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FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI ENZIMATICA Lanalisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni:

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1 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI ENZIMATICA Lanalisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: attività cataliticadeterminazione dell attività catalitica di enzimi concentrazionedeterminazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi concentrazionedeterminazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

2 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo Sono caratterizzati da: potere catalitico -elevato potere catalitico specificità -altissima specificità ENZIMI E + S ES E + P

3 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ENZIMI X G G Y Reazione non catalizzata G* Reazione catalizzata Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: – Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 10 6 a più veloci di quelle non catalizzate. – Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche – Gli Enzimi spesso hanno unelevata specificità verso substrati e prodotti. – Lattività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

4 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE COFATTORI ENZIMATICI -Oloproteine lattività dipende soltanto dalla struttura proteica -Eteroproteine: lattività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori Il cofattore può essere: -un coenzima (NAD +, NADP +, ADP, ATP) -un gruppo prostetico (FMN, FAD) -uno ione metallico (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Zn 2+, Mn 2+ ) APOENZIMA (Parte proteica) OLOENZIMA coenzima ione metallico gruppo prostetico (legato covalentemente)

5 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE VITAMINE: precursori di coenzimi COFATTORI

6 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI 1.ossidoreduttasi 2.transferasi 3.idrolasi 4.liasi 5.isomerasi 6.ligasi Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura generale delle reazioni catalizzate: Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta comprendono delle sotto-sottoclassi Un enzima ha generalmente: -un nome comune -un nome sistematico -un numero di classificazione

7 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE NOMENCLATURA

8 UNITÀ DI MISURA Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina attività cataliticaDa un punto di vista analitico interessa invece la misura dellattività catalitica (o attività enzimatica) (U.I.)Lattività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.) Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al minuto in condizioni standardizzate

9 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE G6125 Glucose Oxidase Aspergillus niger Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms -D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC NumberEINECS MDL numberMFCD Analysis NoteProtein determined by Biuret method. CautionSome loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. LinkageThis preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of -D-glucose to D-gluconolactone and H 2 O 2 per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O 2 uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. Properties storage temp. 20°C foreign activity Catalase2 Sigma units/mg solid foreign activityamylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % References MerckMerck13, 4473 Safety Information Hazard CodesXn Risk Statements42 Safety Statements22-45 RTECSRQ

10 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE P6782 Peroxidase horseradish Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder SynonymsHorseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL numberMFCD Analysis NoteThis product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid LinkageSimilar to P8375 PackagingPackaged in mg solid Unit DefinitionOne ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Analysis NoteUsing 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. Analysis NoteThe RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A 403 /A 275 determined at mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. Unit DefinitionOne unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C. Description

11 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp. buffered aqueous solution units/mg protein (biuret) SynonymsCholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number MDL numberMFCD Unit DefinitionOne unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical formSolution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 storage temp. 20°C LiteratureSmith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977) Identifiers Description Properties References

12 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Glucose Dehydrogenase Bacillus megaterium BioChemika ~33 units/mg Identifiers Synonyms -D-Glucose: NAD[P] + 1-oxidoreductase CAS Number Enzyme Commission (EC) Number EG/EC Number MDL numberMFCD Description MiscellaneousNADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmol-D-glucose to D- glucono--lactone per minute at pH 7.6 and 25°C Properties mol wtM r ~ storage temp. 20°C References LiteratureA. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990) 49165

13 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH 1 4 subunità H LDH 2 3 subunità H e da una M (H 3 M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH 3 (H 2 M 2 ) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH 4 (HM 3 ) LDH 5 (M 4 ) (fegato e muscoli scheletrici)

14 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI Metodi elettroforetici Metodi cromatografici Metodi di elettrofocalizzazione METODI NON SELETTIVI

15 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI METODI SELETTIVI Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,… Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi Inibizione immunologica Anticorpi Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH 1

16 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Infarto miocardico

17 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI

18 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE Lenergia libera di attivazione G è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione stato iniziale stato finale stato di transizione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) cambiamento totale di energia libera durante la reazione direzione della reazione energia libera Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando lenergia libera di attivazione Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione aumentando la velocità delle reazioni chimicheQuindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche E + S ES E + P

19 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ATTIVITÀ ENZIMATICA attività di un enzimaLattività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata velocità di reazioneLa velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nellunità di tempo La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico- fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

