche, spesso si tratta di un minigene prodotto artificialmente con una sequenza di cDNA unita ad una sequenza di regolazione che induce elevati livelli di espressione Efficiente sistema di trasferimento con cellule staminali (piccola popolazione di precursori indifferenziati da cui derivano le cellule mature differenziate di ciascun tessuto). Le cellule staminali non solo producono cellule del tessuto maturo, ma hanno la capacità di rinnovarsi a dare una popolazione immortale di cellule.

5 TERAPIA GENICA EX VIVO Trapianto di cellule autologhe modificate (ad es. cellule del sistema ematopoietico, cellule della pelle, ecc.). Si tratta di una forma modificata di terapia cellulare che è una forma di cura già consolidata. Allotrapianto Allotrapianto: trapianto di cellule del midollo osseo (leucemia o altre patologie delle cellule ematiche), di cellule muscolari per tentare di curare la distrofia muscolare di D. Xenotrapianto Xenotrapianto: cellule di origine animale come i neuroni del maiale per curare il morbo di Parkinson. L’isolamento di cellule staminali embrionali umane apre prospettive interessanti dal punto di vista dei trapianti. Si potranno produrre grandi quantità di cellule sane (nervoso per curare il morbo di Parkinson, cellule  per curare il diabete, cellule del cuore e cervello).

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7 SVANTAGGI dell’INTEGRAZIONE nel CROMOSOMA - La localizzazione dei geni inseriti è casuale (possono non essere espressi o causare la morte della cellula). - Disturbo dei normali schemi di espressione dei geni che controllano la divisione e la proliferazione cellulare. La terapia ex vivo permette il controllo del fenotipo delle cellule prima di ritrasferirle nel paziente. GENI non INTEGRATI Adatti per cellule che non si dividono o che devono svolgere un’attività limitata nel tempo (uccisione di cellule cancerose).

8 Vantaggi teorici della terapia genica Correzione radicale dei difetti Possibilità di agire su meccanismi molecolari per i quali risulta estremamente difficile sviluppare farmaci specifici Vantaggi economici (se è permanente eviterebbe la necessità di trattamenti ripetuti)

9 Possibili limitazioni della terapia genica Mancanza di necessità per disponibilità di terapie alternative Mancanza di efficacia Grandi problemi tecnici Costi Effetti indesiderati (espressione non regolata, mutagenesi inserzionale, passaggio delle modifiche alla linea germinale)

10 Attuali problemi tecnici della terapia genica Efficienza di trasferimento (vettori virali migliori di non virali) Selettività del sistema di trasferimento Espressione instabile nel tempo Espressione non regolata Reazioni del sistema immunitario Problemi etici

11 Malattia pericolosa per la vita, ma dagli effetti potenzialmente reversibili Gene clonato Disponibile sistema di trasferimento genico efficiente per le cellule affette, che garantisca espressione stabile nel tempo Non richiesta regolazione precisa del gene in questione Quando si può pensare di curare una malattia con la terapia genica?

12 Le principali classi di malattie che possono essere trattate con la terapia genica comprendono:  le malattie infettive  i tumori (attivazione di un oncogene o inattivazione di un gene oncosoppressore o di un gene preposto all’apoptosi)  le malattie ereditarie  le malattie del S.I. (allergie, infiammazioni e malattie autoimmuni) A seconda del tipo di patogenesi si possono prendere in considerazione strategie differenti di terapia genica.

13 TERAPIA GENICA CLASSICA PRINCIPIO: recapitare i geni in opportune cellule bersaglio allo scopo di ottenere l’espressione ottimale dei geni introdotti. ATTIVITÀ: a) produrre la sostanza che manca b) eliminare direttamente (es. tossine) le cellule malate c) attivare le cellule del S.I. e favorire l’uccisione delle cellule TERAPIA GENICA non CONVENZIONALE PRINCIPIO : - inibire l’espressione dei geni coinvolti nella patogenesi - correggere un difetto genico Attualmente è adottata solo la terapia genica SOMATICA (i geni sono introdotti solo nelle cellule somatiche); quella GERMINALE non è ancora autorizzata

14 Incremento della dose genica Strategie terapeutiche Efficace per le patologie caratterizzate da perdita di funzione totale o parziale di un gene (ad esempio patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

15 Correzione mirata della mutazione genica Strategie terapeutiche Necessaria per le patologie causate dalla presenza di un prodotto genico alterato, che agisce attraverso un meccanismo dominante o dominante-negativo. Efficace anche nel caso di una perdita di funzione

16 Inibizione mirata dell’espressione genica Strategie terapeutiche Strategia utile per le patologie causate dalla presenza di mutazioni ad effetto dominante o dominante negativo

17 INIBIZIONE mirata dell’ESPRESSIONE GENICA in VIVO Preferiti al momento i metodi che bloccano l’espressione di un gene senza mutarlo (la mutagenesi sito-specifica per un gene è molto difficile anche se utile per malattie ad ereditarietà dominante). L’inibizione dell’espressione genica è tecnicamente possibile a tre livelli: di DNA, di RNA o di proteina

