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1 CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale (II a parte) Prof. Elio Desimoni.

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1 1 CHIMICA ANALITICA Analisi Strumentale (II a parte) Prof. Elio Desimoni

2 2 INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI – 26A: Descrizione generale della cromatografia; 26B: Velocità di migrazione dei soluti; 26C: efficienza delle colonne cromatografiche; 26D: risoluzione di una colonna; 26E: Applicazioni della cromatografia. APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA – 27A: Cromatografia gas-liquido; 27B: Cromatografia liquida ad alta efficienza. SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI – Leggere e memorizzare le possibili applicazioni. SPETTROSCOPIA ATOMICA – 24A: Origine degli spettri atomici;24B: Spettroscopia atomica basata sullatomizzazione con fiamma; 24C: Spettroscopia atomica con atomizzatori elettrotermici; 24D: Metodi di emissione atomica basati su sorgenti a plasma.

3 3 Capitolo 24 SPETTROSCOPIA ATOMICA Capitolo 26 INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI Capitolo 27 APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA Capitolo 29 SELEZIONE DEI METODI DI ANALISI

4 4 CAPITOLO 24 – SPETTROSCOPIA ATOMICA In spettroscopia atomica lanalita è presente sotto forma di nube atomica. Essendo impossibili vibrazioni e rotazioni, lo spettro atomico è a righe, non a bande (una banda è linviluppo di numerosissime righe). Livelli energetici possibili per un atomo. Livelli energetici possibili per una molecola p. 476

5 5 Spettri atomici – a righe, e spettri molecolari - a bande Spettro di assorbimento del permanganato nellintervallo 450 – 650 nm. Spettro di assorbimento di atomi di silicio nellintervallo 250 – 253 nm.

6 6 p. 477

7 7 Atomizzazione in fiamma p. 479

8 8 Bruciatori a flusso laminare p. 479

9 9 p. 481 in cui n 1 e n 0 sono il numero di particelle negli stati E 1 e E 0, cost è una costante dipendente dai livelli coinvolti nella transizione, k = 1, J/°K è la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta. Il controllo della temperatura della fiamma è fondamentale al fine di ottimizzare la misurazione. A 2500°C, un aumento di 10°C aumenta del 3% il numero di atomi di Na aventi lelettrone ottico nello stato 3p. Parallelamente, il numero di atomi di Na con lelettrone nello stato fondamentale (3s) diminuisce dello 0,002%. Il controllo della temperatura è più importante in assorbimento o in emissione? Si ricordi leq. di Boltzmann:

10 10 Gli spettri di emissione in fiamma sono più ricchi di righe di quelli di assorbimento. Si noti il contributo spettrale (a bande) del radicale MgOH. p. 483 Lassorbimento da parte di specie atomiche, a righe, è detto specifico. Lassorbimento da parte di specie molecolari o radicaliche, a bande, è un assorbimento aspecifico. Questultimo può essere eliminato mediante opportuni accorgimenti sperimentali (sottrazione del background).

11 11 Spettroscopia di assorbimento atomico in fiamma Nella spettofotometria UV-VIS molecolare, il monocromatore permette di selezionare una stretta banda di lunghezze donda (per es. 0,1 – 2 nm) tra quelle emesse dalla sorgente. Questa banda passante può essere considerata monocromatica in quanto gli spettri di assorbimento molecolare sono costituiti da bande molto larghe. 1,0 nm Che significa, in pratica, radiazione monocromatica?

12 12 Confronto di spettri di assorbimento molecolari (blu) e atomici (rosso). In AAS, la larghezza di una riga può essere dellordine di nm. Non esiste monocromatore in grado di fornire una simile banda passante. Inoltre, sarebbe molto difficile isolare la lunghezza donda dinteresse! p. 485 Al fine di produrre una radiazione sufficientemente monocromatica, è necessario modificare radicalmente la sorgente.

13 13 La lampada a catodo cavo Una lampada a catodo cavo (HCL, Hollow Cathode Lamp) moderna consiste in un tubo di vetro riempito di un gas inerte (Ne o Ar) ad una pressione di circa 5 mmHg, nel quale sono inseriti un anodo formato da un filamento, di solito di tungsteno o nichel, e un catodo a forma di cilindro cavo, contenente il metallo o, più in generale, lelemento di cui si desidera ottenere lemissione delle righe di risonanza. Applicando agli elettrodi un campo elettrico di alcune centinaia di volt, i pochi ioni ed elettroni presenti nel gas inerte vengono accelerati e, data la bassa pressione, riescono a raggiungere unenergia cinetica sufficiente a ionizzare per urto altri atomi. p. 486 A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo. Si ha quindi la formazione di un vero e proprio plasma, in cui gli ioni positivi colpiscono la superficie del catodo provocando lo sputtering (emissione di atomi da una superficie bombardata da particelle) degli atomi di cui essa è costituita.