20 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CINETICA CHIMICA Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dellordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti 1° ordineReazioni di 1° ordine A P A + B P 2 A P 2° ordineReazioni di 2° ordine ordine 0Reazioni di ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti

21 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta A P E A P In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso Il grafico velocità-concentrazione è uniperbole rettangolare, descritta da unequazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e K m sono due costanti [substrato] velocità CINETICA ENZIMATICA v max

22 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN Lequazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità- concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è lequazione di Michaelis-Menten Come già detto, V max è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi V max = k 2 [ES] Ad alte concentrazioni di substrato lenzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui V max = k 2 [E] Lequazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

23 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni ][s K m >> 1° ordine Regione 1 La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato ][][ 2 K sE k v m ][ max K sV m CINETICA ENZIMATICA

24 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico ][s intermedieordine misto v max V max 2 V ][s K m >> ordine 0 Regione 3 ][ 2 E k v max V Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica CINETICA ENZIMATICA

25 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE CINETICA ENZIMATICA Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico intermedieordine misto v Regione 3 Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica ordine 0 >> Velocità della reazione [s]

26 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE tempo [P] velocita inizialeLa misura di attivita enzimatica e una misura di velocita iniziale della reazione (v 0 ) o (v i ) Vantaggi: Si misura sicuramente la V max Lenzima è in buone condizioni Non ci sono problemi di inibizione da prodotto Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse Metodi analitici rapidi 12

27 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ( s/ T) Approccio dispendioso in termini di tempo metodi ad un punto, a due punti, multipunto Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipunto tempo Segnale analitico s t DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

28 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Teoricamente sarebbe possibile misurare lattività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau Maggiore è lattività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: –difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) –tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse tempo [P] DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

29 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI AD UN PUNTO Affinchè la misura sia accurata: –il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo –ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo linizio della reazione Si risale allattività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione tempo segnale txtx SxSx La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo linizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

30 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI AD UN PUNTO Ci sono due approcci per lesecuzione di metodi ad un punto analizzatori discretiMetodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici -Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore) analizzatori a flussoMetodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici -Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema Approccio tecnico DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

31 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI A DUE PUNTI Affinchè la misura sia accurata: ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t 1 e t 2 ai quali viene eseguita la misura Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo linizio della reazione Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché lattività enzimatica viene calcolata come S / t tempo segnale t1t1 S1S1 t2t2 S2S2 DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

32 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI A DUE PUNTI Ci sono due approcci per lesecuzione di metodi a due punti analizzatori discretiMetodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici -Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura -A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale analizzatori a flussoMetodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici -La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa -Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure Approccio tecnico DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

33 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ENZIMI IN DIAGNOSTICA Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma –Aumento del turnover cellulare –Proliferazione cellulare (neoplasia) –Aumento di sintesi enzimatica (induzione) –Lesione di un tessuto –Ostruzione della secrezione –Diminuzione della eliminazione (clearance) Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da: -sintesi dellenzima -stato dintegrità delle membrane cellulari -fenomeni di distribuzione -velocità di eliminazione

34 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Alcuni enzimi del plasma EnzimaOrganoCause di aumentoNote Fosfatasi alcalina (ALP) Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale Gravidanza, infanzia Osteomalacia, cirrosi epatica, Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale Isoenzimi identificabili per elettroforesi Fosfatasi acida ProstataTumore prostaticoEnzima labile Aspartato transami-nasi (AST o GOT) Fegato e miocardio Epatite/necrosi epatica, Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica Fisiologico in neonati Normale: ALTAST Gamma glutamil transferasi (GGT) Fegato, rene, pancreas Colestasi epatica Epatite, cirrosi, pancreatite Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca Marker di sindromi epatobiliari Creatin chinasi (CK) Distrofia muscolare, infarto del miocardioBB cervello MB cuore MM muscolo AmilasiGhiandole salivari, pancreas Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari Lattato Deidrogenasi (LDH) Isoenzimi danno indicazioni più specifiche Alanina Transaminasi (ALT o GPT) FegatoAumenta in epatiti e cirrosi Colineste-rasiFegatoLivello basso indica disfunzione epatica

35 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE EFFETTO DEL pH Il profilo a campana è il più comune 6810 tripsina 6810 colinesterasi 468 papaina 246 pepsina pH attività enzimatica relativa

36 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE EFFETTO DELLA TEMPERATURA Gli enzimi hanno diversa stabilità termica La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica T (°C) attività enzimatica relativa

