Regolazione negativaRegolazione positiva Feedback negativo Feedback positivo Modelli di regolazione semplici.

Presentazione sul tema: "Regolazione negativaRegolazione positiva Feedback negativo Feedback positivo Modelli di regolazione semplici."— Transcript della presentazione:

1 Regolazione negativaRegolazione positiva Feedback negativo Feedback positivo Modelli di regolazione semplici

2 Circuiti genetici oscillanti

3 Circuiti genetici complessi Aumento del numero dei componenti C B D E F G H Interconnessione tra circuiti A

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5 Caulobacter crescentus C. crescentus presenta tre forme cellulari distinte durante il suo normale ciclo cellulare:  Cellule motili e flagellate, swarmer  Cellule con stelo, stalk, sessili  Cellule predivisionali, con flagello e stalk

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7 Il processo cellulare di differenziamento risponde alla modulazione temporale di tre regolatori principali: CtrA, DnaA, GcrA CtrA, DnaA, GcrA Questi sono organizzati in un circuito di regolazione complesso

8 Il processo cellulare di differenziamento risponde alla modulazione temporale di tre regolatori principali: DnaA, GcrA, CtrA

9 E’ di un regolatore trascrizionale che appartiene alla famiglia dei “response regulator” fosforilati da uno o più “sensori” (PleD, DivK e CckA). É il regolatore della forma flagellata …. Questa proteina quando è presente e fosforilata è in grado di regolare l’espressione di 95 geni determinando : Questa proteina quando è presente e fosforilata è in grado di regolare l’espressione di 95 geni determinando : L’inibizione della replicazione del DNA legandosi alla regione OriC, il blocco della divisione cellulare attraverso l’inibizione trascrizionale del gene ftsZ, l ‘induzione della biosintesi del flagello. L’inibizione della replicazione del DNA legandosi alla regione OriC, il blocco della divisione cellulare attraverso l’inibizione trascrizionale del gene ftsZ, l ‘induzione della biosintesi del flagello. Inoltre CtrA è in grado di attivare il gene ccrM, reprimere gcrA ed esercitare un meccanismo di feedback negativo sul suo promotore P1 e positivo sul promotore P2 quando il DNA è metilato.Inoltre CtrA è in grado di attivare il gene ccrM, reprimere gcrA ed esercitare un meccanismo di feedback negativo sul suo promotore P1 e positivo sul promotore P2 quando il DNA è metilato. CtrA

10 La sua fosforilazione è determinata da numerosi sensori. Tra questi quello più importante è CckA.

11 GcrA È il regolatore di riferimento per la cellula sessileÈ il regolatore di riferimento per la cellula sessile È indotta trascrizionalmente da DnaAÈ indotta trascrizionalmente da DnaA Induce l’espressione dei geni per la replicazione del DNAInduce l’espressione dei geni per la replicazione del DNA Induce l’espressione di ctrA sul P1 con DNA emimetilatoInduce l’espressione di ctrA sul P1 con DNA emimetilato Subisce la repressione trascrizionale da parte di CtrASubisce la repressione trascrizionale da parte di CtrA Induce l’espressione degli elementi responsabili del differenziamento.‏Induce l’espressione degli elementi responsabili del differenziamento.‏

12 DnaA È la proteina responsabile dell’inizio della replicazione nei cromosomi procariotici, controlla anche l’espressione di una ventina di geni. È la proteina responsabile dell’inizio della replicazione nei cromosomi procariotici, controlla anche l’espressione di una ventina di geni. È l’induttore trascrizionale di gcrA È l’induttore trascrizionale di gcrA Il promotore del gene dnaA è scarsamente funzionale quando il DNA è emimetilato, mentre trascrive ad elevati livelli quando il DNA è pienamente metilato. Il promotore del gene dnaA è scarsamente funzionale quando il DNA è emimetilato, mentre trascrive ad elevati livelli quando il DNA è pienamente metilato. Il gene dnaA mostra un meccanismo di feedback negativo.Il gene dnaA mostra un meccanismo di feedback negativo.

13 CcrM È Una metilasi caratteristica di Caulobacter e corrisponde funzinalmente alla metilasi dam di E. coli. È Una metilasi caratteristica di Caulobacter e corrisponde funzinalmente alla metilasi dam di E. coli. E’ responsabile della metilazione delle sequenze GANTC nel DNA di Caulobacter. E’ responsabile della metilazione delle sequenze GANTC nel DNA di Caulobacter. Modula l’attività del promotore del gene dnaA e quella dei due promotori a monte del gene ctrA (P1 e P2). Modula l’attività del promotore del gene dnaA e quella dei due promotori a monte del gene ctrA (P1 e P2). Mostra un meccanismo di regolazione di tipo “feedback negativo”. Mostra un meccanismo di regolazione di tipo “feedback negativo”.

