ENRICO RODA M.D. DISMICROBISMI INTESTINALI. I PROBIOTICI 48° CORSO FERRATINI 48° CORSO FERRATINI 28 maggio 2009

MICROBIOTA INTESTINALE UMANO I MICRORGANISMI DELLA FLORA INTESTINALE SONO 10 VOLTE MAGGIORI RISPETTO AL NUMERO TOTALE DI CELLULE DELL’ORGANISMO UMANO microorganisms (10 12 CFU/g) > 90% 2 DIVISIONI DOMINANTI ( Bacteroides, Firmicutes); < 10% 5 DIVISIONI SOTTODOMINANTI (Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Cyanobacteria and Verrucomicrobia) > 58 FAMIGLIE: >>: Bacteroidaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae (C.l. I-XVIII); <<: Bifidobacteriaceae, Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae >1000 specie ∞ MICROBIOTA INTESTINALI

Membri dei Firmicutes e dei Bacteroidetes ritrovati nella flora umana non crescono all’esterno Trasmissione verticale dei microbi Effetto del genotipo dell’ospite e dei fattori ambientali sulla composizione del microbiota (studi gemelli adulti mono e dizigoti; studi su famiglie in aree sviluppate e sottosviluppate) Come viene trasmesso il microbiota intestinale tra gli esseri umani? Acquisizione del microbiota e dei geni relativi dai genitori come forma di eredità genetica con possibilità di riprogrammazione

SUPERORGANISMO IL MICROBIOMA UMANO CONTIENE UN NUMERO DI GENI 100 VOLTE SUPERIORE RISPETTO AI GENI DEL GENOMA UMANO Arricchimento del contenuto genetico con sviluppi futuri funzionali L’Essere umano come superorganismo che è composto da cellule e microrganismi che condividono a relazione simbiotica mutualistica

ASSOCIAZIONE MUTUALISTICA Relazione tra membri del microbiota e uomo descritta come commensale (un partner trae beneficio mentre l’altro rimane inalterato) mutualistico Si preferisce usare il termine mutualistico in relazione alla popolazione permanente della flora intestinal (la selezione di comunità stabili favorisce relazioni di vantaggio) Questa associazione mutualistica deriva da una lunga co-evoluzione: ospite-microbiotao genoma umano-microbioma MICRORGANISMO temperatura stabile anaerobiosi nutrienti OSPITE UMANO protezione: - effetto di barriera - Modulazione sistema immunitario - turnover dell’enterocita nutrizione: - SCFAs - vitamine - assorbimento ioni - detossificazione xenobiotici

PROGETTO INTERNAZIONALE MICROBIOTA UMANO Goal: IDENTIFICARE GENI UMANI IN RELAZIONE AL MICROBIOMA Analisi di categorie funzionali di geni e pathways metabolici attraverso approci omici (genomica, proteomica….)

Cambiamenti nella composizione della flora intestinale e patologie del tratto digestivo Enteropatia autoimmune IBS Cancro del colon Malattia diverticolare Intolleranza alimentare SIBO NASH-obesità IBD Flora intestinale

La Sindrome dell’intestino irritabile è una patologia ad eziologia multifattoriale : “vecchi” e “nuovi” fattori eziopatologici Infiammazione Ipersensibilità alimentare Infezioni Acidi biliari Intolleranza Microbiota Fattori genetici Neurotrasmettitori Barbara et al., APT 2004 Fattori psicosociali Alterata motilità Ipersensibilità viscerale viscerale

OUTLINE  Quali sono le evidenze che il microbiota è alterato nella IBS?  Quali sono le conseguenze della alterata flora intestinale? –Attivazione del sistema immunitario mucosale intestinale  Interazione tra il microbiota e il sistema immunitario mucosale –Fattori genetici, alterata permeabilità, Toll Like Receptor  Possiamo intervenire sul microbiota nella IBS?

Colture fecali nella IBS Balsari, 1982 (n=20) Wyatt, 1988 (n=2) Madden, 2001 (n=12) Mättö, 2005 (n=26)consistency Lactobacilli↓↓↓↔☺ Bifidobacter ia ↓↓↓↔☺ Streptococc i -↑-↔☹ E. coli -↑-↔☹ Clostridium↔↑-↔☹ Coliforms↓--↑☹ Barbara et al. Am J Gastroenterol 2005

Tuttavia… 60-80% del microbiota non può essere coltivato in vitro Suau et al., Appl and Environ Microbiol, 1999

Profilo molecolare del microbiota nelle feci di pazienti con IBS ( 16s rRNA sequencing) Kassinen et al., Gastroenterology 2007;133:24-33 Differenze significative tra librerie di cloni di IBS e controlli * Permette il rilevamento di sequenze anche per batteri non dominanti Campioni fecali profilo dell’acido nucleico Guanina Citosina Preparazione del DNA batterico Pool di DNA batterico in base al sottotipo di IBS DNA frazionato in base alla % di GC Selezione delle frazioni con divergenze Clonaggio e sequenziamento dei geni 16s rRNA 10 IBS-D, 8 IBS-C, 6 IBS-M pazienti (Rome II) 23 controlli sani *

