CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale (IIa parte) Prof. Elio Desimoni

CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale (IIa parte) Prof. Elio Desimoni
Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Prof. Elio Desimoni 1

Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari
SPETTROSCOPIA ATOMICA – 24A: Origine degli spettri atomici;24B: Spettroscopia atomica basata sull’atomizzazione con fiamma; 24C: Spettroscopia atomica con atomizzatori elettrotermici; 24D: Metodi di emissione atomica basati su sorgenti a plasma. INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI – 26A: Descrizione generale della cromatografia; 26B: Velocità di migrazione dei soluti; 26C: efficienza delle colonne cromatografiche; 26D: risoluzione di una colonna; 26E: Applicazioni della cromatografia. APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA – 27A: Cromatografia gas-liquido; 27B: Cromatografia liquida ad alta efficienza. SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI – Leggere e memorizzare le possibili applicazioni. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 2

Capitolo 24 SPETTROSCOPIA ATOMICA Capitolo 26 INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI Capitolo 27 APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA Capitolo 29 SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 3

CAPITOLO 24 – SPETTROSCOPIA ATOMICA Livelli energetici possibili per un atomo. Livelli energetici possibili per una molecola Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 476 In spettroscopia atomica l’analita è presente sotto forma di nube atomica. Essendo impossibili vibrazioni e rotazioni, lo spettro atomico è a righe, non a bande (una banda è l’inviluppo di numerosissime righe). 4

Spettri atomici – a righe, e spettri molecolari - a bande
Spettro di assorbimento di atomi di silicio nell’intervallo 250 – 253 nm. Spettro di assorbimento del permanganato nell’intervallo 450 – 650 nm. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 5

p. 477 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 6

Atomizzazione in fiamma p. 479 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 7

p. 479 Bruciatori a flusso laminare Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 8

p. 481 Si ricordi l’eq. di Boltzmann: Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari in cui n1 e n0 sono il numero di particelle negli stati E1 e E0, cost è una costante dipendente dai livelli coinvolti nella transizione, k = 1, J/°K è la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta. Il controllo della temperatura della fiamma è fondamentale al fine di ottimizzare la misurazione. A 2500°C, un aumento di 10°C aumenta del 3% il numero di atomi di Na aventi l’elettrone ottico nello stato 3p. Parallelamente, il numero di atomi di Na con l’elettrone nello stato fondamentale (3s) diminuisce dello 0,002%. Il controllo della temperatura è più importante in assorbimento o in emissione? 9

Gli spettri di emissione in fiamma sono più ricchi di righe di quelli di assorbimento. p. 483 Si noti il contributo spettrale (a bande) del radicale MgOH. L’assorbimento da parte di specie atomiche, a righe, è detto specifico. L’assorbimento da parte di specie molecolari o radicaliche, a bande, è un assorbimento aspecifico. Quest’ultimo può essere eliminato mediante opportuni accorgimenti sperimentali (sottrazione del background). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 10

Spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma Nella spettofotometria UV-VIS molecolare, il monocromatore permette di selezionare una stretta banda di lunghezze d’onda (per es. 0,1 – 2 nm) tra quelle emesse dalla sorgente. Questa banda passante può essere considerata monocromatica in quanto gli spettri di assorbimento molecolare sono costituiti da bande molto larghe. 1,0 nm Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Che significa, in pratica, radiazione monocromatica? 11

In AAS, la larghezza di una riga può essere dell’ordine di 10-3 nm. Non esiste monocromatore in grado di fornire una simile banda passante. Inoltre, sarebbe molto difficile isolare la lunghezza d’onda d’interesse! Confronto di spettri di assorbimento molecolari (blu) e atomici (rosso). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 485 Al fine di produrre una radiazione sufficientemente monocromatica, è necessario modificare radicalmente la sorgente. 12

p. 486 La lampada a catodo cavo Una lampada a catodo cavo (HCL, Hollow Cathode Lamp) moderna consiste in un tubo di vetro riempito di un gas inerte (Ne o Ar) ad una pressione di circa 5 mmHg, nel quale sono inseriti un anodo formato da un filamento, di solito di tungsteno o nichel, e un catodo a forma di cilindro cavo, contenente il metallo o, più in generale, l’elemento di cui si desidera ottenere l’emissione delle righe di risonanza. Applicando agli elettrodi un campo elettrico di alcune centinaia di volt, i pochi ioni ed elettroni presenti nel gas inerte vengono accelerati e, data la bassa pressione, riescono a raggiungere un’energia cinetica sufficiente a ionizzare per urto altri atomi. A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Si ha quindi la formazione di un vero e proprio plasma, in cui gli ioni positivi colpiscono la superficie del catodo provocando lo sputtering (emissione di atomi da una superficie bombardata da particelle) degli atomi di cui essa è costituita. 13

