Tecniche elettroforetiche Le tecniche elettroforetiche permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità. Sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, perché basate su di una diversa velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria, tranne che nel caso dell’l’elettrocromatografia. Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate soprattutto in campo biologico (separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri), e in generale di ioni, sostanze ionizzabili e anfoliti, (es. aminoacidi e peptidi). Trova applicazione anche in altri campi, dati alcuni vantaggi che mostra rispetto alla cromatografia.

PROTOSTORIA DELL’ELETTROFORESI 1886 Lodge – Migrazione di H+ in un tubo di fenolftaleina “gelificato” 1892 Smirnow – Frazionamento di una soluzione di tossine di Ditteri per azione di un campo elettrico 1899 Hardy – Migrazione di globuline in un tubo ad “U” al passaggio di corrente elettrica. 1905 Hardy – Studi dettagliati sul movimento di globuline con varie tipologie di tubi ad “U”. 1907 Field e Teangue - Separazione tossina/antitossina via ponti di agar tra campione ed acqua 1923 Kendall e Crittenden – Separazione preparativa di isotopi in tubi ad “U” di agar

1930 Tiselius – Studi dello strato mobile di proteine in soluzione The Nobel Prize in Chemistry 1948 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius ( 1902 1971) Uppsala University Sweden "for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins" 1930 Tiselius – Studi dello strato mobile di proteine in soluzione 1937 Tiselius - Apparato migliorato per lo studio dello strato mobile 1939 Coolidge – Separazione elettroforetica di proteine del siero in tubi riempiti di lana di vetro 1946 Consden – Ionoforesi di amminoacidi e peptidi su strato di silice; primi esperimenti di “blotting” 1950 Haglund e Tiselius – Elettroforesi su colonna di polvere di vetro 1956 Porath – Elettroforesi su colonna di cellulosa 1964 Ornstein – Apparato per “disc” elettroforesi 1965 Tiselius – “free zone elettroforesi di particelle virali in capillari rotanti di 3 mm I.D.

L’era di Hjerten 1965 Hjerten – “Particle seiving” elettroforesi di ribosomi in tubi di gel di poliacrilammide 1967 Hjerten – Elettroforesi in soluzione in tubi da e mm I.D. 1974 Virtenen – Dimostra i vantaggi di tubi di piccolo diametro 1979 Mikkers – Elettroforesi in capillari polimerici 1981 Jorgenson e Lukacs – Approccio teorico e sperimentale all’elettroforesi ad alta risoluzione in capillari di vetro (CE) 1983 Hjerten – Elettroforesi capillare SDS-PAGE 1984 Terabe – Cromatogrfia micellare elettrocinetica per la separazione di molecole neutre 1987 Cohen e Karger – Dimostrano l’elevata efficienza dell’elettroforesi capillare su gel 1989 Prima strumentazione commerciale per CE

VELOCITA’ DI MIGRAZIONE ELETTROFORETICA V = µep x E = µep x V/L µep = flusso elettroforetico E = campo elettrico In presenza di flusso elettroosmotico µeo si ha: V = (µep + µeo) x V/L

In assenza di flusso elettroosmotico

µeo µep + µep - effetto netto + O -

Doppio strato che origina il flusso elettroosmotico µeo

Micro- and Nanoscale Fluid Mechanics: Transport in Microfluidic Devices Brian J. Kirby http://www.kirbyresearch.com/index.cfm/wrap/textbook/microfluidicsnanofluidicsch6.html

La velocità elettroosmotica è quindi: ELETTROOSMOSI Il valore del potenziale elettroosmotico è dato dall’equazione di Helmholtz ζ = 4πη µeo /ε η = viscosità; ε = costante dielettrica La velocità elettroosmotica è quindi: Veo = E µeo = E ε ζ / 4πη

LA RISOLUZIONE IN ELETTROFORESI L’allargamento della banda di migrazione è dovuto alla sola diffusione longitudinale: σ2 = 2Dm t; t = L/V = L2 / (µeo + µep) V σ2 = 2Dm L2 / (µeo + µep) V N = L2/σ2 = (µeo + µep) V/2Dm R = (µeo+µep1)-(µeo +µep2)=(µep1- µep2) ¼N1/2 = ¼ (µep1- µep2) [V/Dm (µeo + µep)]

Classificazione delle tecniche Le tecniche elettroforetiche si classificano in: elettroforesi priva di carrier, in cui gli ioni migrano in una soluzione tampone. Non viene più usata. elettroforesi mediante carrier, più comunemente utilizzata, in cui gli ioni migrano su un supporto di carta, un gel o un polimero. Un esempio comune è L’elettroforesi classica (es. su carta per la separazione delle proteine del siero) elettroforesi capillare

