Liver microRNA hsa-miR-125a-5p may exert an oncosuppressor effect on Hepatocellular carcinoma (HCC) Nicola Coppola1, Giorgio de Stefano2, Nicola Mosca3, Valentina Iodice2, Carmine Minichini1, Filomena Castiello3, Nunzia Farella2, Mario Starace1, Nicoletta Potenza3, Giulia Liorre2, Lorenzo Onorato1, Evangelista Sagnelli1, Aniello Russo3 1: Department of Mental Health and Public Medicine, Second University of Naples 2: IX Interventional Ultrasound Unit for Infectious Diseases- AORN dei Colli- P.O. Cotugno- Naples 3: Department of Life Sciences, Second University of Naples

HCC L’HCC è la quinta neoplasia più comune negli uomini e la nona nelle donne, rappresentando la seconda causa di morte per tumore al mondo Si sviluppa nell’80-90% dei casi su fegato cirrotico e l’eziologia virale è presente in circa l’80% dei pazienti affetti, con il solo HBV responsabile di circa il 50% dei casi El-Serag HB, Gastroenterology 2012; 142:1264-73 Negli ultimi venti anni si è assistito in Italia ad un progressivo incremento delle forme ad eziologia non virale, in particolare correlate a steatoepatite alcolica e non alcolica Santi V et al. J Hepatol 2012;56:387-405 Estimated age-standardised rates (World) per 100,000 GLOBOCAN 2012 v1.0, IARC CancerBase

I microRNA Sono RNA non codificanti della lunghezza di circa 22 nucleotidi Regolano l’espressione genica a livello post- trascrizionale, causando la degradazione dell’mRNA target o impedendone la traduzione Sono implicati in processi di proliferazione e differenziazione cellulare, apoptosi, oncogenesi Eulalio A et al. Cell 2008;132:9-14

MicroRNA ed HCC Come per diverse altre neoplasie, l’espressione di un gran numero di mirna è risultata alterata nelle cellule di epatocarcinoma rispetto agli epatociti sani, tanto in vitro quanto in vivo. Le loro concentrazioni plasmatiche sono state poste in correlazione con la diagnosi, la stadiazione, la prognosi e la risposta al trattamento. Inoltre alcuni di essi potrebbero rappresentare un possibile bersaglio terapeutico. Giordano S et al. Hepatology 2013; 57:840-847 Borel et al. J Hepatol 2012;56:1371-83

3’ UTR dell’mRNA di S Potenza N, Nucl Acid Res 2011

2013 PlosOne 2013

Hsa-mir-125a-5p ed HCC MicroRNA noto per il suo effetto oncosoppressore su cellule di carcinoma polmonare e gastrico attraverso la down- regulation di proteine di trasduzione del segnale attivate dal recettore dell’EGF. Già da tempo è stata descritta l’ipoespressione del mir-125a nel tessuto neoplastico rispetto al non neoplastico in pazienti affetti da HCC Il suo ruolo nell’HCC è stato più di recente posto in correlazione al silenziamento del gene che codifica per SIRT7, fattore di trascrizione iperespresso in cellule di epatocarcinoma, il cui knockdown causa l’arresto del ciclo cellulare in fase G1/S Wang G et al. FEBS J 2009; 276(19): 5571-8 Nishida N et al. Clin Cancer Res 2011; 17(9): 2725-33 Murakami Y et al. Oncogene 2006; 25: 2537–2545 Meng F et al. Gastroenterology 2007;133:647–658 Kim JK et al. Hepatology 2013;57:1055-1067

Obiettivi dello studio Valutare la concentrazione dell’hsa-mir-125a-5p sul tessuto neoplastico e non neoplastico di pazienti con HCC di diversa eziologia Porre in correlazione il profilo di espressione del microRNA con le caratteristiche demografiche, cliniche, biochimiche e virologiche dei pazienti hsa-miR-125a-5p nel tessuto neoplastico hsa-miR-125a-5p nel tessuto non neoplastico Età, sesso, parametri biochimici, eziologia, Child score, stadio BCLC etc.

DEFINIZIONE DELL’EPATOCARCINOMA Pazienti 56 pazienti con diagnosi di epatocarcinoma sono stati seguiti presso l’ UO Malattie Tropicali della SUN e dalla IX Divisione di Ecografia ed Ecointerventistica dell’ AORN dei Colli – Ospedale Cotugno dal giugno 2013 a maggio 2014. DEFINIZIONE DELL’EPATOCARCINOMA CITO-ISTOLOGICA: scarsamente, moderatamente, altamente differenziato e/o RADIOLOGICA: il comportamento contrastografico altamente specifico per HCC è definito dalla presenza di ipervascolarizzazione “wash-in” in fase arteriosa, seguita da ipovascolarizzazione “wash-out” in fase portale e tardiva, nelle diverse metodiche contrastografiche (CEUS/TC ed RMN) AASLD 2011

Metodi Di ogni paziente abbiamo raccolto campioni di plasma  sangue intero  un campione bioptico di HCC  uno del restante parenchima epatico risparmiato dalla neoplasia  Tramite PCR real time sono state valutate le concentrazioni dell’ hsa-mir-125a-5p, espresse in Unità Arbitrarie (AU) in relazione a quelle dell’RNU6B