La lampada a catodo cavo p. 486 Gli atomi emessi dal catodo, passando attraverso la regione della scarica, ricca di ioni e atomi eccitati del gas nobile, sono eccitati a loro volta ed emettono le loro tipiche righe spettrali. Grazie alla costruzione della lampada e alla forma geometrica del catodo il fascio di radiazione emesso risulta relativamente ben collimato. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo. 14

La lampada a catodo cavo
La larghezza di una riga atomica (FWHM: Full Width at Half Maximum) è determinata da tre componenti: FWHM = FWHMNat + FWHMLorentz + FWHMDoppler Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari La larghezza naturale è determinata dalla vita media dei livelli coinvolti nella transizione (tanto più un livello è eccitato, tanto minore è la sua vita media, tanto maggiore è la sua larghezza naturale). La larghezza Doppler è originata dalla variazione di frequenza connessa con la componete della velocità dell’atomo emettitore/assorbitore nella direzione di osservazione, ed è prevalentemente funzione della temperatura. La larghezza Lorentz è determinata dalle interazioni reciproche tra gli atomi emettitori/assorbitori, ed è quindi funzione della pressione. 15

p. 485 La lampada a catodo cavo Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari La HCL lavora a pressione e temperatura inferiori a quelle della fiamma. Le righe emesse dalla HCL sono quindi caratterizzate da minori allargamenti Doppler e Lorentz e hanno un’ampiezza inferiore a quella tipica delle righe di assorbimento degli atomi eccitati nell’atomizzatore. Di conseguenza queste sorgenti sono in grado di fornire FWHM adeguatamente ridotte alla lunghezza d’onda specifica dell’analita di interesse. Perché? 16

p. 487 La lampada a scarica senza elettrodi Fra le sorgenti utilizzate in FAAS e FAFS, le lampade a scarica senza elettrodi (EDL) mostrano le più elevate intensità radianti, e le righe di emissione più strette. Una EDL consiste in un tubo di quarzo lungo parecchi centimetri e del diametro dell’ordine di 5-10 mm. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Il tubo è riempito con pochi milligrammi dell’elemento di interesse (come metallo puro, alogenuro o metallo con aggiunta di iodio) sotto una pressione di argon di alcuni Torr. Il tubo è circondato dalle spire di un generatore di radiofrequenza. Questa lampada richiede quindi uno speciale alimentatore. Quando viene attivato il campo di radiofrequenza, l’energia ad esso associata causa l’evaporazione del metallo; l’urto con gli atomi del gas inerte provoca l’emissione delle righe spettrali caratteristiche. Queste lampade sono di più complessa costruzione rispetto alle lampade a catodo cavo e presentano una vita relativamente più breve. 17

Schemi a blocchi degli spettrometri di assorbimento atomico p. 487 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Schemi a blocchi di spettrometri di assorbimento atomico: a) strumento a singolo raggio/alimentazione continua; b) strumento a singolo raggio/alimentazione modulata; c) strumento a doppio raggio. La modulazione della sorgente permette al rivelatore di distinguere la radiazione proveniente dalla HCL da quella emessa dalla fiamma. La modulazione può essere elettronica (modulazione dell’intensità di corrente applicata agli elettrodi della HCl) o meccanica (mediante chopper). 18

Interferenze p. 488 Le interferenze più comuni in AS sono di due tipi: Interferenze chimiche: dovute prevalentemente alla formazione di composti che influiscono sul rendimento dell’atomizzazione o a ionizzazione dell’analita. Interferenze spettrali: Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari quelle dovute alla presenza di righe di assorbimento di atomi diversi dall’analita sono relativamente rare. quelle dovute alla presenza di specie radicaliche o molecolari sono molto frequenti e producono generalmente un aumento del fondo (background). 19