14 14 La lampada a catodo cavo Gli atomi emessi dal catodo, passando attraverso la regione della scarica, ricca di ioni e atomi eccitati del gas nobile, sono eccitati a loro volta ed emettono le loro tipiche righe spettrali. Grazie alla costruzione della lampada e alla forma geometrica del catodo il fascio di radiazione emesso risulta relativamente ben collimato. A: anodo; B: corpo della lampada; C: catodo cavo; I: setti isolanti; QW: finestra di quarzo. p. 486

15 15 La lampada a catodo cavo La larghezza naturale è determinata dalla vita media dei livelli coinvolti nella transizione (tanto più un livello è eccitato, tanto minore è la sua vita media, tanto maggiore è la sua larghezza naturale). La larghezza Doppler è originata dalla variazione di frequenza connessa con la componete della velocità dellatomo emettitore/assorbitore nella direzione di osservazione, ed è prevalentemente funzione della temperatura. La larghezza Lorentz è determinata dalle interazioni reciproche tra gli atomi emettitori/assorbitori, ed è quindi funzione della pressione. p La larghezza di una riga atomica (FWHM: Full Width at Half Maximum) è determinata da tre componenti: FWHM = FWHM Nat + FWHM Lorentz + FWHM Doppler

16 16 La lampada a catodo cavo La HCL lavora a pressione e temperatura inferiori a quelle della fiamma. Le righe emesse dalla HCL sono quindi caratterizzate da minori allargamenti Doppler e Lorentz e hanno unampiezza inferiore a quella tipica delle righe di assorbimento degli atomi eccitati nellatomizzatore. Di conseguenza queste sorgenti sono in grado di fornire FWHM adeguatamente ridotte alla lunghezza donda specifica dellanalita di interesse. Perché? p. 485

17 17 La lampada a scarica senza elettrodi p. 487 Fra le sorgenti utilizzate in FAAS e FAFS, le lampade a scarica senza elettrodi (EDL) mostrano le più elevate intensità radianti, e le righe di emissione più strette. Una EDL consiste in un tubo di quarzo lungo parecchi centimetri e del diametro dellordine di 5-10 mm. Il tubo è riempito con pochi milligrammi dellelemento di interesse (come metallo puro, alogenuro o metallo con aggiunta di iodio) sotto una pressione di argon di alcuni Torr. Il tubo è circondato dalle spire di un generatore di radiofrequenza. Questa lampada richiede quindi uno speciale alimentatore. Quando viene attivato il campo di radiofrequenza, lenergia ad esso associata causa levaporazione del metallo; lurto con gli atomi del gas inerte provoca lemissione delle righe spettrali caratteristiche. Queste lampade sono di più complessa costruzione rispetto alle lampade a catodo cavo e presentano una vita relativamente più breve.

18 18 Schemi a blocchi degli spettrometri di assorbimento atomico Schemi a blocchi di spettrometri di assorbimento atomico: a) strumento a singolo raggio/alimentazione continua; b) strumento a singolo raggio/alimentazione modulata; c) strumento a doppio raggio. La modulazione della sorgente permette al rivelatore di distinguere la radiazione proveniente dalla HCL da quella emessa dalla fiamma. La modulazione può essere elettronica (modulazione dellintensità di corrente applicata agli elettrodi della HCl) o meccanica (mediante chopper). p. 487

19 19 Interferenze Interferenze chimiche: dovute prevalentemente alla formazione di composti che influiscono sul rendimento dellatomizzazione o a ionizzazione dellanalita. Interferenze spettrali: quelle dovute alla presenza di righe di assorbimento di atomi diversi dallanalita sono relativamente rare. quelle dovute alla presenza di specie radicaliche o molecolari sono molto frequenti e producono generalmente un aumento del fondo (background). p. 488 Le interferenze più comuni in AS sono di due tipi:

20 20 Correzione del fondo La correzione del fondo può essere eseguita dotando lo spettrometro di una lampada addizionale a deuterio. p. 489 Il chopper è un disco rotante con settori vuoti alternati a settori muniti di specchio.