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15 Cellula flagellata Nella cellula flagellata, a causa del predominio di CtrA abbiamo: Assenza di GcrA Assenza di GcrA DNA pienamente metilato (CcrM) DNA pienamente metilato (CcrM) Elevati livelli di DnaA (che però non determina la replicazione del DNA in quanto questa è repressa da CtrA) Elevati livelli di DnaA (che però non determina la replicazione del DNA in quanto questa è repressa da CtrA) Ne consegue che la cellula flagellata non è in grado di replicare ne di dividersi

16 Durante questa fase i pili vengono riassorbiti dalla cellula mentre il flagello viene rilasciato nell’ambiente. Nel medesimo polo si ha la formazione del peduncolo. Passaggio alla fase sessile Nel passaggio da cellula motile a quella sessile la proteina CtrA viene totalmente degradata nel citoplasma per l'azione dalla proteasi ClpX/P indotta dalla fosforilazione del regolatore DivK. In mancanza di CtrA si ha: l’espressione di GcrA il cui gene non è più represso da CtrA ma è indotto da DnaA (sintesi del peduncolo e eliminazione del flagello) l’espressione di GcrA il cui gene non è più represso da CtrA ma è indotto da DnaA (sintesi del peduncolo e eliminazione del flagello) si libera OriC che ora è in grado di interagire con DnaA e iniziare la replicazione del DNA si libera OriC che ora è in grado di interagire con DnaA e iniziare la replicazione del DNA si deregola l’espressione di ftsZ e si assiste alla formazione del setto, inizia la divisione cellulare. si deregola l’espressione di ftsZ e si assiste alla formazione del setto, inizia la divisione cellulare.

17 Cellula predivisionale Avvenuta la replicazione del DNA, GcrA induce l’espressione di CtrA a bassi livelli tramite attivazione del P1 con DNA emimetilato. I bassi livelli di CtrA vengono immediatamente fosforilati da CckA e CtrA-P induce l’espressione di CcrM. Questa metila il DNA favorendo il feedback positivo di CtrA-P sul suo promotore P2, aumenta notevolmente l’espressione di CtrA istaurando le condizioni tipiche della cellula flagellata tra cui: - la trascrizione dei geni per la biosintesi del flagello - quella dei geni ftsQ ed ftsA necessari per portare a termine la la divisione cellulare. - quella dei geni ftsQ ed ftsA necessari per portare a termine la la divisione cellulare.

18 Divisione cellulare Alla fine del ciclo, durante la divisione cellulare, la proteina CtrA viene degradata attivamente e selettivamente solo nel compartimento della cellula sessile che, quindi, inizia una nuova divisione cellulare. La proteina GcrA, che ha un’emivita molto breve, nella cellula sessile è sostenuta da un’attiva sintesi, mentre in quella flagellata si degrada velocemente e non viene espressa in quanto il gene represso da CtrA

19 RIASSUMENDO…..

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21 Localizzazione delle proteine PleC/D, DivJ/K

22 Regolazione polare del sistema Div/Ple

23 Synthetic Biology: Genetic Circuit Design Sulla base dello studio dei sistemi complessi di regolazione (come quelli di Caulobacter) e disponendo delle tecniche e delle conoscenze necessarie alla fine degli anni ’90, Gardner et al. (2000) e Elowitz and Leibler (2000) realizzarono i primi semplici circuiti trascrizionali, un interruttore e un oscillatore. Toggles and oscillators: new genetic circuit designs Ellen M. Judd,1,2 Michael T. Laub,2 and Harley H. McAdams2*

24 Oggi si è sviluppata una vera e propria disciplina che permette di teorizzare e realizzare circuiti genetici. Questa disciplina ha mutuato il linguaggio dei circuiti digitali. Si fa riferimento in particolare ai «logic gates», blocchi logici che consistono solitamente in due input e un output. I più comuni sono:

25 I blocchi logici possono essere realizzati con : DNA binding proteins (LacI, AraC, CI, TetR, ZFP e TALEs- Transcriptional Activator Like Effector) Operone Arabinosio (AraC-P BAD ) Operone Lattosio (lacI-P lac )

26 NOR e AND con DNA binding protein:

27 Invertasi come Tyr recombinasi o Ser integrasi: Tyr Rec Ser Inv Inserimento di un terminatore

28 NOR e AND con Ser invertase:

29 CRISPR (Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats) Presenti nel 40% dei batteri e nel 90% degli archea, sono loci organizzati da sequenze ripetute brevi e dirette intervallate a sequenze “spacer”. In aggiunta si possono identificare geni, associati a queste sequenze, detti cas Sono assimilabili a una sorta di sistema immunitario della cellula

30 CRISPR con Cas9 wt con dCas9 e un sgRNA

31 Uso di Cas9 modificata (dCas9) in un NOR:

32 o ancora basati sull’espressione di sRNA regolativi. Questi possono agire a livello di controllo traduzionale e, con le opportune modifiche, trascrizionale (tna).

33 tnaC e tnaAB rut

34 Circuito NOR basato su regolazione derivata da tnaA

35 UP-SCALE dei circuiti regolativi

36 Nielsen et al 2013