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INGEGNERIA PROTEICA. Lingegneria proteica è stata usata per due scopi: 1)La dissezione della struttura e dellattività di una proteina esistente, attraverso.

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1 INGEGNERIA PROTEICA

2 Lingegneria proteica è stata usata per due scopi: 1)La dissezione della struttura e dellattività di una proteina esistente, attraverso alterazioni sistematiche e lesame dei cambiamenti delle proprietà. (esempio: tirosil-tRNA sintetasi) 2) La produzione di nuove proteine per la medicina e per lindustria. (esempio: subtilisina)

3 Per comprendere il meccanismo catalitico di un enzima non basta identificare tutti gli intermedi di reazione, ma bisogna conoscere la natura e lenergia delle interazioni tra proteina e substrati, intermedi, stati di transizione, prodotti. Lenergia di queste interazioni è infatti usata per abbassare lenergia di attivazione e per determinare la specificità. Lingegneria proteica è uno strumento di indagine eccellente, in quanto può essere usata per alterare sistematicamente le interazioni tra proteina e substrato e le interazioni allinterno della proteina, al fine di analizzarne le proprietà allosteriche e strutturali.

4 LA TIROSIL-tRNA SINTETASI Questo fu il primo enzima ad essere studiato, nel 1982, tramite ingegneria proteica. Allora, il suo meccanismo catalitico era del tutto sconosciuto, nonostante fosse nota la struttura cristallografica. La tirosil-tRNA sintetasi di Bacillus stearotermophilus è un omodimero e catalizza laminoacilazione del tRNA Tyr in due passaggi: E + Tyr + ATP ETyr-AMP + PP i ETyr-AMP + tRNA Tyr-tRNA + E + AMP Nel primo la tirosina viene attivata formando un complesso enzima- tirosiladenilato molto stabile. Nel secondo la Tyr viene trasferita al tRNA Tyr.

5 Il meccanismo della reazione di attivazione, consiste in un attacco nucleofilo del carbossilato della Tyr sul fosfato dellATP che genera un intermedio pentacovalente. Questultimo elimina il pirofosfato (come sale del Mg 2+ ). Il fosforo inverte la sua configurazione. E stata risolta la struttura cistallografica dei complessi ETyr e ETyr-AMP.

6 I REQUISITI CHE DEVONO ESSERE SODDISFATTI PER CONDURRE DEGLI STUDI SISTEMATICI DI MUTAGENESI SITO-SPECIFICA SONO: La proteina deve essere disponibile in forma ricombinante La struttura cristallografica deve essere stata risolta con una risoluzione elevata. I valori assoluti delle costanti di velocità devono essere noti. Preparazioni diverse di enzima danno valori diversi, per via della presenza di quantità variabili di enzima inattivo. E necessario quindi normalizzare i valori ottenuti tramite titolazione dei siti attivi. Gli studi allo stato pre-stazionario non sono soggetti a queste variazioni e non soffrono della contaminazione di piccole quantità di enzima selvatico.

7 Regole per produrre mutanti che possano dare risultati interpretabili: 1)Le mutazioni devono essere isosteriche o comportare una delezione; 2)Evitare di creare cariche interne non bilanciate; 3)Eliminare il minor numero di interazioni; 4)Non creare nuove interazioni che causino una riorganizzazione locale della struttura; 5) tutte queste regole possono essere infrante se necessario.

8 Residui della tirosil-tRNA sintetasi che formano legami idrogeno con il tirosil adenilato.

9 Strategia: profili dellenergia libera e diagrammi di energia differenziali La misura del profilo di energia libera (in realtà delle differenze di energia libera) della reazione catalizzata dalle forme selvatica e mutanti dellenzima comporta la misura delle seguenti costanti di equilibrio e di velocità: Quindi i profili vengono calcolati utilizzando le teorie della termodinamica e dello stato di transizione. Dalla differenza dei profili dellenzima selvatico e delle forme mutanti si ottengono dei diagrammi di energia differenziali:

10 Diagramma di energia differenziale Energia di legame apparente del gruppo eliminato dalla mutazione

11 Attivazione della tirosina: 1)Dimostrazione della complementarietà tra enzima e stato di transizione Thr40

12 His45

13 Thr40 e His45 formano un sito di legame per il fosfato dellATP nello stato di transizione:

14 Attivazione della tirosina: 2) Scoperta della complementarietà tra enzima ed intermedi: bilanciamento delle costanti di equilibrio interne; sequestro degli intermedi instabili. Cys35 His48

15 Ci sono due buone ragioni per la complementarietà tra enzima ed intermedi di reazione: 1)La complementarietà cambia la costante di equilibrio di reazioni sfavorevoli. Tyr + ATP Tyr-AMP + PP i da 3, a 2,3 il tirosiladenilato deve essere presente ad elevate concentrazioni nellenzima perché deve reagire con il tRNA. 2) La resa delle reazione viene ad essere aumentata perché il sequestro degli intermedi molto reattivi minimizza le reazioni collaterali. Il tirosiladenilato è molto reattivo ed idrolizza rapidamente.

16 Attivazione della tirosina: 3) Rilevamento del processo di adattamento indotto. Residui presenti sul loop KMSK che legano lo stato di transizione

17 La flessibilità e ladattamento indotto rappresentano un compromesso tra complementarietà tra enzima e stato di transizione e libero accesso dei substrati al sito attivo.

18 IL MECCANISMO CATALITICO DELLATTIVAZIONE DELLA TIROSINA Dai risultati dei diagrammi di energia differenziale si evince che la catalisi non è realizzata da alcun residuo in particolare ma dal numeroso insieme di residui che costituiscono il sito attivo. Essa non viene attuata tramite un classico meccanismo di catalisi acido-base o nucleofila, ma è il risultato della sola energia di legame.

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