21 21 La fenditura del monocromatore isola la riga di risonanza dello spettro emesso dalla HCL, con una FWHM dellordine di 0,002 nm, mentre separa dallo spettro continuo della lampada a deuterio con una FWHM dellordine di 0,2-0,7 nm; Correzione del fondo mediante lampada a deuterio La HCL emette uno spettro a righe, quella a deuterio uno spettro continuo. Le intensità delle due sorgenti vengono eguagliate entro lintervallo spettrale considerato; In presenza di assorbimenti specifici (dellanalita in esame) I cc viene ridotta proporzionalmente alla concentrazione dellanalita mentre I D non viene ridotta che di una frazione trascurabile;

22 22 In presenza di un assorbimento aspecifico (fondo) le due correnti sono ridotte in ugual misura; I correttori a deuterio compensano fino a circa 0,6 unità di assorbanza del fondo. Nei casi in cui tale compensazione non è sufficiente si deve necessariamente ricorre a metodi di correzione più sofisticati. In presenza di un assorbimento specifico e, contemporaneamente, aspecifico, lintensità della radiazione emessa dalla lampada a deuterio, ridotta dal solo assorbimento aspecifico, fornisce il valore di I 0 da usare nellequazione 2.12 mentre lintensità della radiazione emessa dalla HCL, ridotta da entrambi gli assorbimenti, fornisce il valore di I. Lassorbimento viene misurato in assenza del fondo.

23 23 Analisi quantitativa mediante FAAS Lanalisi quantitativa in FAAS si basa su misurazioni relative. È necessario costruire curve di taratura analizzando un adeguato numero di soluzioni standard. Il metodo più sicuro è quello dellaggiunta standard. Allo scopo, prima dellanalisi il campione è suddiviso in subcampioni. Uno di essi è trattato come al solito, mentre gli altri vengono processati dopo aggiunte crescenti di misurando. La determinazione analitica viene eseguita su tutti i subcampioni. Alternativamente è possibile eseguire aggiunte successive di analita nello stesso campione in esame (correggendo eventualmente le concentrazioni così realizzate per leventuale diluizione associata ad ogni aggiunta). In generale, lo scopo di questo modo è di compensare gli errori proporzionali che deriverebbero dalluso di standard aventi composizione diversa da quella della matrice dei campioni in esame. Al fine di ottenere una buona stima della sensibilità, è necessario aggiungere analita in quantità sufficiente almeno a raddoppiare il segnale. Il metodo è valido se usato nel range lineare, e se il bianco non ha un segnale apprezzabile, dato che è impossibile verificare sperimentalmente la correttezza di questa condizione. Vedere equazioni a p. 491 e 492. p. 491

24 24 Metodo dellaggiunta standard p. 491

25 25

26 26 SPETTROMETRIA ATOMICA CON ATOMIZZAZIONE ELETTROTERMICA (ETAAS) In questo tipo di AS latomizzazione viene ottenuta mediante effetto Joule. Il campione viene introdotto in un tubicino di grafite per mezzo di una micropipetta o di un campionatore automatico. Per mezzo di un opportuno programma termico automatizzato (essiccamento, incenerimento, atomizzazione) si provoca latomizzazione dellanalita in presenza di minimi residui di matrice. Il segnale è transiente, non continuo come in FAAS. p. 497

27 27 SPETTROMETRIA ATOMICA DI EMISSIONE CON SORGENTI A PLASMA Questo tipo di spettroscopia atomica di emissione sfrutta le elevate temperature (6000 – K) realizzabili con sorgenti a plasma. Gli strumenti più popolari usano un plasma ad accoppiamento induttivo. p. 501 Flusso Ar: 11 – 17 L/min Potenza: 2 kW a circa 27 MHz Ignizione: piezoelettrica Iniezione analita: come aerosol Interferenze: scarse Ionizzazione: ridotta a causa dellelevata concentrazione di ioni Ar + Range lineare: 3-5 ordini di grandezza

28 28 Sorgenti ICP

29 29

30 30 CAPITOLO 26 – INTRODUZIONE AI METODI CROMATOGRAFICI DI ANALISI Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni in campo alimentare. Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte) una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria. p. 516 La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase stazionaria. Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas cromatografia (GC) la fase mobile è un gas.

