LA MITILICULTURA DELL’AREA MARINO COSTIERA NORD-GARGANO. BIOTOSSINE ALGALI E MOLLUSCHI BIVALVI VIVI:TRA RISCHIO SANITARIO E PREVENZIONE Biotossine algali: NORMATIVA e LEGISLAZIONE A. Di Taranto

Il rischio di intossicazione da biotossine algali è principalmente legato al consumo di molluschi bivalvi filtratori (soprattutto Mytilus edulis e Mytilus galloprovincialis), che possono accumulare tali sostanze a seguito del proliferare nell’acqua di particolari generi di alghe unicellulari tossiche (fitoplancton). DEFINIZIONE DEL PROBLEMA Mytilus edulisMytilus galloprovincialis Attualmente tale problema sta assumendo dimensioni preoccupanti per l’aumento del numero di alghe tossiche, dovuto da un lato all’eutrofizzazione delle aree marine costiere e dall’altro alla progressiva diffusione di fitoplancton in nuove aree geografiche attraverso, ad esempio, l’acqua di zavorra trasportata dalle navi da carico. Tale fenomeno è pertanto in continua evoluzione.

Le biotossine algali sono suddivise in base alle caratteristiche di solubilità in: A.Idrosolubili B.Liposolubili CLASSIFICAZIONE E CARATTERISTICHE

1.PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP): responsabile di tale avvelenamento è la saxitossina. Diffusa in tutto il mondo, particolarmente presente in Alaska e nella Terra del Fuoco, dove è associata a vistose fioriture algali che danno il nome alla cosiddetta marea rossa (RED TIDE). In Europa i paesi sul versante atlantico sono esposti al rischio PSP. Nelle acque costiere italiane tale biotossina è rara, pur essendo stati segnalati casi di presenza in mitili. A. Biotossine idrosolubili Red tide 2.AMNESIC SHELLFISH POISONING (ASP): responsabile di tale avvelenamento è l’acido domoico e i suoi isomeri. Riconosciuta per la prima volta come causa di avvelenamento in Canada nel E’ presente nelle acque costiere del Nord Europa. Nel Mar Mediterraneo non è mai stata segnalata presenza di ASP.

1.DIARRETHIC SHELLFISH POISONING (DSP): appartengono a questa categoria l’acido okadaico (OA) e suoi derivati chiamati dinophysitossine (DTXs), composti polieterici liposolubili. Diffusione cosmopolita, episodi di intossicazione sono stati segnalati anche in Italia. 2.YESSOTOSSINE (YTXs): composti liposolubili ad azione tossica nel topo. A tutt’oggi non sono segnalati casi di intossicazione umana. Presenti nel Mar Adriatico. 3.PECTENOTOSSINE (PTXs): composti liposolubili, ad azione tossica nel topo. Segnalati casi in Italia. 4.AZASPIRACID (AZP): composto liposolubile. Presente nelle aree costiere del Nord Europa. B. Biotossine liposolubili

PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP): fenomeni di tipo paralitici, esordio dopo 1 o 2 ore dall’ingestione, con formicolio e bruciore delle labbra, senso di pesantezza degli arti, astenia, atassia, episodi di nausea e vomito fino all’exitus (casi più gravi), che si verifica in un lasso di tempo di 3-12 ore per paralisi respiratoria. AMNESIC SHELLFISH POISONING (ASP): nausea, anoressia, vomito, crampi addominali, diarrea e perdita di memoria DIARRETHIC SHELLFISH POISONING (DSP): sintomi prevalentemente di carattere enterico: diarrea, dolori addominali, vomito. Incubazione da 30 minuti a 7 ore AZASPIRACID (AZP): sintomi enterici nell’uomo SINTOMI

E’ basata sui dati anamnestici e sul tipo di sintomi in atto. Il breve periodo di incubazione permette di risalire all’alimento causa dell’infezione. DIAGNOSI

MATRICI ALIMENTARI CONTAMINATE I molluschi bivalvi, in quanto organismi filtratori, sono gli alimenti più a rischio, quando provenienti da acque con fioriture algali in atto. A livello nazionale, il monitoraggio di tutte le aree di raccolta delle coste italiane, eseguito dal Servizio Veterinario Pubblico, consente di prevenire questo rischio.

PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP): 800 µg/kg AMNESIC SHELLFISH POISONING (ASP): 20 mg/kg DIARRETHIC SHELLFISH POISONING (DSP): 160 µg/kg YESSOTOSSINE (YTXs): 1 mg/kg AZASPIRACID (AZP): 160 µg/kg LIMITI TOLLERABILI

Consumare molluschi bivalvi (crudi o cotti), provenienti da aree non controllate per la presenza di biotossine algali. COMPORTAMENTI A RISCHIO

Consumare molluschi bivalvi (crudi o cotti), provenienti da aree non controllate per la presenza di biotossine algali. COMPORTAMENTI A RISCHIO Le biotossine sono composti termostabili e pertanto la cottura dei molluschi non riduce il rischio di avvelenamento. L’unico atteggiamento protettivo è consumare molluschi bivalvi (crudi o cotti), di origine certa: controllare l’etichettatura.

1.D.M. 01/09/ D.M. 6 maggio Regolamento CE n°853/ Regolamento CE n°2074/ Regolamento UE 15/2011 della Commissione Europea NORMATIVE DI RIFERIMENTO

Metodi di ricerca biotossine: DIARRETHIC SHELLFISH POISONING (DSP): METODO YASUMOTO: estrazione dall’epato-pancreas (20g) con acetone, successiva purificazione con etere ed inoculazione intraperitoneale dell’estratto (1cc) in topini adulti dal peso di 18-21gr. PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP): METODO A.O.A.C.: basato sull’estrazione a caldo in ambiente acido (pH=3 circa) e successiva inoculazione intraperitoneale in topi adulti dal peso di 18-21gr. 1. D.M. 01/09/1990

I tre topi vengono pesati e si identificano tracciando dei segnetti con pennarello sulla coda. Si esegue l’inoculazione nel peritoneo di 1 cc di estratto e si registra il tempo dal momento dell’inoculo. Gli animali sono tenuti in osservazione (tramite telecamera) per 24 ore: La morte di 2 dei 3 topi inoculati (entro le 24 ore) indica la presenza di tossine a livelli superiori ai limiti tollerabili dalla legge. La morte di 1 dei 3 topi inoculati (entro le 24 ore) indica l’assenza di tossine o la loro presenza a livelli inferiori ai limiti tollerabili dalla legge. D.M. 01/09/ Metodo Yasumoto Il test è considerato POSITIVO e i molluschi NON sono idonei al consumo umano. Il test è considerato NEGATIVO.

Si inocula nel peritoneo di ciascun topo 1 ml di estratto. Si annota con un cronometro l’ora, i minuti e i secondi in cui è avvenuta l’inoculazione. Gli animali sono tenuti in osservazione 1 ora: Se durante questo intervallo di tempo si ha la morte degli animali si annota il tempo di morte indicato dall’ultimo respiro. Se la morte avviene nei 60’ si risale alla concentrazione della tossina in base ai tempi di morte degli animali inoculati. Se tutti i topi inoculati sopravvivono oltre i 60’ la prova è da considerarsi negativa, in quanto la concentrazione della tossina è non determinabile (N.D.). D.M. 01/09/ Metodo A.O.A.C.

Stabilisce il tenore massimo di biotossine algali. Il tenore massimo complessivo di acido okadaico e dinophysitossine (DIARRETHIC SHELLFISH POISONING) e PECTENOTOSSINE (PTXs) è 160 µg di equivalente acido okadaico/kg. Il tenore massimo di YESSOTOSSINE (YTXs) è 1 mg di equivalente yessotossine/kg. Il tenore massimo di AZASPIRACID (AZP) è 160 µg di equivalente azaspiracido/kg. Il tenore massimo di AMNESIC SHELLFISH POISONING (ASP) è 20 mg/kg di acido domoico secondo il metodo HPLC. 2. D.M. 6 maggio 2002

Procedura analisi: 1.Estrazione su 100 gr di corpo intero del mollusco non sull’epato-pancreas. 2.Si tratta il materiale con acetone e si riestrae con metanolo. 3.Purificazione con etere. 4.Si fa evaporare tutto l’etere, facendo molta attenzione a questa fase, e si porta a volume aggiungendo 4 ml di TWEEN al 60%. 5.Si inoculano 3 topi di peso gr e si osservano per 24 ore. 2. D.M. 6 maggio 2002

