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CHIMICA NALITICA TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE Le tecniche separative hanno come primo obbiettivo la separazione degli analiti nel campione. Sono impiegate.

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1 CHIMICA NALITICA TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE Le tecniche separative hanno come primo obbiettivo la separazione degli analiti nel campione. Sono impiegate quando i campioni sono molto complessi. La identificazione è affidata a tecniche di rivelazione adatte (es: spettrofotometria, spettrometria di massa).

2 CHIMICA NALITICA LA CROMATOGRAFIA La cromatografia opera secondo lo stesso principio della estrazione ma una fase (fase stazionaria) viene mantenuta fissa ed un’altra passa attraverso di essa (fase mobile)

3 CHIMICA NALITICA Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. IL PICCO CROMATOGRAFICO t r viene misurato nel punto di massimo del picco

4 CHIMICA NALITICA Altre caratteristiche del picco sono: l’area (l’integrale sotto il picco) che è proporzionale alla quantità di analita ed è quindi utilizzata per le analisi quantitative; l’altezza del picco, che viene misurata in corrispondenza del massimo del picco. Nel caso ideale di riproducibilità dei risultati e simmetria dei picchi elevate, anche l’altezza del picco può essere usata a scopi quantitativi. IL PICCO CROMATOGRAFICO Area del picco Altezza del picco

5 CHIMICA NALITICA IL PROCESSO SEPARATIVO Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi. Un analita che non interagisce con la fase stazionaria viaggia con la stessa velocità della fase mobile e viene eluito in un volume di fase mobile corrispondente al volume della colonna (volume morto, V M ). Il tempo di eluizione di questo composto si chiama tempo morto (t M ). Un composto che interagisce con la fase stazionaria viene ritardato ed eluisce in un volume di fase mobile maggiore (volume di ritenzione, V R ), che corrisponde ad un tempo di eluizione caratteristico, chiamato tempo di ritenzione (t R ). Per ogni composto si può calcolare un tempo di ritenzione corretto (t’ R ): t’ R = t R - t M

6 CHIMICA NALITICA Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale. Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale. FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA

7 CHIMICA NALITICA L’efficienza separativa è quindi definita dal numero di piatti ed è misurabile dalla larghezza del picco. Il numero di piatti teorici può essere calcolato conoscendo il tempo di ritenzione del picco e la sua ampiezza a metà altezza o ampiezza alla base. MISURA DELL’ EFFICIENZA t R N= 16 W b 2 t R = tempo di ritenzione w h = ampiezza a metà altezza w b = ampiezza alla base t R N= 5.54 W h 2

8 CHIMICA NALITICA DETERMINAZIONE DI N Poiché l’ampiezza a metà altezza può essere misurata con maggiore accuratezza, questa formula è preferita. Esempio: due picchi caratterizzati dallo stesso tempo di ritenzione e diverso numero di piatti teorici. t R N= 5.54 W h 2

9 CHIMICA NALITICA FATTORE DI CAPACITA` Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. k’ (fattore di capacità) = (t R - t M ) / t M = t’ R / t M

10 CHIMICA NALITICA tempo morto CALCOLO DEL FATTORE DI CAPACITA` k’ (fattore di capacità) = (t R - t M ) / t M k’ = 1,7k’ = 3,5k’ = 5,

11 CHIMICA NALITICA La selettività viene misurata mediante  (fattore di separazione o ritenzione relativa), che è il rapporto dei fattori di capacità di due picchi. La selettività misura le differenze di interazioni tra i composti e la fase stazionaria. SELETTIVITA’ volume morto k = 1,7k = 3,5k = 5,  1,2 = 2  2,3 = 1,5 = 1 per due picchi totalmente sovrapposti ed aumenta all’aumentare della separazione tra i due picchi. Un valore basso di  indica che la separazione dei due picchi è molto difficoltosa e richiede un’efficienza elevata.

12 CHIMICA NALITICA La risoluzione misura il grado di separazione tra due picchi. E’ calcolata come la differenza tra i tempi di ritenzione di due picchi divisa per l’ampiezza media dei due picchi alla linea di base. R (risoluzione) = 2 (t R(B) – t R(A) ) / (W b(A) + W b(B) ) RISOLUZIONE W b(A) W b(B) t R(A) t R(B)

13 CHIMICA NALITICA DIPENDENZA DELLA RISOLUZIONE 3 - Efficienza. La larghezza del picco è funzione dell’efficienza. Maggiore è l’efficienza più stretti risultano i picchi e perciò migliore è la risoluzione. 2 - Selettività. Esprime la posizione relativa di due picchi. Maggiore è la differenza tra i coefficienti di distribuzione degli analiti tra le due fasi, maggiore la selettività. Un aumento di selettività, aumenta la risoluzione. 1 - Fattore di Capacità. Descrive l’equilibrio che si instaura tra analiti - fase stazionaria e fase mobile. In genere si cerca di ottenere k’ compreso tra 2 e 10 per tutti gli analiti: k’ 10 comporta tempi di analisi lunghi ed allargamento del picco. WAWA WBWB t r(A) t r(B)