31 31 CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI p. 517

32 32 PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute allinterno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m): X m X s A: il campione viene iniettato allentrata della colonna B D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria ABCD Flusso del solvente p. 518 Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X è definito come: Quale componente ha K maggiore?

33 33 p. 521 Tempo di ritenzione (t R ): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dallinizio alluscita della colonna. Tempo morto (t M ): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Analogamente si definiscono i corrispondenti: Volume di ritenzione (V R ): volume di fase mobile necessario ad eluire lanalita dallinizio alluscita della colonna. Volume morto (V M ): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna). tRtRtRtR tMtMtMtM

34 34 Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dellanalita lungo la colonna è il fattore di capacità, k. Si dimostra che k può essere ricavato dai parametri del cromatogramma: Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k. p. 522 La selettività quantifica lentità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con t R ) B > (t R ) A. La selettività quantifica lentità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con ( t R ) B > (t R ) A.

35 35 I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: 1.diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela allasse della colonna); 2.percorsi multipli; p. 524 Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. 3.trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria.

36 36 Laltezza equivalente al piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare lefficienza di colonne di differente lunghezza. 1)Altezza equivalente di piatto teorico H 2)Numero di piatti teorici N L = lunghezza colonna Si può dimostrare che W = larghezza del picco W p Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. Parametri che descrivono quantitativamente lefficienza di una colonna (ampiezza dei picchi):

37 37 Variabili che influenzano lefficienza di una colonna: p. 529 La principale variabile che influenza lefficienza di una colonna è la velocità di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria. Laltezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive lefficienza della colonna, dipende proprio dalla velocità di flusso della fase mobile (vedere Figura a lato). Sia in LC che in GC la velocità di flusso ottimale è piuttosto bassa. Quella ottimale della LC è inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocità un po maggiori di quella ottimale. La LC è caratterizzata da valori di H inferiori alla GC. In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: 50 m; LC: < 50 cm), la GC è comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.

38 38 Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività) vedere equazione successiva. La risoluzione, R, è una misura quantitativa della capacità di separare due analiti. Essa è ricavabile dal cromatogramma: p. 530 Vedere Figura La risoluzione caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo allefficienza di separazione (denominatore).

39 39 Si può dimostrare che: Effetto della selettività, dellefficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa buona risoluzione dovuta a buona efficienza risoluzione scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi non separati picchi stretti picchi distanti p. 531

40 40 Le applicazioni della cromatografia vanno dallanalisi qualitativa a quella quantitativa di miscele anche molto complesse. Lanalisi quantitativa sfrutta la misurazione dellaltezza o dellarea dei picchi. La misurazione dellarea è più affidabile in quanto non risente delleventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro. I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dellanalita nella miscela in esame mediante interpolazione. Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dellanalita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è vicino ma separato da quello dellanalita). p. 533

41 41 Anion-exchange chromatogram with electrochemical detection of a mixed standard solution containing mM of: 1) glycerol, 2) meso-erythritol, 3) adonitol, 4) histamine, 5) glucose. Flow Rate 0.4 mL/min. Isocratic elution with 0.4 M NaOH. I.G. Casella, M. Gatta, E. Desimoni, Determination of histamine by high-pH anion-exchange cromatography with electrochemical detection, Food Chem., 73 (2001) 367) min nA

42 42 CAPITOLO 27 – APPLICAZIONI DELLA CROMATOGRAFIA GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.

43 43 p. 538 He, Ar, N 2, H 2 SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

44 44 Iniezione ed iniettori Il campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a 0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari). Lentrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere levaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro. Colonne gascromatografiche Si suddividono in impaccate e capillari. Le impaccate contengono particelle solide che vengono impaccate: diatomee o diatomee silanizzate, per ridurre la polarità mediante arricchimento superficiale di gruppi metilici. Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = mm; lunghezza = m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche ) grazie alla loro elevata lunghezza. p. 539

45 45 Colonna capillare standard a fase legata

46 46 p Influenza della T sui t R : più la temperatura è elevata più il soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa aumentando T diminuisce t R 45° 145° programma di T

47 47 Rivelatori Dovrebbero avere le seguenti proprietà: risposta lineare, stabilità, risposta uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva). Il rivelatore ideale non esiste. 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di riferimento, laltra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta alleluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2. p. 540 controllo della corrente del filamento cella di riferimento cella del campione registratore attenuatore a ponte Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul principio del ponte di Wheatstone.