ELETTROFORESI SU GEL L’ elettroforesi su gel è senza dubbio una delle tecniche maggiormente utilizzate nei laboratori di biologia molecolare, che permette la separazione la visualizzazione e la purificazione di molecole di interesse biologico quali acidi nucleici e proteine. Tale separazione dipende dal peso molecolare e dalla carica elettrica di cui sono dotate tali macromolecole. Tali molecole poste in un campo elettrico generatosi dalla d.d.p. applicata tra due elettrodi, si muoveranno in direzione dell'elettrodo di carica opposta. Gli acidi nucleici migrano naturalmente verso il polo positivo per la presenza nella loro molecola delle cariche negative dei gruppi fosfato (PO4- - ) Il numero di gruppi fosfato è uguale al numero di nucleotidi per cui, se le catene sono completamente svolte, la separazione dipende dal PM. Le proteine si muovono tutte verso il polo positivo e vengono separate in base al PM solo dopo essere state complessate con sodio dodecil solfato (SDS)

GEL DI POLIACRILAMMIDE Variando la concentrazione di acrilamide e di bisacrilamide si creano nel gel maglie di diversa grandezza. La concentrazione di bis-acrilamide può variare dal 3% al 20% rispetto al volume totale del gel. Comunemente si usano i cosiddetti gel piatti ottenuti per polimerizzazione del gel tra due lastre di vetro, che consentono il caricamento di più campioni- Prima del caricamento le proteine in genere sono denaturate, ridotte ed alchilate

STRUTTURA RAMIFICATA DELLA POLIACRILAMIDE

STOCK SOLUTIONS FOR POLYACRYLAMIDE GEL PREPARATION Monomer solution 30% T, 2.5% C Mix 29.25 g of acrylamide and 0.75 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml. 30% T, 3% C Mix 29.10 g of acrylamide and 0.90 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml. 30% T, 4% C Mix 28.80 g of acrylamide and 1.20 g of bisacrylamide. Add water to 100 ml. Initiator solution 40% (w/v) ammonium persulphate This reagent is stable at 4°C for no more than 1 week Catalyst TEMED This reagent is used undiluted. It is stable at 4°C for several months.

Caricamento del campione per una corsa di elettroforesi su gel

VASCHETTA PER GEL

AZIONE DI SDS SULLE PROTEINE

IL MERCAPTOETANOLO RIDUCE I PONTI DISOLFURO

SDS-PAGE di miscele di proteine ridotte ed alchilate in urea 6 mol/L

Elettroforesi su Gel di Poliacrilammide. Isoelettrofocalizzazione

ANFOLINE sostanze anfolitiche usate in isoelettrofocalizzazione

COMMON ADDITIVES FOR IEF Purpose Concentration Limitations Sucrose, Glycerol To improve the mechanical properties of low %T gels and to reduce water transport and drift. 5-20% The increased viscosity slightly slows the focussing process. Glycine, Taurine To change the dielectric constant of the medium. This increases the solubility of some proteins (e.g. globulins) and reduces ionic interactions 0.1-0.5 M Glycine is zwitterionic between pH 4 and 8, Taurine between pH 3 and 7. Their presence somewhat slows the focussing process and shifts the resulting gradient. Urea Disaggregation of supramolecular complexes. 2-4 M Unstable in solution especially at alkaline pH. Solubilisation of water-insoluble proteins, denaturation of hydrophilic proteins. 6-8 M Urea is soluble at >10°C; it accelerates polyacrylamidepolymerisation, so reduce the amount of TEMED added. Non-ionic and zwitterionic detergents Solubilisation of amphiphilic proteins. 0.1-1% To be added to the polymerising solutions just before thè catalysts to avoid foaming; they interfere with polyacrylamide binding substrata; they are precipitated by to reactive TCA and require a specific staining protocol.