Correzione del fondo La correzione del fondo può essere eseguita dotando lo spettrometro di una lampada addizionale a deuterio. p. 489 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Il chopper è un disco rotante con settori vuoti alternati a settori muniti di specchio. 20

Correzione del fondo mediante lampada a deuterio La HCL emette uno spettro a righe, quella a deuterio uno spettro continuo. La fenditura del monocromatore isola la riga di risonanza dello spettro emesso dalla HCL, con una FWHM dell’ordine di 0,002 nm, mentre separa dallo spettro continuo della lampada a deuterio con una FWHM dell’ordine di 0,2-0,7 nm; Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Le intensità delle due sorgenti vengono eguagliate entro l’intervallo spettrale considerato; In presenza di assorbimenti specifici (dell’analita in esame) Icc viene ridotta proporzionalmente alla concentrazione dell’analita mentre ID non viene ridotta che di una frazione trascurabile; 21

In presenza di un assorbimento aspecifico (fondo) le due correnti sono ridotte in ugual misura; In presenza di un assorbimento specifico e, contemporaneamente, aspecifico, l’intensità della radiazione emessa dalla lampada a deuterio, ridotta dal solo assorbimento aspecifico, fornisce il valore di I0 da usare nell’equazione 2.12 mentre l’intensità della radiazione emessa dalla HCL, ridotta da entrambi gli assorbimenti, fornisce il valore di I. L’assorbimento viene misurato in assenza del fondo. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari I correttori a deuterio compensano fino a circa 0,6 unità di assorbanza del fondo. Nei casi in cui tale compensazione non è sufficiente si deve necessariamente ricorre a metodi di correzione più sofisticati. 22

Analisi quantitativa mediante FAAS L’analisi quantitativa in FAAS si basa su misurazioni relative. È necessario costruire curve di taratura analizzando un adeguato numero di soluzioni standard. Il metodo più sicuro è quello dell’aggiunta standard. Allo scopo, prima dell’analisi il campione è suddiviso in subcampioni. Uno di essi è trattato come al solito, mentre gli altri vengono processati dopo aggiunte crescenti di misurando. La determinazione analitica viene eseguita su tutti i subcampioni. Alternativamente è possibile eseguire aggiunte successive di analita nello stesso campione in esame (correggendo eventualmente le concentrazioni così realizzate per l’eventuale diluizione associata ad ogni aggiunta). In generale, lo scopo di questo modo è di compensare gli errori proporzionali che deriverebbero dall’uso di standard aventi composizione diversa da quella della matrice dei campioni in esame. Al fine di ottenere una buona stima della sensibilità, è necessario aggiungere analita in quantità sufficiente almeno a raddoppiare il segnale. Il metodo è valido se usato nel range lineare, e se il bianco non ha un segnale apprezzabile, dato che è impossibile verificare sperimentalmente la correttezza di questa condizione. Vedere equazioni a p. 491 e 492. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 491 23

Metodo dell’aggiunta standard Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 491 24

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SPETTROMETRIA ATOMICA CON ATOMIZZAZIONE ELETTROTERMICA (ETAAS) In questo tipo di AS l’atomizzazione viene ottenuta mediante effetto Joule. Il campione viene introdotto in un tubicino di grafite per mezzo di una micropipetta o di un campionatore automatico. Per mezzo di un opportuno programma termico automatizzato (essiccamento, incenerimento, atomizzazione) si provoca l’atomizzazione dell’analita in presenza di minimi residui di matrice. Il segnale è transiente, non continuo come in FAAS. p. 497 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 26

SPETTROMETRIA ATOMICA DI EMISSIONE CON SORGENTI A PLASMA Questo tipo di spettroscopia atomica di emissione sfrutta le elevate temperature (6000 – K) realizzabili con sorgenti a plasma. Gli strumenti più popolari usano un plasma ad accoppiamento induttivo. p. 501 Flusso Ar: 11 – 17 L/min Potenza: 2 kW a circa 27 MHz Ignizione: piezoelettrica Iniezione analita: come aerosol Interferenze: scarse Ionizzazione: ridotta a causa dell’elevata concentrazione di ioni Ar+ Range lineare: 3-5 ordini di grandezza Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 27