48 48 Il rivelatore a ionizzazione di fiamma è forse il più diffuso. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della fiamma stessa. È più sensibile di quello a conducibilità termica (fino a g/mL). + - p. 542

49 49 La fase liquida per CGL deve essere caratterizzata da Bassa volatilità Stabilità termica Inerzia chimica Caratteristiche solventi (valori ottimali di k e p. 543 FASI LIQUIDE PER CROMATOGRAFIA GL

50 50 HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori. A B C A.crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 m, D = mm, L = cm) B.HPLC con riempimento pellicolare (d = m, D = 1-3 mm, L = cm) C.HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L = cm) d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna p. 546

51 51 LC classica: dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC; velocità di flusso molto basse; tempi di analisi lunghi. Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi canali interparticellari. HPLC: impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; contropressioni maggiori; contropressioni maggiori; tempi d analisi contenuti. tempi d analisi contenuti. Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario luso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile).

52 52 SCHEMA DI CROMATOGRAFO HPLC p. 547 SERBATOIO SOLVENTE POMPA FILTRO MISURATORE PRESSIONE SPURGO INIETTORE PRECOLONNA COMPARTIMENTO TERMOSTATATO COLONNA RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI REGISTRATORE

53 53 ELEMENTI DI CROMATOGRAFO HPLC Riserva di fase mobile (degasamento, eluizione isocratica o a gradiente) Sistema di pompaggio (pressioni fino a 6000 psi 400 atm) Sistema di iniezione p. 548

54 54 Colonne (precolonne*, colonne analitiche, le più diverse) Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nellUV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universale (rivela tutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono: rivelatore UV-vis rivelatore UV-vis rivelatore a fluorescenza rivelatore a fluorescenza rivelatore a indice di rifrazione (RI) rivelatore a indice di rifrazione (RI) 3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System HPLC Columns * Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria p. 548

55 55 p. 551

56 56 p. 550 HPLC DI RIPARTIZIONE Fase stazionaria e mobile immiscibili luna con laltra: liquidi con proprietà solventi notevolmente diverse. Limitata a composti con valori di k' relativamente bassi perché la fase stazionaria deve essere un buon solvente per il campione, ma un cattivo solvente per la fase mobile: aumentando la forza del solvente per poter eluire composti con valori elevati di k' si aumenterà anche la solubilità della fase stazionaria; utile per risolvere differenze molto piccole nella solubilità degli analiti: limpiego della coppia fase stazionaria/fase mobile appropriata permette unalta selettività. I primi lavori con cromatografia di ripartizione usavano fasi stazionarie altamente polari (glicol, acqua,ecc.) e fase mobile non polare (esano, isopropiletere, ecc) ovvero operavano in fase normale. Attualmente, la fase stazionaria più usata è apolare (un idrocarburo) e quella mobile è un solvente relativamente polare (metanolo, acqua, acetonitrile, ecc.): questo tipo di cromatografia viene detto a fase inversa.

57 57 BPLC (Cromatografia a fasi chimicamente legate ) per i riempimenti della LC sono stati utilizzati tre tipi generali di legami chimici nei quali i gruppi Si-OH possono essere : 1. esterificati per reazione con alcoli producendo esteri di silicati 2. silanizzati per reazione con organocloro- o organoalcossi-silani 3. trasformati per clorurazione in Si-Cl e, in seguito, in Si-C per reazioni di Grignard o Wurtz, o qualche altra reazione tipica dei composti alogenati. gli impaccamenti sono più stabili nel tempo. Si-OH + HOR Si-O-R + H 2 O Si-OH + SOCl 2 Si-Cl + SO 2 + HCl Si-Cl + R-Mg-Br Si-R + MgClBr Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl R' 1 2 3

58 58 HPLC DI ADSORBIMENTO Fase stazionaria: materiali adsorbenti come solidi porosi (silice, allumina) con area superficiale specifica da m 2 /g preparati in particelle di dimensioni appropriate. I gel di silice, per esempio, sono preparati facendo reagire silicato di Na con un acido minerale (es. HCl) e poi mediante polimerizzazione con formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di SiO 4. A seguito della disidratazione si forma un solido stabile poroso con terminazioni superficiali silanoliche e silossaniche. Le interazioni tra superficie adsorbente e soluto variano da non specifiche (forze di dispersione o di Van der Waals) a specifiche (interazioni elettrostatiche o interazioni tra accettori o donatori di elettroni -legami idrogeno). gruppi silossanici gruppi ossidrilici isolati legami idrogeno p. 552