Riassunto dei dati relativi alle alterazioni del microbiota nella Sindrome dell’Intestino Irritabile   lactobacilli e bifidobacteria   enterobacteriaceae, coliforms e bacteroides  IBS-D può avere un diverso microbiota vs. IBS-C  Modico aumento nella conta dei batteri nel piccolo intestino Criteri di inclusione non chiari Pazienti ospedalizzati Terapie concomitanti (antibiotici, probiotici, PPI) Diverse diete Diverso transito intestinale H 2 BT non ideale per testare la SIBO Se questi cambiamenti sono casuali, consequenziali, o piuttosto il risultato della costipazione o della diarrea non è chiaro.

 Aumentata produzione di gas (King et al., Lancet 1998)  Deconiugazione degli acidi biliari (Tannock et al., Appl Environ Microbiol 1989)  Attivazione immunitaria (stimolazione dei macrofagi) (Ferrier et al., Am J Pathol 2006)  Aumentata permeabilità intestinale (Moriez et al., Shock 2007)  Cambiamenti nella funzione di motore intestinale (Barbara et al., Am J Gastroenterol 2005)  Ipersensibilità viscerale (Verdu et al., Gut 2006) ENS Muscolo liscio Lume Mucosa Strato muscolare flora intestinale Cellule endoscrine Cellule immunitarie GAS B A Possibili conseguenze del microbiota alterato

Confronto tra cellule del sistema immunitario nella IBS e in altri disordini infiammatori HCIBS * # UC inattiva * # UC attiva * # Colite microscopica # * # P<0.001 vs HC * P<0.001 vs IBS Cremon et al., Am J GE 2009

L’attivazione dei macrofagi attivati in prossimità dei nervi colonici correla con il dolore addominale nella IBS r = 0.75 p = Severity of abdominal pain (VAS) N° macrofagi < 5  m to nerves r = 0.70 p = N° mast cells < 5  m to nerves Frequency of abdominal pain Barbara et al, Gastroenterology 2004 Non evidenza di correlazione tra dolore addominale e numero di macrofagi e rilascio di istamina e triptasi.

Permeabilità paracellulare Dextran FITC UDO HCD-IBSM-IBSC-IBS *** La riduzione di zonulin-1 nell’ IBS come spiegazione dell’ aumentata permeabilità intestinale Biopsie di colon di IBS o HC Piche T, Barbara G et al. Gut 2009 Strato unico di Caco-2

OUTLINE  Quali sono le evidenze che il microbiota è alterato nella IBS?  Quali sono le conseguenze della alterata flora intestinale? –Attivazione del sistema immunitario mucosale intestinale  Interazione tra il microbiota e il sistema immunitario mucosale –Fattori genetici, alterata permeabilità, Toll Like Receptor  Possiamo intervenire sul microbiota nella IBS?

Bifidobacterium infantis migliora i sintomi della IBS e riduce l’infiammazione IL-10:IL-12 ratio * *P=0.001 Composite Likert Score * * * * * * * *P=0.05 Weeks Treatment Period O’Mahony et al., Gastroenterology Rome II pazienti con IBS (64% donne) tutte le abitudini alimentari B. infantisL. salivariusPlacebo Pre-TreatmentPost-Treatment

Effetti dei batteri probiotici sulle citochine speciecitochineriferimenti Lactobacillus plantarum plantarumCaseiBulgaricusReuterisalivarius IL-10 IL-10 TNF  TNF   TNF   IL8 IFN  Pathamakanthan S Borruel N Ma D McCarthy J Bifidobacteriumbreveinfantis TNF  IL10 TNF  IL12 IL10/IL12 Menard S McCarthy J O’Mahony L Streptococcustermophilus TNF  Menard s

Effetti dei batteri probiotici sulla secrezione di mucina Caballero-Franco et al AmJ Physiol 92,G315, 2007

Bifido infantis e lactobacillus salivarius: immunomodulazione della risposta agli agenti patogeni  Attenuazione della risposta proinfiammatoria delle cellule intraepiteliali umane HT-29: NFkB e IL-8  Stimolazione della secrezione di IL10 e TNFa anti-infiammatorie da parte delle cellule mieloidi dendritiche O’Hara et al Immunology 2006;118:202

Effetti sulla motilità  VSL#3 riduce il transito colica nelle IBS  probiotici rilassano il colon prossimale in vitro  Lactobacilli acidophylus e Bifidobacterium bifidum stimolano l’attività mioelettrica intestinale che si pensa elimini l’iper- proliferazione batterica Germ free Lactobacilli acidophilus e Bifidobacterium bifidum Husebye et al Am J Physiol 2001;280:G368