Sorgenti ICP Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 28

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CAPITOLO 26 – INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI DI ANALISI p. 516 Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni in campo alimentare. Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte) una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase stazionaria. Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas cromatografia (GC) la fase mobile è un gas. 30

CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI p. 517 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 31

Xm  Xs Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 518
PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m): Xm  Xs Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è definito come: Quale componente ha K maggiore? Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari A: il campione viene iniettato all’entrata della colonna B  D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria A B C D Flusso del solvente p. 518 32

tR tM p. 521 Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Analogamente si definiscono i corrispondenti: Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita dall’inizio all’uscita della colonna. Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 33

Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell’analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k’. Si dimostra che k’ può essere ricavato dai parametri del cromatogramma: Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k’. p. 522 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari La selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (tR)B> (tR)A. 34

Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna); percorsi multipli; Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria. p. 524 35

Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi): Altezza equivalente di piatto teorico H Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Si può dimostrare che W = larghezza del picco W p L’altezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l’efficienza di colonne di differente lunghezza. 36

Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna: p. 529 La principale variabile che influenza l’efficienza di una colonna è la velocità di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria. L’altezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive l’efficienza della colonna, dipende proprio dalla velocità di flusso della fase mobile (vedere Figura a lato). Sia in LC che in GC la velocità di flusso ottimale è piuttosto bassa. Quella ottimale della LC è inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocità un po’ maggiori di quella ottimale. La LC è caratterizzata da valori di H inferiori alla GC. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC è comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza. 37

La risoluzione, R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti. Essa è ricavabile dal cromatogramma: p. 530 Vedere Figura 26-10 La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all’efficienza di separazione (denominatore). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività)  vedere equazione successiva. 38

Si può dimostrare che: p. 531 Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari picchi stretti buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi distanti risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità 39

p. 533 Le applicazioni della cromatografia vanno dall’analisi qualitativa a quella quantitativa di miscele anche molto complesse. L’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’altezza o dell’area dei picchi. La misurazione dell’area è più affidabile in quanto non risente dell’eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell’analita nella miscela in esame mediante interpolazione. Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dell’analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è vicino ma separato da quello dell’analita). 40

Anion-exchange chromatogram with electrochemical detection of a mixed standard solution containing mM of: 1) glycerol, 2) meso-erythritol, 3) adonitol, 4) histamine, 5) glucose. Flow Rate 0.4 mL/min. Isocratic elution with 0.4 M NaOH. min 1 2 3 4 5 6 200 nA Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari I.G. Casella, M. Gatta, E. Desimoni, Determination of histamine by high-pH anion-exchange cromatography with electrochemical detection, Food Chem., 73 (2001) 367) 41

CAPITOLO 27 – APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 42

SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO p. 538 He, Ar, N2, H2 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 43

Iniezione ed iniettori
Il campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a 0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari). L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro. p. 539 Colonne gascromatografiche Si suddividono in impaccate e capillari. Le impaccate contengono particelle solide che vengono impaccate: diatomee o diatomee silanizzate, per ridurre la polarità mediante arricchimento superficiale di gruppi metilici. Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = mm; lunghezza = m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche ) grazie alla loro elevata lunghezza. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 44

Colonna capillare standard a fase legata
Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Colonna capillare standard a fase legata 45

45° Influenza della T sui tR: più la temperatura è elevata più il soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa  aumentando T diminuisce tR 145° Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari programma di T p 46

Rivelatori Dovrebbero avere le seguenti proprietà: risposta lineare, stabilità, risposta uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva). Il rivelatore ideale non esiste. Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul principio del ponte di Wheatstone. p. 540 controllo della corrente del filamento cella di riferimento cella del campione registratore attenuatore a ponte Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di riferimento, l’altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta all’eluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2 . 47

Il rivelatore a ionizzazione di fiamma è forse il più diffuso. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della fiamma stessa. È più sensibile di quello a conducibilità termica (fino a g/mL). + - Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 542 48