OFF-GEL

il gradiente di pH necessario alla focalizzazione può essere formato dal passaggio della corrente in una miscela di sostanze anfotere, gli anfoliti trasportatori (CA): CA-IEF, oppure preformato attraverso la copolimerizzazione in una matrice di PAA di acrilamidoacidi e acrilamidobasi, formando gradienti di pH immobilizzati: IPG

ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

ESTRATTO DI PROTEINE VEGETALI…

…STRESS SALINO

GEL D’AGAROSIO L'agarosio è un polimero lineare naturale di galattosio e 3,6 anidro galattosio. L' agarosio è sciolto in opportuno tampone: Tris Borato EDTA (TBE) oTris Acetato (TAE) e fatto gelificare su un supporto di vetro o di plastica. Si crea così una matrice gelificata le cui maglie permettono la separazione di macromolecole a diverso PM. Anche per l'agarosio è possibile intervenire sulla concentrazione per favorire la migrazione di materiale più o meno grande. In linea di massima il range di concentrazione varia tra lo 0,3% - 2%.

unità strutturale L-galattosil-3,6-anidro-L-galattosio doppie eliche fasci di doppie eliche

UTILIZZAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO PER LA SEPARAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

CAPACITA’ SEPARATIVA

Separazione elettroforetica di frammenti di DNA

ESEMPIO DI SEPARAZIONE

EVIDENZIAZIONE DELLE BANDE

ELETTROFORESI CAPILLARE Due grossi svantaggi dell’elettroforesi classica sono: convezione di calore dovuta alla resistenza del tampone al flusso di corrente elettrica: crea un gradiente radiale di temperatura che porta all’allargamento dei picchi- difficoltà nella valutazione degli elettroferogrammi. Questi svantaggi sono superati grazie all’avvento della tecnica capillare, derivata da elementi della GC capillare. In questa tecnica, la migrazione degli ioni avviene in un sistema miniaturizzato, un capillare appunto, nel quale il calore di Joule è più facilmente disperso con vantaggi evidenti sulla risoluzione.

PROFILO PIATTO DEL FLUSSO ELETTROOSMOTICO Il profilo piatto del flusso è vantaggioso dal momento che non contribuisce direttamente alla dispersione del soluto (cosa che avverrebbe nel caso di flusso laminare dove le componenti che si trovano al centro del tubo migrano ad una velocità maggiore di quelle che si trovano ai bordi.

Effetto del gradiente di temperatura schema del gradiente di temperatura in un capillare, dal centro all'ambiente esterno. La dissipazione termica del calore attraverso le pareti del capillare può dar luogo a temperature più alte nel centro del capillare piuttosto che alle pareti  Tali gradienti di temperatura causano differenze locali di viscosità nel buffer e quindi una migrazione non uniforme.

Le 4 modalità in cui può essere condotta l’elettroforesi capillare

ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL Separazione per elettroforesi capillare su gel in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS-CGE) di una serie di proteine:OG: colorante Orange-G(rif.) 1)β-lattalbumina(PM 14200 Da 2)Anidrasicarbonica (PM 29000 Da) 3)Ovalbumina(PM 45000) 4)Albumina di siero bovino (PM 66000) 5)FosforilasiB (PM 97400) 6)β-galattosidasi(PM 116000) 7) miosina(PM 205000)

La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC La CEC è una tecnica ibrida derivante dalla combinazione fra CE e HPLC. Rispetto alla tipica CZE il capillare è impaccato con una fase stazionaria tipica per l’HPLC in fase inversa (C18, C8): La presenza di gruppi silanolici sulla superficie delle particelle di impaccamentosi traduce in un forte incremento del flusso elettroosmotico, rispetto all’elettroforesi capillare convenzionale. Poiché il flusso elettroosmotico ha un profilo piatto, non parabolico, l’allargamento di banda è decisamente inferiore rispetto all’HPLC e quindi l’efficienza molto superiore, anche se inferiore rispetto alla CZE.

RIVELAZIONE OTTICA La configurazione tipica prevede la presenza di un’apertura nel rivestimento di poliimmide (non trasparente alla radiazione UV) posto intorno al capillare di silice, attraverso la quale passa il fascio della radiazione incidente che attraverso perpendicolarmente il flusso di analita e raggiunge poi il rivelatore. Il fascio della radiazione deve essere estremamente focalizzato, data l’esiguità dell’ampiezza di banda. Il rivelatore può essere un singolo fototubo fotomoltiplicatore o un DAD (DiodeArrayDetector).

PULSED FLOW ELETTROPHORESIS While in general small fragments can find their way through the gel matrix more easily than large DNA fragments, a threshold length exists above 30–50 kb where all large fragments will run at the same rate, and appear in a gel as a single large diffuse band. However, with periodic changing of field direction, the various lengths of DNA react to the change at differing rates. That is, larger pieces of DNA will be slower to realign their charge when field direction is changed, while smaller pieces will be quicker. Over the course of time with the consistent changing of directions, each band will begin to separate more and more even at very large lengths. Thus separation of very large DNA pieces using PFGE is made possible

MICROFLUIDIC