organi – tessuti (tessuto sostegno, connettivo, cellule funzionali)  liquidi interstiziali e liquidi biologici: siero (plasma)  liquor cefalorachidiano, liquido sinoviale, saliva  liquido amniotico Frazionamento cellulare basilare per lo studio di proteine cellulari in organi e tessuti specifici o in linee cellulari: si devono ottenere frazioni definite ”di arricchimento” di particolari componenti cellulari, es. frazione citoplasmatica o solubile; frazione di membrane plasmatiche; frazione microsomiale; frazione mitocondriale; nuclei Frazionamento cellulare basilare per lo studio di proteine cellulari in organi e tessuti specifici o in linee cellulari: si devono ottenere frazioni definite ”di arricchimento” di particolari componenti cellulari, es. frazione citoplasmatica o solubile; frazione di membrane plasmatiche; frazione microsomiale; frazione mitocondriale; nuclei COLTURE CELLULARI : linee cellulari, cloni cellulari, etc. legate alla membrana plasmatica proteine intracellulari PROTEINE EXTRACELLULARI: Laboratorio di Biochimica PROTEINE CELLULARI: muscolo scheletrico: miociti, fibrocellule muscolo cardiaco: cardiomiociti encefalo: neuroni, astrociti, glia fegato: epatociti rene: unità funzionale nefrone sangue: eritrociti, piastrine, granulociti, linfomonociti Le tecniche separative che si possono utilizzare si diversificano in relazione al tipo di tessuto/cellula e al grado di purezza della/e frazione/i subcellulare/i ritenuto necessario Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari PROBITO ITS aa

Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari Lo studio di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.) si effettua in frazioni subcellulari, quelle dove le proteine di nostro interesse sono maggiormente espresse. Il frazionamento può anche servire per vedere il profilo di distribuzione di una o più proteine nella cellula; come fase iniziale di preparazione alla purificazione di una o più proteine, a partire da un omogenato grezzo. Lo studio di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.) si effettua in frazioni subcellulari, quelle dove le proteine di nostro interesse sono maggiormente espresse. Il frazionamento può anche servire per vedere il profilo di distribuzione di una o più proteine nella cellula; come fase iniziale di preparazione alla purificazione di una o più proteine, a partire da un omogenato grezzo. Le cellule eucariotiche (es. quelle animali) sono organizzate in modo complesso: compartimenti, organelli, strutture subcellulari, dove le proteine sono variamente distribuite.

1) Fase di omogeneizzazione: disorganizzazione del tessuto e rottura di cellule OMOGENATO 2) Fase di separazione: reintroduce un ordine di nuovo tipo raggruppando le componenti cellulari contenute nell’omogenato in base a uguali caratteristiche e proprietà di tipo fisico quali dimensioni, densità CENTRIFUGAZIONE (differenziale, zonale, isopicnica) CENTRIFUGAZIONE (differenziale, zonale, isopicnica) Eterogeneità del tessuto mezzo, soluzione; metodo di omogeneizzazione Procedure che devono essere eseguite al fine di ottenere la massima resa possibile; in particolare l’omogeneizzazione, deve essere adattata alla eterogeneità dei diversi organi e tessuti: cellule che differiscono per dimensioni, densità e fragilità Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

L’omogeneizzazione avviene in tampone solitamente ipotonico e a pH fisiologico; il tampone ipotonico facilita la rottura delle cellule; si cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro non troppo drastiche, non deve essere alterata la struttura delle proteine che vogliamo studiare L’omogeneizzazione avviene in tampone solitamente ipotonico e a pH fisiologico; il tampone ipotonico facilita la rottura delle cellule; si cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro non troppo drastiche, non deve essere alterata la struttura delle proteine che vogliamo studiare Shock osmotico (eritrociti); Cicli di congelamento/scongelamento; Digestione enzimatica con diverse proteasi; Metodi meccanici: -Omogenizzatori con lama: frullatore, ultra-turrax -Potter-Dounce manuale, Potter-Elvejham elettrico; rompono le cellule forzandone il passaggio nello spazio ristretto tra pestello e parete -Ultrasuoni: sonicazione con onde sonore ad alta frequenza; -French press (per omogenati di colture batteriche) Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari METODI DI ROTTURA DELLE CELLULE

