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Colture a termine La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado.

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Presentazione sul tema: "Colture a termine La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado."— Transcript della presentazione:

1 Colture a termine La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte. Colture continue Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza

2 Colture cellulari aderentiin sospensione Ladesione è un fenomeno attivo che richiede linterazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura

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5 Terreni per colture MEMMinimum Essential Medium DMEMDulbeccos Modification of MEM RPMIRoswell Park Memorial Institute La soluzione di sali, glucosio, amminoacidi e vitamine costituisce il terreno base Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in a.a. e sali e per la concentrazione di glucosio Il sistema tampone utilizzato nei terreni è: HCO 3 - / H 2 CO 3

6 H 2 CO 3 deriva dalla CO 2 dellatmosfera e in parte da quella prodotta dalle cellule Per questo motivo le cellule devono essere coltivate in atmosfera al 5% di CO 2 e necessitano pertanto di incubatori con sistema di controllo dellatmosfera! Altri sistemi tampone: HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-(2-ethanesulfonicacid) I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive i devono essere manipolate per tempi lunghi fuori dallincubatore. In questo caso la CO 2 dellatmosfera non è sufficiente a mantenere il pH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno per le cellule

7 I terreni inoltre sono provvisti dellindicatore rosso fenolo > 7.6 pH Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa dellacidificazione prodotta dalla CO 2 proveniente dal metabolismo cellulare. Il colore viola india che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO 2 è errata

8 Il terreno al momento delluso viene completato con: Glutammina (è un amminoacido labile) Antibiotici Siero (in genere al 10%)

9 Colture di cellule aderenti Le cellule aderenti vengono poste in piastra e crescono fino ad occupare lintera superficie disponibile Coltura confluente A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere trasferite in nuove piastre

10 Per staccare le cellule dal fondo si utilizza una soluzione di EDTA e tripsina EDTA = chela il Ca ++ ed il Mg ++ indispensabili per ladesione Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti. Le cellule staccate devono essere riseminate e non crescono in modo efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di sotto di una certa densità

11 Diagramma di crescita cellulare in vitro arresto della crescita a confluenza fase logaritmica di crescita

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13 Test di vitalità cellulare Saggio con il Blu Tripano Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte

14 Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio MTT (giallo) mitocondrio Formazano Colore (azzurro) MTT

15 Piastre da coltura cellulare Le piastre per colture batteriche possono essere usate per colture cellulari in sospensione ma non per colture cellulari aderenti Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente. In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono ladesione di diversi tipi di cellule

16 E importante la dimensione della piastra per la densità di semina Piastra da 5 cm di diametroArea di 20 cm 2 Piastra da 9 cm di diametroArea di 60 cm 2

17 Parametri critici per le colture cellulari Temperatura Le cellule possono sopportare lipotermia (sono conservate congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente disturbata. Non possono sopportare lipertermia (Anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule). Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per apoptosi

18 Due prove permettono di misurare linfluenza della temperatura sullo sviluppo delle cellule: - La valutazione dellefficienza di un enzima mitocondriale.

19 - La valutazione della quantità di proteine sintetizzate dalla popolazione delle cellule.

20 In un incubatore a CO 2 il paramentro di temperatura è direttamente collegato con lumidità relativa (RH %) Lenergia fornita dallincubatore serve sia a mantenere la temperatura che ad evaporare lacqua dallapposito vassoio per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale. Umidità relativa (RH %) Lumidità relativa RH è un parametro che è portato ad un livello elevato senza necessariamente essere controllato. Lobiettivo è di limitare levaporazione dellacqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione osmotica.

21 La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello molto elevato di RH nella camera (RH >98%) evitando la condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti nellincubatore. Le goccioline di condensazione costituirebbero un ambiente ideale per la contaminazione e lo sviluppo di organismi dispersi nellaria che entrano durante lapertura dellincubatore. Il pH E molto importante il sistema tampone che interviene verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il metabolismo cellulare ha prodotto H +

22 CO 2 La pressione parziale di CO 2 usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO 2 misurata allinterno dei tessuti (35-45 mmHg). In questo modo lincubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

23 Prevenzione della contaminazione Sono possibili differenti tipi di contaminazione - contaminazione da microorganismi dispersi nellaria - contaminazione da biofilm - contaminazione proveniente dal campione - contaminazione incrociata

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