59 59 La ritenzione su silice o allumina dipende principalmente dalle interazioni con i gruppi funzionali degli analiti: classi diverse di composti possono essere separate le une dalle altre, ad es. alcoli (polari) e idrocarburi alifatici (non polari). Le posizioni relative dei gruppi funzionali nella molecola di analita e il numero e disposizione spaziale dei siti di adsorbimento sulla superficie rendono la LSC una tecnica di grande utilità per la separazione di composti polifunzionali, in particolare isomeri geometrici. para meta orto Separazione LSC degli isomeri della nitroanilina su allumina Il primo ad essere eluito è lisomero orto, che presenta legami ad H intramolecolari (minore tendenza allinterazione con la superficie dellallumina), mentre lisomero para è trattenuto più fortemente perché presenta più facilmente interazioni con lallumina.

60 60 Influenza della fase mobile: l e interazioni implicano una competizione tra le molecole dellanalita e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento. I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento (serie eluotropica). idrocarburi alif. olefine idrocarburi arom. alogenurisolfurieterinitrocomposti esteri, aldeidi e chetoni amminesolfonisolfossidiammidi ac. carbossilici acqua polaritàpolaritàpolaritàpolarità Nelle note a margine p. 543

61 Fase mobile debole : i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppo allargati). Fase mobile forte: saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente. Come separare tutti i componenti con K molto diversi? è necessario far variare la velocità di migrazione delle bande durante il corso dellanalisi: eluizione a gradiente. Leluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del solvente viene progressivamente aumentata. Leffetto complessivo è quello di una eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso, di una riduzione nella formazione di code. In GC il gradiente è un gradiente di temperatura. Perché? ELUIZIONE A GRADIENTE

62 62 SOLVENTEDEBOLE SOLVENTEFORTE FORZAINTERMEDIA GRADIENTE DI SOLVENTE

63 63 Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzati con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori di cationi; -NHR 2 +, -NR 3 +, come scambiatori di anioni). Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica. Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzati con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori di cationi; -NHR 2 +, -NR 3 +, come scambiatori di anioni). Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica. p. 554 scambio cationicoX + + R - Y + Y + + R - X + scambio anionicoX - + R + Y - Y - + R + X - dove:X = ione del campione Y = ione della fase mobile (controione) R = sito ionico sullo scambiatore Lo scambio dipende dal pH, temperatura, forza ionica, natura e concentrazione, dello ione competitore, ecc. HPLC A SCAMBIO IONICO Per composti ionici, ionizzabili (acidi e basi organiche), e che possono interagire con gruppi ionici.

64 64 I.G. Casella, M. Contursi, E. Desimoni, Amperometric detection of sulphur-containing compounds in alcaline medium, Analyst, 127 (2002) Liquid chromatogram of unspiked white wine (Grifo Bianco, diluted 1:200). Column: IonPac AS12A analytical column (200 x 4 mm I.D.) plus IonPac AG12A (50 x 4 mm I.D.) guard column (Dionex, Sunnyvale, CA). Applied potential: 0.55 V vs. Ag/AgCl. Carrier electrolyte: 0.1 M NaOH. Flow rate: 1.0 mL/min. Sample Loop: 20 mL.

65 65 HPLC AD ESCLUSIONE È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.). HPLC AD ESCLUSIONE È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.). p. 557 Fasi stazionarie: particelle di polimeri e silice a porosità uniforme e controllata. Il tempo di residenza degli analiti nella fase stazionaria dipende dalle loro dimensioni. Se sono abbastanza piccole rimangono intrappolate nei percorsi multipli allinterno delle particelle. Se sono troppo elevate non penetrano nella fase stazionaria e vengono eluite velocemente. Le tecniche che usano impaccamenti idrofili ed idrofobi sono note rispettivamente come gel- filtrazione e, rispettivamente, gel-permeazione. Si usano rispettivamente per specie polari e specie non polari. Fase mobile: la fase mobile ha la stessa polarità dellimpaccamento (acquosa per impaccamenti idrofili e apolare per quelli idrofobi).