Condizioni opportune per l’omogeneizzazione di tessuti e cellule: Se vogliamo per studiare la funzione di una o più proteine, dobbiamo ottenere, alla fine della procedura, una buona resa di questa proteina. Per ogni tessuto, organo, frazione cellulare e proteine in studio, esistono procedure e protocolli adattati e variabili al fine di ottenere risultati il più possibile ottimizzati. Condizioni opportune per l’omogeneizzazione di tessuti e cellule: Se vogliamo per studiare la funzione di una o più proteine, dobbiamo ottenere, alla fine della procedura, una buona resa di questa proteina. Per ogni tessuto, organo, frazione cellulare e proteine in studio, esistono procedure e protocolli adattati e variabili al fine di ottenere risultati il più possibile ottimizzati. Temperatura – si opera in ghiaccio, a circa 4°C, e si usano inibitori di proteasi. A basse temperature si bloccano le attività enzimatiche proteolitiche e digestive che si trovano nei lisosomi e nei perossisomi e che si possono liberare durante la lisi. Composizione salina – ipotonica, per rompere le membrane. pH fisiologico (7.4) – uso di tamponi e di detergenti, per solubilizzare proteine. I tamponi ( acido o base debole + loro sale ottenuto da base e acido forte ) contrastano gli spostamenti del pH dal valore fisiologico in seguito all’aggiunta di acidi o di basi. Es. Tampone fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH. Concentrazioni mM vs ≈ NaCl 120 mM, concentrazione salina isotonica. Temperatura – si opera in ghiaccio, a circa 4°C, e si usano inibitori di proteasi. A basse temperature si bloccano le attività enzimatiche proteolitiche e digestive che si trovano nei lisosomi e nei perossisomi e che si possono liberare durante la lisi. Composizione salina – ipotonica, per rompere le membrane. pH fisiologico (7.4) – uso di tamponi e di detergenti, per solubilizzare proteine. I tamponi ( acido o base debole + loro sale ottenuto da base e acido forte ) contrastano gli spostamenti del pH dal valore fisiologico in seguito all’aggiunta di acidi o di basi. Es. Tampone fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH. Concentrazioni mM vs ≈ NaCl 120 mM, concentrazione salina isotonica. possono provocare denaturazione delle proteine: calore, pH estremi, solventi organici, detergenti possono provocare denaturazione delle proteine: calore, pH estremi, solventi organici, detergenti Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

Velocità di sedimentazione di particelle in soluzione per centrifugazione Tra le numerose applicazioni della centrifugazione – analitica o preparativa - vi è la separazione di particelle (cellule, organelli, frazioni sub-cellulari, macromolecole) -V, velocità di sedimentazione incrementa proporz. al quadrato del raggio della particella -V, aumenta proporzionalmente alla differenza tra densità particella e densità del mezzo -V, incrementa con l’incremento del campo di centrifugazione -V, diminuisce all’aumentare della viscosità del mezzo e del rapporto di attrito Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari rp2rp2 2r2r f/f 0 

Organello Diametro (nm) Densità (g/cm 3 ) nucleo mitocondrio lisosoma ribosoma Centrifugazione differenziale, zonale e isopicnica Frazionamento subcellulare e centrifugazione Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

Centrifugazione differenziale OMOGENATO 600 g 10 min 25,000 g 10 min PELLET 1 Nuclei PELLET 2 Mitocondri Cloroplasti Lisosomi Perossisomi PELLET 3 Microsomi Poliribosomi Frammenti di membrane PELLET 3 Ribosomi Virus Grandi Ma- cromolecole 100,000 g 60 min 300,000 g 120 min SOVRANATANTE 1 SOVRANATANTE 2 SOVRANATANTE 3 CITOSOL Centrifugando un omogenato cellulare per tempi relativamente brevi e a velocità modeste sarà possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei. Gli altri organelli, che hanno densità e/o dimensioni minori, rimarranno nel surnatante. Il surnatante può essere ulteriormente processato per ottenere altri tipi di particelle. centrifugazioni ripetute: con una serie di centrifugazioni opportune si possono ottenere le principali frazioni sub-cellulari; con le metodiche in gradiente di densità le frazioni possono essere ottenute con un solo passaggio.  p –  m > 0 Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari è la tecnica più usata per il frazionamento cellulare:

Centrifugazione: relazione tra RCF (g) e RPM Equazione di conversione Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

Rotori ad angolo fisso Rotori swing-out – a braccio oscillante Tipi di centrifughe:, a)piccole centrifughe da banco e microcentrifughe; b)centrifughe refrigerate a grande capacità; c)centrifughe refrigerate ad alta velocità; d)centrifughe a flusso continuo; e)ultracentrifughe ( analitiche e preparative ) Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

Esercitazione - Tessuto muscolare 1 gr di tessuto – omogeneizzazione in tampone fosfato 100 mM pH 7,4 (1:10 p:vol), in ghiaccio Surnatante Pellet Centrifugazione differenziale a 10,000 g a 4°C FRAZIONE “SOLUBILE” (microsomi, particelle e organelli più leggeri, proteine del citoplasma, enzimi, citosol) Ultraturrax Dosaggio delle proteine totali ottenute: metodo del biureto Frazionamento cellulare – studio delle proteine cellulari

Laboratorio di Biochimica Dosaggio quantitativo delle proteine PROBITO ITS aa Necessario per conoscere quante proteine sono presenti in un determinato preparato biologico Es. per calcolare l’attività specifica durante i saggi funzionali (determinazione della velcità enzimatica) Es. per calcolare la densità specifica di un recettore (nei saggi di legame “binding” dei recettori proteici) Come indice di purezza/resa della proteina studiata durante le fasi progressive di purificazione Prima di una separazione cromatografica o elettroforetica (SDS-PAGE, Western blot) prima di procedere verso ulteriori analisi relative ad 1 proteina

MISURA QUANTITATIVA DELLA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE TOTALI IN UN CAMPIONE BIOLOGICO Metodi chimici: - metodo Kjeldahl (N, azoto totale) Metodi spettrofotometrici: -metodo in assorbanza UV a 280 nm ( amminoacidi aromatici ) - metodi colorimetrici: metodo del biureto; metodo di Lowry; metodo BCA (acido bicinconinico); metodo di Bradford; Metodi turbidimetrici: precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi turbidimetrica del precipitato Dosaggio quantitativo delle proteine

Metodo di Kjeldahl L’azoto proteico viene trasformato in gr di proteine mediante un fattore di conversione- per una determinazione particolarmente precisa si fa la precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio per centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva. 1)Digestione: il campione viene portato ad alta temperatura in presenza di H 2 SO 4 concentrato + catalizzatore (es. Cu 2 SO 4 ) + ossidanti (es. permanganato o H 2 O 2 ); tutto l’N organico si trasforma in NH 4 +, ossidazione di C e S a CO 2 e SO 2. 2) Distillazione: (NH 4 ) 2 SO 4 formato + 2NaOH = 2NH 3 ( raccolta x distillazione ) + Na 2 SO 4 + 2H 2 O. 3) Titolazione: NH 3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (es. HCl) a titolo noto. Calcolo del contenuto di N o di proteine in un campione 1 mol HCl = 1 mol NH 3 = 14 gr N Quantità di N nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 Quantità di proteine nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16 se si considera che il contenuto medio di N proteico è 16%. Dosaggio quantitativo delle proteine

Metodi spettrofotometrici - colorimetrici Dosaggio quantitativo delle proteine

I 20 L-amminoacidi che formano le proteine Legame peptidico da: Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico o i gruppi –R di alcuni AA Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico o i gruppi –R di alcuni AA Dosaggio proteine Dosaggio quantitativo delle proteine

Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione Interferenze: assorbimento alla analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, es. sali del tampone, con la formazione dei complessi colorati (metodi colorimetrici) Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno ( metodo relativo, metodo assoluto ); importante, specie durante purificazione Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione Interferenze: assorbimento alla analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, es. sali del tampone, con la formazione dei complessi colorati (metodi colorimetrici) Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno ( metodo relativo, metodo assoluto ); importante, specie durante purificazione Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati Parametri che caratterizzano i diversi metodi di dosaggio delle proteine Dosaggio quantitativo delle proteine

Caratteristiche: Sensibilità: mg Integrità del campione: sì Stabilità: sì Interferenza: con basi azotate, acidi nucleici (correzione a 260 e 280 nm) Metodo relativo: può variare in base al tipo di proteine presenti Dosaggio quantitativo delle proteine Assorbanza in UV delle proteine Proprietà spettroscopiche degli aminoacidi aromatici Assorbanza a 280 nm e a 260 nm Se le proteine sono contaminate con acidi nucleici che assorbono a 260 con estensione anche a 280, si può applicare la seguente formula che corregge ragionevolmente bene il contenuto in acidi nucleici: proteina (mg/ml) = 1,55 A 280 – 0.76 A 260

Reattivo di Benedict: solfato di rame, CuSO 4 in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K + o Na + Reattivo di Benedict: solfato di rame, CuSO 4 in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K + o Na + “capostipite” di altre tecniche colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del BCA “capostipite” di altre tecniche colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del BCA Dosaggio quantitativo delle proteine Metodi colorimetrici Metodo del biureto Il metodo fu sviluppato a seguito dell’osservazione che il biureto reagisce con una soluzione alcalina di CuSO 4, per dare un complesso color porpora lo ione Cu 2+ forma un complesso di coordinazione con 4 gruppi nucleofilici –NH che nella reazione con le proteine sono dati dai legami peptidici tra gli aminoacidi; il complesso ha due picchi di assorbimento a 330 nm e a 545 nm; composti che contengono due dei gruppi qui sotto riportati legati attraverso un atomo di carbonio o di azoto producono una reazione simile e quindi interferiscono: - CONH 2 -CH 2 NH 2 - C(NH)NH 2 - CSNH 2 Caratteristiche: Sensibilità: scarsa Integrità del campione: no Metodo assoluto: più costante di UV

Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (tirosina), ossidati dal reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin. Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (tirosina), ossidati dal reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin. Dosaggio quantitativo delle proteine Metodi colorimetrici Metodo di Lowry reattivo di Folin-Ciocalteau per la rivelazione dei gruppi fenolici a pH alcalino - tirosine nelle proteine ; incorporazione di ioni Cu 2+ ( sensibilità ); si forma un complesso rame-proteine che causa la riduzione degli acidi fosfotunghistico e fasfomolibdico, gli ingrdienti principali del reattivo di F-C, a tungsteno blu e molibdeno blu; ampio picco di assorbimento, nm; ( assorbanza usualmente misurata a 600 nm o 700 nm ). Caratteristiche: Sensibilità: > del biureto ( 10  g -1 mg ) Specificità: maggiore rispetto al biureto e UV Integrità del campione: no Stabilità e tempistica: stabile entro limiti di tempo; lettura dopo 30 minuti Metodo relativo

Interferenze con detergenti Residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina Residui di arginina, triptofano, tirosina, istidina e fenilalanina Dosaggio quantitativo delle proteine Metodi colorimetrici Metodo di Bradford Il legame del colorante Comassie Brillant Blue G- 250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976); Caratteristiche: Sensibilità: comparabile al Lowry Specificità: maggiore rispetto al biureto e UV Integrità del campione: no Stabilità e tempistica: più stabile degli altri; nessuna incubazione Metodo relativo Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals; Il metodo è un semplice procedimento cosituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto al campione e si determina l’assorbanza a 595 nm.

Abs, 545 nm X= mg proteine campione incognito A inc mg BSA retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg 330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1 – 1 mg retta di calibrazione – due analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg 330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1 – 1 mg Retta a 545 nm Abs, 330 nm Retta a 330 nm Esercitazione – Metodo del biureto Dosaggio quantitativo delle proteine