FASI LIQUIDE PER CROMATOGRAFIA GL La fase liquida per CGL deve essere caratterizzata da Bassa volatilità Stabilità termica Inerzia chimica Caratteristiche solventi (valori ottimali di k’ e a). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari p. 543 49

HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA
Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori. A B C p. 546 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 mm, D = mm, L = cm) HPLC con riempimento pellicolare (d = mm, D = 1-3 mm, L = cm) HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 mm, D = 2-6 mm, L = cm) d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna 50

LC classica: dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC; velocità di flusso molto basse; tempi di analisi lunghi. Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi canali interparticellari. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari HPLC: impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; contropressioni maggiori; tempi d’ analisi contenuti. Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile). 51

p. 547 SCHEMA DI CROMATOGRAFO HPLC COMPARTIMENTO TERMOSTATATO PRECOLONNA SERBATOIO SOLVENTE COLONNA REGISTRATORE Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari INIETTORE POMPA FILTRO MISURATORE PRESSIONE SPURGO RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI 52

ELEMENTI DI CROMATOGRAFO HPLC Riserva di fase mobile (degasamento, eluizione isocratica o a gradiente) Sistema di pompaggio (pressioni fino a 6000 psi   400 atm) Sistema di iniezione p. 548 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 53

Colonne (precolonne*, colonne analitiche, le più diverse) 3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™ HPLC Columns p. 548 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nell’UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universale (rivela tutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono: rivelatore UV-vis rivelatore a fluorescenza rivelatore a indice di rifrazione (RI) * Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria 54

p. 551 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 55

p. 550 HPLC DI RIPARTIZIONE Fase stazionaria e mobile immiscibili l’una con l’altra: liquidi con proprietà solventi notevolmente diverse. Limitata a composti con valori di k' relativamente bassi perché la fase stazionaria deve essere un buon solvente per il campione, ma un cattivo solvente per la fase mobile: aumentando la forza del solvente per poter eluire composti con valori elevati di k' si aumenterà anche la solubilità della fase stazionaria; utile per risolvere differenze molto piccole nella solubilità degli analiti: l’impiego della coppia fase stazionaria/fase mobile appropriata permette un’alta selettività. I primi lavori con cromatografia di ripartizione usavano fasi stazionarie altamente polari (glicol, acqua,ecc.) e fase mobile non polare (esano, isopropiletere, ecc) ovvero operavano in fase normale. Attualmente, la fase stazionaria più usata è apolare (un idrocarburo) e quella mobile è un solvente relativamente polare (metanolo, acqua, acetonitrile, ecc.): questo tipo di cromatografia viene detto a fase inversa. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 56

BPLC (Cromatografia a fasi chimicamente legate ) per i riempimenti della LC sono stati utilizzati tre tipi generali di legami chimici nei quali i gruppi Si-OH possono essere : 1. esterificati per reazione con alcoli producendo esteri di silicati 2. silanizzati per reazione con organocloro- o organoalcossi-silani 3. trasformati per clorurazione in Si-Cl e, in seguito, in Si-C per reazioni di Grignard o Wurtz, o qualche altra reazione tipica dei composti alogenati. gli impaccamenti sono più stabili nel tempo. Si-OH + HOR  Si-O-R + H2O Si-OH + SOCl2  Si-Cl + SO2 + HCl Si-Cl + R-Mg-Br  Si-R + MgClBr Si-OH + Cl-Si-R  Si-O-Si-R + HCl R' 1 2 3 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 57

HPLC DI ADSORBIMENTO Fase stazionaria: materiali adsorbenti come solidi porosi (silice, allumina) con area superficiale specifica da m2/g preparati in particelle di dimensioni appropriate. I gel di silice, per esempio, sono preparati facendo reagire silicato di Na con un acido minerale (es. HCl) e poi mediante polimerizzazione con formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di SiO4. A seguito della disidratazione si forma un solido stabile poroso con terminazioni superficiali silanoliche e silossaniche. Le interazioni tra superficie adsorbente e soluto variano da non specifiche (forze di dispersione o di Van der Waals) a specifiche (interazioni elettrostatiche o interazioni tra accettori o donatori di elettroni -legami idrogeno). p. 552 gruppi silossanici ossidrilici isolati legami idrogeno Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 58