66 66 Cromatogramma HPLC a gradiente in fase inversa di una miscela di proteine idrofobe depositate su lenti di contatto. Fase stazionaria: polistirene. Fase mobile: A (sol. Acq. Ac. formico 20%) + B (2-propanolo/acetonitrile 2/1) - gradiente: 5-70% B in 50 min. Rivelatore: UV (Hasan, Azeem; Hanson, Stacy; Smith, David; Smith, JeanResearch supported by a grant from the NIH, EY RO and The Nebraska Center for Mass Spectrometry) 1: B2 – 23,3 kD; 2: D – 20,6 kD; 3: D – 20,2 kD; 4: A – 20,0 kD

67 67 CAPITOLO 29 – SELEZIONE DEI METODI DANALISI In prima approssimazione, un problema analitico può essere condensato nellinsieme delle seguenti informazioni: Analita Matrice Analisi qualitativa, quantitativa o di speciazione Livello di concentrazione Risoluzione (laterale, in profondità) Incertezza di misura (esattezza, precisione) Numero di campioni Tempi Costo Per aiutarsi nella selezione di una tecnica analitica potenzialmente idonea alla risoluzione del problema analitico, è utile esaminare le diverse classificazioni delle tecniche di analisi strumentale.

68 68 Tabella 1 - Tecniche di analisi strumentale in funzione della profondità di campionamento Profondità campionata Tecniche di analisi di massa (bulk)> 100 nm Tecniche di analisi di strato sottile (thin layer) nm Tecniche di analisi di superficie< 10 nm Tabella 2 - Tecniche di analisi strumentale in funzione del principio fisico utilizzato Tecniche spettroscopiche di analisi Tecniche cromatografiche di analisi Tecniche elettrochimiche di analisi Tecniche mediante analisi termica Tecniche radiochimiche di analisi Tecniche ifenate

69 69 Tabella 3 - Principali tecniche di analisi strumentale spettroscopica Spettroscopia UV-visibileUV-VIS Spettroscopia infrarossaIR Spettroscopia IR a trasformata di FourierFTIRS Spettroscopia Raman Spettroscopia di fluorescenza molecolareFS Spettroscopia di assorbimento atomico in fiammaFAAS Spettroscopia di assorbimento atomico elettrotermicoEAAS o ETAAS Spettroscopia di assorbimento atomico a vapori freddiCVAAS Spettroscopia di emissione atomicaAES Spettroscopia di emissione a plasmaICP Spettroscopia di fluorescenza atomicaAFS Spettroscopia di assorbimento a raggi XXAS Spettroscopia di emissione a raggi XXES Spettroscopia di fluorescenza a raggi XXFS Spettroscopia di risonanza magnetica nucleareNMR Spettroscopia di risonanza magnetica elettronicaESR Spettroscopia fotoacusticaPAS Spettroscopia di massaMS

70 70 Tabella 4 - Tecniche basate sulla spettrometria di massa Spettrometria di massa MS Spettrometria di massa di ioni secondari SIMS Spett. di massa mediante bombardamento con atomi veloci FABS Spettrometria di massa a tempo di volo TOF-SIMS Tabella 5 - Principali tecniche di analisi cromatografica Cromatografia gas-liquidoGLC Cromatografia gas-solidoGSC Cromatografia gas-fase legataBPGLC Cromatografia liquido-liquidoLLC Cromatografia liquido-solidoLSC Cromatografia liquido-fase legataBPLLC Cromatografia liquida ad alte prestazioniHPLC Cromatografia su strato sottileTLC Cromatografia a scambio ionicoIEC Cromatografia a esclusione molecolareSEC/GPC

71 71 Tabella 6 - Principali tipi di rivelatori per analisi strumentale cromatografica Rivelatore a termoconducibilità Rivelatore a cattura di elettroni Rivelatore ad elio metastabile Rivelatore ad emissione termoionica Rivelatore a fotoionizzazione Rivelatore a conducibilità elettrolitica Rivelatore a spettrometro di massa Rivelatore FTIR Rivelatore UV Rivelatore a indice di rifrazione Rivelatore a fluorescenza Rivelatore elettrochimico Rivelatore a ionizzazione di fiamma Rivelatore a spettrometro a plasma Rivelatore a spettrometro di massa