18 FILAMENTO ANTI- SENSO Il filamento di DNA che serve da stampo per creare una molecola di RNA complementare è detto anche FILAMENTO ANTI- SENSO. L’mRNA è quindi identico al filamento con senso e qualunque oligonucleotide o polinucleotide con sequenza complementare all’mRNA può essere considerato una sequenza antisenso. Tale sequenza può interferire con la traduzione legandosi all’mRNA. FARMACO ANTI-SENSO Si è così sviluppato il concetto di FARMACO ANTI-SENSO in grado di bloccare l’espressione di un gene patogeno, virale o tumorale.

19 OLIGODEOSSINUCLEOTIDI ANTI-SENSO Attraverso i liposomi possono essere trasferiti nel citoplasma e da qui possono migrare nel nucleo per diffusione passiva. Gli ODN anti-senso sono preferiti agli oligoribonucleotidi in quanto meno vulnerabili delle nucleasi e capaci di indurre la distruzione dell’mRNA al quale si legano (Rnasi H, intracellulare, taglia gli ibridi DNA-RNA). I problemi all’uso sono legati al possibile ripiegamento degli RNA bersaglio e all’associazione con proteine specifiche. ACIDI NUCLEICI PEPTIDICI Prodotti artificialmente, le basi sono attaccate ad uno scheletro pseudopeptidico, mentre quello fosfodiesterico è rimosso. Sono più flessibili e più resistenti degli ODN anti-senso. RIBOZIMI RNA capaci di abbassare l’E att funzionando così da enzimi. Possiedono una sequenza di riconoscimento della molecola di RNA bersaglio ed una componente catalitica che taglia l’RNA bersaglio, inattivandolo.

20 RNA-interference RNAi Inibizione mirata dell’espressione genica

21 Ribozimi RNAi Inibizione mirata dell’espressione genica

22 Ribozimi “a martello” geneticamente rimaneggiati

23 ANTICORPI INTRACELLULARI (INTRACORPI) Recentemente è stato possibile progettare geni che codificano anticorpi intracellulari. Gli Intracorpi sono progettati in modo da essere costituiti da un’unica catena, grazie all’associazione del dominio variabile della catena pesante con il dominio variabile della catena leggera tramite una connessione peptidica, mantenendo l’affinità dell’anticorpo originario. Gli intracorpi possono essere diretti verso un particolare comparto cellulare, dove possono legarsi ed inattivare una specifica molecola (ad es., una proteina responsabile di malattia). APTAMERI OLIGONUCLEOTIDICI Sono oligonucleotidi che possono legarsi ad una determinata sequenza proteica bersaglio. L’oligonucleotide legato può essere eluito dalla proteina e sequenziato per identificarne la specifica sequenza di riconoscimento.  attualmente, sono allo studio le possibili potenzialità terapeutiche di questa tecnologia

24 PROTEINE MUTANTI Le mutazioni che si incontrano in natura, caratterizzate da un’acquisizione di funzione, possono comportare la produzione di un polipeptide mutante che si leghi alla proteina di tipo selvatico, inibendone il funzionamento. In alcuni casi, è possibile attuare una terapia genica tramite la progettazione di geni che codifichino una proteina mutante in grado di legarsi in modo specifico e di inibire una seconda proteina.

25 CORREZIONE TERAPEUTICA a LIVELLO di DNA Un possibile modo di correggere un difetto genico è quello di usare TECNICHE di MUTAGENESI MIRATA; tuttavia, nonostante sia migliorata la conoscenza sui meccanismi della mutagenesi mirata basata sulla ricombinazione omologa nelle cellule degli eucarioti complessi, l’ efficienza della ricombinazione omologa in questi sistemi resta scarsissima e permangono problemi nell’applicazione in vivo. CORREZIONE TERAPEUTICA a LIVELLO di RNA Rappresenta un diverso approccio. - Una possibilità è quella di usare un ribozima terapeutico. Un metodo prevede l’utilizzo di una classe di ribozimi, noti come INTRONI di GRUPPPO I, che si distinguono per la loro capacità di ripiegarsi secondo una forma molto specifica in grado sia di tagliare, sia di rimontare l’RNA.  Tecnologia ancora agli inizi: risulta necessario migliorare l’efficienza catalitica. - Una seconda possibilità è la correzione terapeutica dell’RNA, che consiste nell’uso di un oligonucleotide di RNA complementare da far legare in modo specifico a un trascritto mutante in corrispondenza della sequenza contenente la mutazione puntiforme patogena, e di un enzima per la correzione dell’RNA, come l’adenosina-deaminasi dell’RNA a doppio filamento, per determinare la necessaria modificazione della base.

26 Uccisione diretta di cellule patologiche Strategie terapeutiche

27 Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario Strategie terapeutiche


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