La ritenzione su silice o allumina dipende principalmente dalle interazioni con i gruppi funzionali degli analiti: classi diverse di composti possono essere separate le une dalle altre, ad es. alcoli (polari) e idrocarburi alifatici (non polari). Le posizioni relative dei gruppi funzionali nella molecola di analita e il numero e disposizione spaziale dei siti di adsorbimento sulla superficie rendono la LSC una tecnica di grande utilità per la separazione di composti polifunzionali, in particolare isomeri geometrici. para meta orto Separazione LSC degli isomeri della nitroanilina su allumina Il primo ad essere eluito è l’isomero orto, che presenta legami ad H intramolecolari (minore tendenza all’interazione con la superficie dell’allumina), mentre l’isomero para è trattenuto più fortemente perché presenta più facilmente interazioni con l’allumina. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 59

Influenza della fase mobile: le interazioni implicano una competizione tra le molecole dell’analita e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento. I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento (serie eluotropica). idrocarburi alif. olefine idrocarburi arom. alogenuri solfuri eteri nitrocomposti esteri, aldeidi e chetoni ammine solfoni solfossidi ammidi ac. carbossilici acqua polarità Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Nelle note a margine p. 543 60

ELUIZIONE A GRADIENTE Fase mobile debole : i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppo allargati). Fase mobile forte: saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente. Come separare tutti i componenti con K’ molto diversi?  è necessario far variare la velocità di migrazione delle bande durante il corso dell’analisi: eluizione a gradiente. L’eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del solvente viene progressivamente aumentata. L’effetto complessivo è quello di una eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso, di una riduzione nella formazione di code. In GC il gradiente è un gradiente di temperatura. Perché? Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari

SOLVENTE DEBOLE SOLVENTE FORTE Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari FORZA INTERMEDIA GRADIENTE DI SOLVENTE 62

p. 554 HPLC A SCAMBIO IONICO Per composti ionici, ionizzabili (acidi e basi organiche), e che possono interagire con gruppi ionici. Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzati con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori di cationi; -NHR2+ , -NR3+, come scambiatori di anioni). Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari scambio cationico X+ + R-Y+  Y+ + R-X+ scambio anionico X- + R+Y-  Y- + R+X- dove: X = ione del campione Y = ione della fase mobile (controione) R = sito ionico sullo scambiatore Lo scambio dipende dal pH, temperatura, forza ionica, natura e concentrazione, dello ione competitore, ecc. 63

Liquid chromatogram of unspiked white wine (Grifo Bianco, diluted 1:200). Column: IonPac AS12A analytical column (200 x 4 mm I.D.) plus IonPac AG12A (50 x 4 mm I.D.) guard column (Dionex, Sunnyvale, CA). Applied potential: 0.55 V vs. Ag/AgCl. Carrier electrolyte: 0.1 M NaOH. Flow rate: 1.0 mL/min. Sample Loop: 20 mL. I.G. Casella, M. Contursi, E. Desimoni, Amperometric detection of sulphur-containing compounds in alcaline medium, Analyst, 127 (2002) 64

p. 557 HPLC AD ESCLUSIONE È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.). Fasi stazionarie: particelle di polimeri e silice a porosità uniforme e controllata. Il tempo di residenza degli analiti nella fase stazionaria dipende dalle loro dimensioni. Se sono abbastanza piccole rimangono intrappolate nei percorsi multipli all’interno delle particelle. Se sono troppo elevate non penetrano nella fase stazionaria e vengono eluite velocemente. Le tecniche che usano impaccamenti idrofili ed idrofobi sono note rispettivamente come gel-filtrazione e, rispettivamente, gel-permeazione. Si usano rispettivamente per specie polari e specie non polari. Fase mobile: la fase mobile ha la stessa polarità dell’impaccamento (acquosa per impaccamenti idrofili e apolare per quelli idrofobi). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 65

1: B2 – 23,3 kD; 2: D – 20,6 kD; 3: D – 20,2 kD; 4: A – 20,0 kD Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Cromatogramma HPLC a gradiente in fase inversa di una miscela di proteine idrofobe depositate su lenti di contatto. Fase stazionaria: polistirene. Fase mobile: A (sol. Acq. Ac. formico 20%) + B (2-propanolo/acetonitrile 2/1) - gradiente: 5-70% B in 50 min. Rivelatore: UV (Hasan, Azeem; Hanson, Stacy; Smith, David; Smith, JeanResearch supported by a grant from the NIH, EY RO and The Nebraska Center for Mass Spectrometry) 66