72 72 Tabella 7 - Principali tecniche di analisi strumentale elettrochimica TecnicaVariabileRisposta controllata misurata Potenziometriai (= 0)E Voltammetria e polarografia Polarografia a impulsi normali (NPP)Ei vs. E Polarografia a impulsi differenziali (DPP) Voltammetria di ridissoluzione anodica (ASV) Voltam. di ridiss. anodica diff. pul. (DPASV) Voltam. di adsorbimento e ridiss. (AdSV) Voltammetria ciclica (CV) Voltammetria ad onda quadra (SWV) Elettrogravimetriai o Emassa Coulometriai o Ecarica Analisi mediante iniezione in flusso (FIA)Ei vs. t Tecniche conduttometricheE (AC)i (AC)

73 73 Tabella 8a - Acronimi delle principali tecniche danalisi strumentale AASAtomic Absorption Spectroscopy AESAtomic Emission Spectroscopy AFMAtomic Force Microscopy AFSAtomic Fluorescence Spectroscopy ASVAnodic Stripping Voltammetry BPGLCBonded Phase Gas-Liquid Chromatography BPLLCBonded Phase Liquid-Liquid Chromatography CVCyclic Voltammetry CVAASCold Vapour Atomic Absorption Spectroscopy DPASVDifferential Pulse Anodic Stripping Voltammetry DPPDifferential Pulse Polarography ECExclusion Chromatography EPRElectron Paramagnetic Resonance ESRElectron Spin Resonance EAAS/ETAASElectrothermal Atomic Absorption Spectroscopy FAASFlame Atomic Absorption Spectroscopy FIAFlow Injection Analysis FTIRSFourier Transform IR Spectroscopy GCGas Chromatography

74 74 Tabella 8b - Acronimi delle principali tecniche danalisi strumentale GLCGas-Liquid Chromatography GPCGel Permeation Chromatography GSCGas-Solid Chromatography HPLCHigh Performance Liquid Chromatography ICPInductively Coupled Plasma IRInfra-Red Spectroscopy LCLiquid Chromatography LC-MSLiquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-UVLiquid Chromatography-UV Spectroscopy LLCLiquid-Liquid Chromatography LSCLiquid-Solid Chromatography MSMass Spectrometry NMRNuclear Magnetic Resonance NPPNormal Pulse Polarography PASPhotoacustic Spectroscopy SECSize Exclusion Chromatography STMScanning Tunneling Microscopy TLCThin-layer Chromatography TOF-SIMSTime-of-Flight Mass Spectrometry UV-VISUltraviolet and Visible (Spectroscopy)

75 75 CONSIDERAZIONI GENERALI Evidentemente è molto improbabile che si possa trovare in letteratura un metodo caratterizzato da precisione, limite di rivelabilità, specificità, semplicità, ecc. quali quelli da noi desiderati. Di volta in volta bisogna limitare larea di ricerca. Se lanalita è un metallo (per es. Pb, Cd, Cr, ecc.), e quindi non sono richieste informazioni sulla sua speciazione, lideale è ricorrere alla spettroscopia atomica. La tecnica sarà scelta prevalentemente in funzione della concentrazione di analita (Vedere Tabella 24-4). Se lanalita è una singola specie elementare (per es. Cr(VI), As(III), Se(IV) ecc.), e quindi si tratta di eseguire unanalisi di speciazione, sarà invece necessario dimenticarsi della spettroscopia atomica e ricorrere a metodi specifici (per es. ad un metodo CSV per il Cr(VI).

76 76 Se lanalita è una miscela complessa di carboidrati, converrà pensare subito a qualche metodo HPLC. In questo caso sarà meglio disporre del rivelatore più adatto alla concentrazione dei vari analiti. Nel caso più comune potrà bastare un rivelatore a indice di rifrazione (ldr: 0,1 -1 %). Ma questo rivelatore non ammette leluizione a gradiente. Se gli analiti sono presenti a livelli più bassi di concentrazione, sarà necessario ricorrere a derivatizzazioni post-colonna ed a rivelatori UV. Alternativamente, è possibile convertire gli zuccheri in composti volatili, mediante opportune reazioni, ed analizzare il risultato mediante cromatografia gas-liquido. In numerosi casi si potrà ricorrere a metodi specifici, quali quello spettrofotometrico VIS per il Cr(VI) nelle acque (US EPA Method 7196A - range: mg/L ) o quello, sempre nel visibile, per determinare la qualità dello zafferano (BS6145:1981 – ISO ).

77 77 Se lanalisi riguarda la quantificazione di cationi, o anioni, in un acqua di scarico, potrebbe convenire ricorrere alla cromatografia ionica.


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