37 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE MISURA DI ATTIVITA ENZIMATICA Reazioni enzimatiche semplici Condizioni sperimentali –Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso –pH e Temperatura controllati rigorosamente –Attenzione alla inibizione da substrato S E P DETERMINAZIONE ATTIVITA ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

38 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE MISURA DI ATTIVITA ENZIMATICA Reazioni enzimatiche accoppiate Altre condizioni peculiari –La reazione primaria deve essere lunico fattore limitante –Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente –può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria –può seguire una via metabolica diversa Per misure di almeno il 96% dellattività enzimatica primaria k 2 / k S E prim. P1P1 E ind. P3P3 E aus. P2P2 S E prim. P1P1 E ind. P2P2 k1k1 k2k2 Condizioni sperimentali –Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso –pH e Temperatura controllati rigorosamente

39 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE DETERMINAZIONE DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI strumenti analiticiGli enzimi non sono loggetto dellanalisi, ma vengono utilizzati come strumenti analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse con i seguenti vantaggi: –Lelevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso lanalisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione –Lelevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapiditàMaggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

40 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni ][s K m >> 1° ordine Regione 1 La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato ][][ 2 K sE k v m ][ max K sV m CINETICA ENZIMATICA

41 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI Esempio: acido lattico Per spostare la reazione dallequilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano –Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica –Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina) Acido lattico Acido lattico + NAD + Acido piruvico + NADH + H + LDH S E ind. P –Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente DETERMINAZIONE DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

42 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI –La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato Condizioni sperimentali –Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso –pH e Temperatura ottimali S E aus. P1P1 E ind. P2P2 DETERMINAZIONE DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

43 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI DI MISURA La possibilità di vedere una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse Tali proprietà devono poter essere misurabili I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono: –spettrofotometrici –luminometrici Altri metodi sono: –potenziometrici, conduttometrici, polarografici Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati

44 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati e si basano su: I.Misura diretta II.Misura mediante derivati chimici III.Misura mediante derivati generati enzimaticamente

45 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici) –Esempio: p-nitrofenilfosfato +H 2 O p-nitrofenolo + fosfato fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo) Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nellUV (gruppi ciclici e doppi legami) –Esempio: uricasi rivelata mediante lassorbimento a 293 nm dellacido urico che viene trasformato dallenzima in allantoina Inconvenienti della misura di assorbimento nellUV: –lampada a idrogeno per generare nm –cuvette di quarzo costose –proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nellUV I.Misura diretta AP

46 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Lattività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P) + Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm –Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico –Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo Lunghezza donda (nm) Assorbanza I.Misura diretta

47 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare II.Misura mediante derivati chimici N R3CR3C NR 2 N+R1N+R1 N Cl - N CR 3 R2NR2N + N N N R3CR3C NR 2 N+N+ N RxRx RyRy 2Cl - Sale monotetrazolicoSale ditetrazolico R = gruppi aromatici

48 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Il valore di dei formazani ( m 2 /mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H ( m 2 /mol), perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = bc) Etanolo Acetaldeide NAD + NADH + H + PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Alcol deidrogenasi II.Misura mediante derivati chimici

49 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI III.Misura mediante derivati generati enzimaticamente Accoppiamento con ossidoreduttasi YH 2 + NAD(P) + Y + NAD(P)H + H + X + NAD(P)H + H + XH 2 + NAD(P) + Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH) 2-Oxoglutarato Glutammato Alanina Piruvato Lattato NADH + H + NAD +ALTLDH

50 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Accoppiamento con perossidasi Esempio: glucosio ossidasi Glucosio Acido gluconico H 2 O + O 2 H2O2H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico Prodotto colorato o fotoni Glucosio ossidasi Perossidasi III.Misura mediante derivati generati enzimaticamente

51 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI SPETTROFOTOMETRICI Esempio: fosfolipasi Fosfatidilcolina + 2H 2 O Acido fosfatidico + Colina Fosfolipasi Colina + 2O 2 Betaina + 2H 2 O 2 Colina ossidasi 2H 2 O 2 + Accettore Prodotto colorato + 2H 2 O + O 2 Perossidasi Accoppiamento con perossidasi III.Misura mediante derivati generati enzimaticamente