Effetti biologici dei probiotici  Migliorano la funzione di barriera escludendo competitivamente batteri patogeni, riducendo la permeabilità aumentando la mucina (Lactobacilli)  Aumentano le citochine antiinfiammatorie (Bifidobatteri) (Bifidobatteri)  Diminuiscono la motilità del colon senza alterare la forma delle feci  Modulano il dolore intestinale  Competono nel colon con i batteri produttori di gas

Conclusioni  Evidenze iniziali suggeriscono che il microbiota è alterato nei pazienti con IBS  Le conseguenze di questi cambiamenti portano ad alterazioni con attivazione del sistema immunitario che può contribuire a generazione i sintomi  Fattori genetici, difetti della barriera mucosale e dei TLRs possono indurre risposte immunitarie disregolate nei confronti del microbiota intestinale  Nuovi studi sono necessari per confermare questi dati

Malattia diverticolare Manifestazioni cliniche IBS Diverticolosi Sintomi correlati al gas Flatulenza Meteorismo dolore addominale Flora intestinale

Razionale dell’uso di probiotici nel trattamento della malattia diverticolare I Probiotici esercitano funzione antibatterica I Probiotici esercitano funzione antibatterica La stasi del contenuto luminale fornisce lo stimolo per l’infiammazione intestinale I probiotici possiedono effetti antinfiammatori a livello delle superfici mucose I probiotici alterano la composizione della flora intestinale e influenzano la funzione intestinale

Rifaximina + Fibre Glucomannano 2 gr/die ± Rifaximina 400 mg bid x 7 gg/mese Proporzione di pazienti asintomatici o lievemente sintomatici a 12 mesi p=0.001 Papi et al, AP&T 1995 RCT (168 pazienti)

Conclusioni - 1 Rifaximina: utile nel trattamento della MD non complicata e nella prevenzione delle complicanze Mesalazina: utile (continua?) nel trattamento della MD non complicata e nella prevenzione delle complicanze (in associazione?) Associazione R+M: utilità ancora indeterminata

Conclusioni - 2 Probiotici: a fronte di un solido razionale fisiopatologico mancano attualmente solide evidenze di efficacia Chirurgia in elezione: non indicata, nemmeno nel paziente giovane, al primo episodio diverticolitico

Stile di vita (fumo, dieta, stress), microbiota Disregolazione SI Dieta, patogeni, farmaci… Predisposizione genetica IBD

Evidenze cliniche del ruolo della flora intestinale nella patogenesi delle IBD 1.La malattia di Crohn e la rettocolite ulcerosa si localizzano preferenzialmente nel colon e ileo (maggior concentrazione di batteri) 2.Alterata composizione 3.La diversione del contenuto fecale previene e tratta la malattia di Crohn e la pouchite: l’infiammazione compare dopo continuità intestinale 4.Risposte sierologiche ad antigeni della flora intestinale 5.Risposte cellulari T ad antigeni microbiali nei pazienti con CD, UC e pouchite 6.Antibiotici e probiotici migliorano istologicamente, endoscopicamente e clinicamente le IBD 7. Polimorfismi dei geni che codificano recettori batterici in CD Balfour Sartor, Gastroenterology 2008

Pouchitis: risultato di un’alterata flora ? Aumentato numero di aerobi Aumentato numero di aerobi Diminuita ratio anaerobi/aerobi Diminuita ratio anaerobi/aerobi Diminuita concentrazione di bifido e lactobacilli Diminuita concentrazione di bifido e lactobacilli Aumentato pH fecale Aumentato pH fecale Ruseler van Embden et al Gut 1994

Placebo (6%) VSL#3 (85%) Log rank test: p< (%) (months ） Follow up post randomizzazione Mantenimento della remissione Mimura T et al Gut 2004; 53: VSL#3 nel mantenimento della pouchite cronica: risultati

Pouchitis ECCO Statement: Terapia con probiotici VSL#3 (18 x di 8 ceppi batterici per 9 o 12 mesi) ha dimostrato efficacia nel induzione della remissione[EL1b, RG B] VSL#3 (9 x ) ha dimostrato efficacia nel prevenire la pouchite [EL2b, RG C]

Bajzer, Nature 2006 Batteri intestinali diversi fra soggetto obeso e normopeso Questi batteri sono coinvolti nella regolazione del peso corporeo e possono essere considerati fattori importanti nell’epidemia dell’obesità

Ley RE, PNAS 2007 Il microbiota cecale del topo obeso ha importanza significativa 50% riduzione nella componente Bacteroidetes, e aumentata presenza dei Firmicutes

Una simile variazione nella ratio Bacteroidetes / Firmicutes è presente anche nell’essere umano monitorizzato nel corso di un anno di dieta ristretta per carboidrati e grassi Aumento nella percentuale di Bacteroidetes e riduzione nella percentuale di Firmicutes correla con la perdita di peso Gordon, Nature 2006