CAPITOLO 29 – SELEZIONE DEI METODI D’ANALISI In prima approssimazione, un problema analitico può essere condensato nell’insieme delle seguenti informazioni: Analita Matrice Analisi qualitativa, quantitativa o di speciazione Livello di concentrazione Risoluzione (laterale, in profondità) Incertezza di misura (esattezza, precisione) Numero di campioni Tempi Costo Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Per aiutarsi nella selezione di una tecnica analitica potenzialmente idonea alla risoluzione del problema analitico, è utile esaminare le diverse classificazioni delle tecniche di analisi strumentale. 67

Tabella 1 - Tecniche di analisi strumentale in funzione della profondità di campionamento Profondità campionata Tecniche di analisi di massa (bulk) > 100 nm Tecniche di analisi di strato sottile (thin layer) nm Tecniche di analisi di superficie < 10 nm Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Tabella 2 - Tecniche di analisi strumentale in funzione del principio fisico utilizzato Tecniche spettroscopiche di analisi Tecniche cromatografiche di analisi Tecniche elettrochimiche di analisi Tecniche mediante analisi termica Tecniche radiochimiche di analisi Tecniche ifenate 68

Tabella 3 - Principali tecniche di analisi strumentale spettroscopica Spettroscopia UV-visibile UV-VIS Spettroscopia infrarossa IR Spettroscopia IR a trasformata di Fourier FTIRS Spettroscopia Raman Spettroscopia di fluorescenza molecolare FS Spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma FAAS Spettroscopia di assorbimento atomico elettrotermico EAAS o ETAAS Spettroscopia di assorbimento atomico a vapori freddi CVAAS Spettroscopia di emissione atomica AES Spettroscopia di emissione a plasma ICP Spettroscopia di fluorescenza atomica AFS Spettroscopia di assorbimento a raggi X XAS Spettroscopia di emissione a raggi X XES Spettroscopia di fluorescenza a raggi X XFS Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare NMR Spettroscopia di risonanza magnetica elettronica ESR Spettroscopia fotoacustica PAS Spettroscopia di massa MS Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 69

Tabella 4 - Tecniche basate sulla spettrometria di massa Spettrometria di massa MS Spettrometria di massa di ioni secondari SIMS Spett. di massa mediante bombardamento con atomi veloci FABS Spettrometria di massa a tempo di volo TOF-SIMS Tabella 5 - Principali tecniche di analisi cromatografica Cromatografia gas-liquido GLC Cromatografia gas-solido GSC Cromatografia gas-fase legata BPGLC Cromatografia liquido-liquido LLC Cromatografia liquido-solido LSC Cromatografia liquido-fase legata BPLLC Cromatografia liquida ad alte prestazioni HPLC Cromatografia su strato sottile TLC Cromatografia a scambio ionico IEC Cromatografia a esclusione molecolare SEC/GPC Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 70

Tabella 6 - Principali tipi di rivelatori per analisi strumentale cromatografica Rivelatore a termoconducibilità Rivelatore a cattura di elettroni Rivelatore ad elio metastabile Rivelatore ad emissione termoionica Rivelatore a fotoionizzazione Rivelatore a conducibilità elettrolitica Rivelatore a spettrometro di massa Rivelatore FTIR Rivelatore UV Rivelatore a indice di rifrazione Rivelatore a fluorescenza Rivelatore elettrochimico Rivelatore a ionizzazione di fiamma Rivelatore a spettrometro a plasma Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 71

Tabella 7 - Principali tecniche di analisi strumentale elettrochimica Tecnica Variabile Risposta controllata misurata Potenziometria i (= 0) E Voltammetria e polarografia Polarografia a impulsi normali (NPP) E i vs. E Polarografia a impulsi differenziali (DPP) “ “ Voltammetria di ridissoluzione anodica (ASV) “ “ Voltam. di ridiss. anodica diff. pul. (DPASV) “ “ Voltam. di adsorbimento e ridiss. (AdSV) “ “ Voltammetria ciclica (CV) “ “ Voltammetria ad onda quadra (SWV) “ “ Elettrogravimetria i o E massa Coulometria i o E carica Analisi mediante iniezione in flusso (FIA) E i vs. t Tecniche conduttometriche E (AC) i (AC) Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 72