52 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ASPETTI QUANTITATIVI interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione costruita con degli standard a concentrazione nota di analita confronto con ununico standard, attraverso la relazione derivante dalla legge di Lambert-Beer concentrazione dellanalita Nel caso della concentrazione dellanalita nel campione tramite enzimi, nei metodi spettrofotometrici questa viene determinata mediante: Quando non si dispone di uno standard puro, la concentrazione dellanalita viene ricavata mediante il coefficiente di estinzione molare del prodotto colorato, sfruttando la legge di Lambert-Beer

53 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ASPETTI QUANTITATIVI Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione e del volume v del campione: Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da applicare funzioni che tengono conto di questi fattori

54 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI NON SPETTROFOTOMETRICI Misure conduttimetriche CO(NH 2 ) 2 + H 2 O 2NH CO 3 2-Ureasi Esempio Utilizzo di elettrodo specifico per NH 4 + Misure polarografiche glucosio + O 2 acido gluconico + H 2 O 2 Glucosio ossidasi Esempio Utilizzo di elettrodo selettivo per O 2 È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio perossidasi accettoreprodotto colorato derivatizzazione chimica

55 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI NON SPETTROFOTOMETRICI Misure potenziometriche triacilgliceroli + H 2 O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi - + H +Lipasi Esempio Utilizzo di elettrodo per H + (misura di pH) Misure microcalorimetriche Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche

56 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ENZIMI IMMOBILIZZATI Vantaggi Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi) Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili) Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici

57 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi Lurea permea il gel dove viene idrolizzata dallenzima formando ioni ammonio Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico CO(NH 2 ) 2 CO(NH 2 ) 2 + 2H 2 O + H + 2NH HCO 3 - Ureasi Esempio In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente allidrolisi enzimatica dellurea

58 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE PRINCIPI DI RIVELAZIONE Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali: –spettrofotometria –spettrofluorimetria un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi): –chemiluminescenza

59 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA luminescenzaLa luminescenza è lemissione di radiazione elettromagnetica nellUV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale chemiluminescenza (CL)La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui lenergia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica bioluminescenza (BL)La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

60 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI CHEMILUMINESCENTI Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia Prodotto + [Accettore]* Substrato CL [Prodotto]* Prodotto + h Accettore + h + Accettore DirettaIndiretta

61 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI CHEMILUMINESCENTI luminolo NH NH 2 O O aminoftalato + N 2 + H 2 O + h perossidasi H 2 O 2 /OH - COO - NH 2 COO - Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi

62 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina HPO 4 2- O + O - O OCH 3 * + F F + h OO OCH 3 OPO 3 2- AMPPD O - O OCH 3 * + F fosfatasi alcalina OCH 3 O - AMP - D OO

63 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI CHEMILUMINESCENTI 1,2-Diossietani-fenil- -D-galattopiranoside/ -Galattosidasi OO OCH 3 O O OH HO OH OH O OO OCH 3 o - O OCH 3 o - O h + -galattosidasi + OCH 3 o - O *

64 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis (lucciola nord-americana) Lefficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1 luciferina + ATP + O 2 ossiluciferina + CO 2 + AMP + P~P + luce luciferasi Mg 2+ + AMP + + luce N S S N HO COOH H N S S N HO O + ATP O 2, Mg 2+ luciferina luciferasi pirofosfato BL/CL = n. fotoni emessi n. molecole reagenti

65 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE SISTEMI BIOLUMINESCENTI Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una ossidoreduttasi che produce FMNH 2 O 2 NAD(P)H + H + + FMN NAD(P) + + FMNH 2 FMNH 2 + R-CHO + O 2 FMN + R-COOH + H 2 O + luce ossidoreduttasi luciferasi CH 3 (CH 2 ) 12 CHO + FMNH 2 CH 3 (CH 2 ) 12 COOH + FMN + luciferina batterica luciferasi batterica luce

66 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHE Aspetti quantitativi: La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi In presenza di un eccesso di substrato lintensità del segnale luminoso è proporzionale allattività enzimatica Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima lintensità dellemissione luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione adatto allanalisi quantitativa Caratteristiche analitiche: Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a quella dei radioisotopi Minimo segnale di fondo dovuto alla matrice biologica rispetto alla fluorescenza Ampio intervallo dinamico Rapidità di risposta Costi ridotti e minori rischi rispetto alluso di marcatori radioattivi