Metodi Sono stati arruolati in questo studio 45 pazienti consecutivi affetti da HCC su fegato cirrotico, sottoposti a biopsia della lesione epatica presso la IX UOC di Malattie Infettive ad indirizzo ecointerventistico dell’AORN dei Colli, PO Cotugno, da Giugno 2013 ad Aprile 2014 In tutti i pazienti sono stati acquisiti al momento dell’arruolamento i dati demografici, clinici, biochimici e virologici Di ogni paziente è stato raccolto e conservato a in congelatore a -80°C un campione di tessuto neoplastico ed uno di tessuto non neoplastico, su cui sono state dosate tramite metodica PCR real time le concentrazioni dell’ hsa-mir-125a-5p, espresse in Unità Arbitrarie (AU) in relazione a quelle dell’RNU6B

Risultati Caratteristiche demografiche, cliniche, biochimiche e virologiche dei pazienti arruolati N° patients 56 Mean age (+SD) 69.4 (+6.5) Males, n° (%) 30 (53.6) AST/ULN (mean ± SD) 1.52 (+ 0.9) ALT/ULN (mean ± SD) 1.50 (+ 0.9) ALP/ULN (mean ± SD) 3.60 (+ 16.0) Total bilirubin, mg/dl (mean ± SD) 0.99 (+ 0.57) PT% (mean ± SD) 90.10 (+ 12.9) a-fetoprotein, (mean ± SD) 106.22 (+352.5) HBsAg positive patients, n° (%) 9 (16.1) Anti-HCV positive patients, n° (%) HBsAg negative/anti-HBc positive patients, n° (%) 41 (73.2) 14 (25) Patients with NAFLD, n°(%) 6 (10.7)

Caratteristiche clinichedei pazienti arruolati Risultati Caratteristiche clinichedei pazienti arruolati N° patients 56 Child Pugh score, n° (%) of patients with A B C   49 (87.5) 6 (10.7) 1 (1.8) Patients with fist diagnosis of HCC, n° (%) 39 (69.6) Patients with a recidivate HCC, n° (%) 17 (30.4) Patients with a single HCC, n° (%) 31 (55.4) Patients with a multiple HCC, n° (%) 25 (44.6) Patients with portal thrombosis, n° (%) 2 (3.6) BCLC score, n° (%) of patients with 47 (83.9) 7 (12.5)

BOX PLOT MIR-125A EXPRESSION IN NON CANCER vs HCC mir-125a expression (AU) p<0.000 Non-HCC Non-HCC HCC N° of patients 56 56

BOX PLOT MIR-125A EXPRESSION IN NON CANCER vs HCC, PER EZIOLOGIA Non HCC HCC HBV HCV NASH N° of patients 9 41 6

BOX PLOT MIR-125A EXPRESSION IN NON CANCER vs HCC, PER EZIOLOGIA HCV HBV NASH   % Down reg. media down reg tot 80% -6,29 HBV 89% -13,32 HCV 78% -4,99 NASH 100% -3,03

risultati Concentrazioni del microRNA nel tessuto neoplastico in relazioni ai dati clinici ed eziologici Parameter Number Liver HCC hsa-miR-125a-5p, AU mean (SD) p-value Cirrhosis Child-Pugh score A Child-Pugh score B or C   49 7 4.67 (3.47) 7.05 (3.77) 0.099 BCLC score - A - B or C 47 9 4.66 (3.78) 6.31 (2.79) 0.21

risultati Tabella 3: Concentrazioni del mir-125a-5p nel tessuto neoplastico e non neoplastico in relazione alle caratteristiche demografiche, cliniche, biochimiche e virologiche di pazienti Parameter Number Liver HCC hsa-miR-125a-5p, AU median (range) p-value Liver non-HCC hsa-miR-125a-5p, AU median (range) Sex: Male Female   23 22 3.39 (0.47-15.01) 4.74 (0.47-14.57) 0.71 6.78 (1.29-17.57) 7.70 (3.66-17.47) 0.24 Age: < 70 years > 70 years 21 24 5.65 (0.47-10.96) 2.52 (0.47-15.01) 0.32 8.13 (2.85-17.57) 7.04 (1.29-17.47) 0.50 Etiology: HBV HCV NAFLD 5 35 6.80 (2.97-10.96) 2.91 (0.47-14.57) 4.06 (0.96-15.01) 0.03 0.63 10.06 (2.85-12.75) 6.82 (1.29-17.57) 10.15 (2.30-12.52) 0.65 0.88 Cirrhosis Child-Pugh score A Child-Pugh score B or C 40 4.30 (0.47-15.01) 5.32 (1.17-14.57) 0.61 7.91 (1.29-17.57) 6.01 (2.60-7.77) 0.08 HCC First diagnosis Recidive 31 14 5.05 (0.96-10.71) 0.77 7.77 (1.29-17.57) 7.13 (1.76-16-52) 0.90 HCC nodules - One - multiple 26 19 4.04 (0.47-14.57) 0.74 9.80 (1.29-17-57) 6.57 (1.86-17.47) Portal thrombosis - Yes - no 2 43 8.28 (5.86-10.71) 3.46 (0.47-15.01) 0.37 11.32 (7.70-14.94) 7.23 (1.29-17.57) 0.53 BCLC score - A - B or C 39 6 5.86 (2.97-10.71) 0.30 6.86 (1.29-17.57) 10.06 (2.85-14.94) 0.51

Conclusioni L’ipoespressione dell’hsa-mir-125a-5p nel tessuto neoplastico rispetto al non neoplastico sembrerebbe confermare il suo ruolo di oncosoppressore nell’HCC Ulteriori studi su casistiche più ampie sono necessari per chiarire il reale significato clinico di questo microRNA ed indagare il suo potenziale impiego terapeutico

Grazie per l’attenzione! “L’attenzione è la forma più rara e più pura della generosità” (Simone Weil) Grazie per l’attenzione!