Tabella 8a - Acronimi delle principali tecniche d’analisi strumentale AAS Atomic Absorption Spectroscopy AES Atomic Emission Spectroscopy AFM Atomic Force Microscopy AFS Atomic Fluorescence Spectroscopy ASV Anodic Stripping Voltammetry BPGLC Bonded Phase Gas-Liquid Chromatography BPLLC Bonded Phase Liquid-Liquid Chromatography CV Cyclic Voltammetry CVAAS Cold Vapour Atomic Absorption Spectroscopy DPASV Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry DPP Differential Pulse Polarography EC Exclusion Chromatography EPR Electron Paramagnetic Resonance ESR Electron Spin Resonance EAAS/ETAAS Electrothermal Atomic Absorption Spectroscopy FAAS Flame Atomic Absorption Spectroscopy FIA Flow Injection Analysis FTIRS Fourier Transform IR Spectroscopy GC Gas Chromatography Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 73

Tabella 8b - Acronimi delle principali tecniche d’analisi strumentale GLC Gas-Liquid Chromatography GPC Gel Permeation Chromatography GSC Gas-Solid Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography ICP Inductively Coupled Plasma IR Infra-Red Spectroscopy LC Liquid Chromatography LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-UV Liquid Chromatography-UV Spectroscopy LLC Liquid-Liquid Chromatography LSC Liquid-Solid Chromatography MS Mass Spectrometry NMR Nuclear Magnetic Resonance NPP Normal Pulse Polarography PAS Photoacustic Spectroscopy SEC Size Exclusion Chromatography STM Scanning Tunneling Microscopy TLC Thin-layer Chromatography TOF-SIMS Time-of-Flight Mass Spectrometry UV-VIS Ultraviolet and Visible (Spectroscopy) Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 74

CONSIDERAZIONI GENERALI Evidentemente è molto improbabile che si possa trovare in letteratura un metodo caratterizzato da precisione, limite di rivelabilità, specificità, semplicità, ecc. quali quelli da noi desiderati. Di volta in volta bisogna limitare l’area di ricerca. Se l’analita è un metallo (per es. Pb, Cd, Cr, ecc.), e quindi non sono richieste informazioni sulla sua speciazione, l’ideale è ricorrere alla spettroscopia atomica. La tecnica sarà scelta prevalentemente in funzione della concentrazione di analita (Vedere Tabella 24-4). Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Se l’analita è una singola specie elementare (per es. Cr(VI), As(III), Se(IV) ecc.), e quindi si tratta di eseguire un’analisi di speciazione, sarà invece necessario dimenticarsi della spettroscopia atomica e ricorrere a metodi specifici (per es. ad un metodo CSV per il Cr(VI). 75

Se l’analita è una miscela complessa di carboidrati, converrà pensare subito a qualche metodo HPLC. In questo caso sarà meglio disporre del rivelatore più adatto alla concentrazione dei vari analiti. Nel caso più comune potrà bastare un rivelatore a indice di rifrazione (ldr: 0,1 -1 %). Ma questo rivelatore non ammette l’eluizione a gradiente. Se gli analiti sono presenti a livelli più bassi di concentrazione, sarà necessario ricorrere a derivatizzazioni post-colonna ed a rivelatori UV. Alternativamente, è possibile convertire gli zuccheri in composti volatili, mediante opportune reazioni, ed analizzare il risultato mediante cromatografia gas-liquido. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari In numerosi casi si potrà ricorrere a metodi specifici, quali quello spettrofotometrico VIS per il Cr(VI) nelle acque (US EPA Method 7196A - range: mg/L ) o quello, sempre nel visibile, per determinare la qualità dello zafferano (BS6145:1981 – ISO ). 76

Se l’analisi riguarda la quantificazione di cationi, o anioni, in un acqua di scarico, potrebbe convenire ricorrere alla cromatografia ionica. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari 77

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