67 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPLICAZIONI ANALITICHE Determinazione dellattività della perossidasi endogena in fluidi biologici, omogenati di tessuto,.. Determinazione della concentrazione di metaboliti o dellattività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H 2 O 2 /H 2 O Luminolo/H 2 O 2 /Perossidasi colesterolo ossidasi colesterolo colesterolo H 2 O 2 fosfolipasi D colina ossidasi fosfolipidi fosfolipidi colina H 2 O 2 perossidasi luminolo aminoftalato + N 2 + H 2 O + h H 2 O 2 /OH -

68 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi da lucciola Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi adeninici in campioni biologici Determinazione della concentrazione di metaboliti o dellattività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono chinasi e la formazione o degradazione di ATP creatinina creatinina creatina creatina + ATP creatina-fosfato + ADP ATP + luciferina + O 2 AMP + P~P + CO 2 + ossiluciferina + h creatinina ammide idrolasi creatina chinasi luciferasi Mg ++

69 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPLICAZIONI ANALITICHE Luciferina/Luciferasi batterica Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con maggiore sensibilità per il NADH (fmoli) Determinazione della concentrazione di metaboliti o dellattività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H R-OH R-OH + NAD + R=O + NADH NADH + H + + FMN NAD + + FMNH 2 FMNH 2 + R-CHO + O 2 FMN + R-COOH + H 2 O + h 7 -idrossisteroide-deidrogenasi ossidoreduttasi luciferasi

70 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPLICAZIONI COMMERCIALI Rapid Enzymatic Tests for Glucose Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose Glucose Oxidase Glucose > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase H2O2 + chromogen orthotolidine > oxidized orhotolidine Diastix: H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase H2O2 + Potassium iodide > iodine complex The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p b of the Laboratory Manual. Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix: · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

71 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE E A P E A P CINETICA ENZIMATICA In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso Il grafico velocità-concentrazione è uniperbole rettangolare, descritta da unequazione del tipo dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili, mentre V e K m sono due costanti [substrato] velocità A P

72 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE VELOCITÀ MASSIMA (V max ) La costante V rappresenta la velocità massima (V max ) o limitante della reazione e si raggiunge ad alte concentrazioni di substrato Allaumentare di [s], la velocità aumenta e tende asintoticamente al valore massimo, che non può essere superato indipendentemente dallaumento di [s], perché ad alte concentrazioni di s lenzima è saturato In queste condizioni la velocità di reazione non dipende da [s] ed è quindi di ordine 0 [substrato] velocità V max ½ V max KmKm Ad elevata [s] lo stadio limitante della reazione è la conversione del complesso attivato ES a prodotto P + E V max rappresenta la velocità a [s] infinita, quindi è la velocità dello stadio limitante Di conseguenza, V max rappresenta una misura diretta dellabilità dellenzima di convertire il substrato in prodotto, cioè della attività enzimatica k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1

73 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE COSTANTE DI MICHAELIS (K m ) La costante di Michaelis (K m ) è definita come la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima (1/2 V max ) Substrato, enzima e complesso enzima-substrato si trovano in uno stato di equilibrio. Ad alte concentrazioni di substrato lequilibrio è tutto spostato verso destra, quindi lenzima è saturato e la velocità raggiunge il valore massimo. Nel punto in cui metà delle molecole di enzima sono saturate la velocità sarà metà della V max La posizione dellequilibrio dipende anche dalla forza dei legami tra substrato ed enzima. Più essi sono deboli, più alta è la concentrazione di substrato necessaria per avere il 50% di saturazione dellenzima, quindi più alto sarà il valore di K m K m è una espressione della affinità dellenzima per il substrato: basso valore di K m alta affinità alto valore di K m bassa affinità k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 [substrato] velocità V max ½ V max KmKm

74 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN In condizioni di eccesso di substrato la velocità delle reazioni enzimatiche dipende solo dalla concentrazione di enzima La V max sarà proporzionale alla concentrazione di E, quindi sarà una misura di attività enzimatica ][s K m >> ][ 2 E k v max V

75 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni: Regione 1 CINETICA ENZIMATICA La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato 1° ordine >> Velocità della reazione k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 v=k 2 [ES]

76 FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE APPROCCIO ALTERNATIVO ALLA MISURA DI VELOCITÀ INIZIALE Teoricamente sarebbe possibile misurare lattività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau Maggiore è lattività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo Inconvenienti: –difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura) –tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse tempo [P]


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