14 CHIMICA NALITICA SOMMARIO DELLE ESPRESSIONI

15 CHIMICA NALITICA TIPI DI CROMATOGRAFIA GAS CROMATOGRAFIA: fase mobile gassosa CROMATOGRAFIA LIQUIDA: fase mobile liquida

16 CHIMICA NALITICA GAS CROMATOGRAFIA (GC)

17 CHIMICA NALITICA Confronto tra colonne impaccate e capillari

18 CHIMICA NALITICA Le colonne capillari

19 CHIMICA NALITICA Confronto tra colonne capillari

20 CHIMICA NALITICA Polarità: un criterio per scegliere la fase stazionaria

21 CHIMICA NALITICA Alcune fasi stazionarie di uso comune per GLC capillare

22 CHIMICA NALITICA Programmazione della temperatura di lavoro Confronto tra cromatografia a temperatura costante (isoterma, caso a) e a temperatura programmata (caso b) di idrocarburi lineari

23 CHIMICA NALITICA I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna Equazione di Clausius-Clapeyron p = tensione di vapore  v H = variazione di entalpia di vaporizzazione TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC

24 CHIMICA NALITICA RIVELATORI PER GC

25 CHIMICA NALITICA Rivelatore a termoconducibilità (TCD)

26 CHIMICA NALITICA Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)

27 CHIMICA NALITICA Rivelatore a cattura elettronica (ECD)

28 CHIMICA NALITICA CROMATOGRAFIA LIQUIDA ….forense: vediamo Catherine mentre prepara campioni per HPLC…. (da CSI, M. Helgenberger) La Cromatografia Liquida è diventata una tecnica analitica indispensabile in molti settori: farmaceutico, biologico, biomedico, clinico e …..

29 CHIMICA NALITICA HPLC CROMATOGRAFIA LIQUIDA Durante il processo cromatografico la velocità con la quale ciascun analita procede lungo la colonna dipende dalle interazioni che stabilisce con la fase mobile e stazionaria, quindi la separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione delle singole molecole nelle due fasi. La definizione HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) in origine riferita alle elevate pressioni di esercizio caratteristiche di questa tecnica, è stata oggi sostituita con High Performance Liquid Chromatography o semplicemente Liquid Chromatography (LC).

30 CHIMICA NALITICA IL SISTEMA HPLC I componenti fondamentali del sistema HPLC sono: una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione; un sistema di introduzione del campione; una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione; un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna; il grafico della risposta del rivelatore in funzione del tempo è chiamato cromatogramma.

31 CHIMICA NALITICA IL SISTEMA HPLC Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile miscelatore pompa sistema di introduzione del campione precolonna e colonna rivelatore computer raccoglitore di frazioni

32 CHIMICA NALITICA STRUMENTAZIONE HPLC

33 CHIMICA NALITICA Pompa HPLC a pistoni reciprocanti

34 CHIMICA NALITICA Iniettore HPLC a loop

35 CHIMICA NALITICA LA COLONNA LC Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

36 CHIMICA NALITICA TIPI DI LC SU COLONNA I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione: cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento. cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide. cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti. cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti.

37 CHIMICA NALITICA LC DI SCAMBIO IONICO (IEC) La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti. Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili flusso

38 CHIMICA NALITICA La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni. LC DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) flusso

39 CHIMICA NALITICA SEC di proteine intere 1: Tiroglobulina (669 kD) 2: Catalasi (669 kD) 3: BSA (67 kD) 4: Ovalbumina (43 kD) 5: Ribonucleasi (13.4 kD)

40 CHIMICA NALITICA Esempi di fasi stazionarie per SEC

41 CHIMICA NALITICA LC DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un solido. La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido. La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile (solubilità relativa). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso

42 CHIMICA NALITICA LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. FASE NORMALE E IN FASE INVERSA

43 CHIMICA NALITICA FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa. LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

44 CHIMICA NALITICA La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C 18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP) Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH SUPPORTO SILICEO FASE STAZIONARIA LIQUIDA

45 CHIMICA NALITICA Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Si O OH Si OH Si O OH Si O DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE

46 CHIMICA NALITICA I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end- capping rende i silanoli inaccessibili alle molecole di soluto. DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (END-CAPPING) Si O OH Si OH Si O OH Si O

47 CHIMICA NALITICA FASI MOBILI IN LC In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi).

48 CHIMICA NALITICA SCELTA DELLA FASE MOBILE IN LC La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

49 CHIMICA NALITICA SERIE ELUOTROPICA E CUTOFF UV DI SOLVENTI PER FASI MOBILI Non tutti i solventi possono essere utilizzati in LC.

50 CHIMICA NALITICA Rivelatori per LC

51 CHIMICA NALITICA Rivelatore ad indice di rifrazione (RI)

52 CHIMICA NALITICA Rivelatore RI: disegno costruttivo

53 CHIMICA NALITICA Tecniche LC: criteri di scelta / P.M.< 2000

54 CHIMICA NALITICA Tecniche LC: criteri di scelta / 2000 < P.M.<


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