Esito analisi: In caso di morte dei topi il test può essere completato (2° step) mediante fasi di separazione liquido/liquido con acetato d’etile/acqua o diclorometano/acqua: presenza di ac. Okadaico (AO), dinophysitossine, PTXs, AZP è evidenziata nella fase di diclorometano; per l’acido okadaico si esegue l’inoculazione dei topi con la solita procedura e si osservano per 24 ore presenza di YTZs è evidenziata nella fase metanolo 60%; dopo estrazione con metanolo si inoculano 3 topi e si osservano per 6 ore: Morte topi entro le 5 ore: test positivo Sopravvivenza di almeno 2 topi oltre le 5 ore indica assenza di tossina: test negativo Sopravvivenza di 2 topi oltre le 5 ore con morte del terzo prima delle 3 ore dall’inoculo: test da ripetere Si determina la mediana dei 6 tempi di sopravvivenza e se questa è inferiore alle 5 ore: test positivo In tutti i casi di test biologico positivo i molluschi non sono idonei al consumo umano 2. D.M. 6 maggio 2002

3. Regolamento CE n°853/2004 PARALYTIC SHELLFISH POISONING (PSP): 800 µg/kg AMNESIC SHELLFISH POISONING (ASP): 20 mg/kg Acido okadaico e dinophysitossine (DIARRETHIC SHELLFISH POISONING) e PECTENOTOSSINE (PTXs) è 160 µg di equivalente acido okadaico/kg 160 µg/kg YESSOTOSSINE (YTXs): 1 mg/kg di equivalente yessotossine/kg AZASPIRACID (AZP): 160 µg/kg di equivalente azaspiracidi/kg

4. Regolamento CE n° 2074/2005 Tossine PSP (PARALYTIC SHELLFISH POISONING): il tenore di tossine (corpo intero) deve essere determinato con il metodo biologico che può essere associato, se necessario, ad un metodo chimico per la rilevazione della saxitossina per la quale è disponibile uno standard. In caso di contestazione dei risultati, il metodo di riferimento è quello biologico. Tossine ASP (AMNESIC SHELLFISH POISONING): il tenore di tossine (corpo intero) deve essere determinato con il metodo della CROMOTOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESTAZIONE (HPLC). In caso di contestazione, il metodo di riferimento è il metodo HPLC.

4. Regolamento (CE) n° 2074/2005 Tossine DIARRETHIC SHELLFISH POISONING (DSP): oltre i metodi biologici nel regolamento si parla di metodi alternativi: Cromatografia liquida ad alto rendimento (HPLC) con determinazione fluorimetrica Cromatografia liquida (LC) Spettrofotometria di massa (MS) Immunosaggi e test funzionali (test di inibizione della fosfatasi) I metodi biologici sono sostituiti da metodi alternativi non appena i materiali di riferimento per la determinazione delle tossine saranno disponibili ed i metodi convalidati. Prima di utilizzare i test chimici dovranno essere disponibili degli standard. La tossicità complessiva è calcolata valendosi di fattori di conversione basati sui dati di tossicità disponibili per ciascuna tossina.

4. Regolamento (CE) n° 2074/2005 Per consentire agli Stati membri di adeguare i propri metodi al metodo chimico è ancora consentito l’uso dei metodi biologici per un periodo di tempo limitato, al termine del quale detti termini non vanno più utilizzati.

5. Regolamento UE 15/2011 della Commissione Europea Il regolamento prevede, in particolare, l’impiego del metodo di cromatografia liquida (LC)-spettrometria di massa (MS) da applicarsi a partire dal 1° luglio 2011 come metodo di riferimento per la rilevazione della biotossine marine. Il regolamento prevede la possibilità, per gli Stati Membri, di utilizzare fino al 31 dicembre 2014 il test biologico sui topini. In alcuni casi è necessario che la positività riscontrata con il metodo «mouse test» sia oggetto di conferma mediante metodo chimico. Dopo questo tempo, il metodo biologico sui topi è utilizzato solo nel corso del monitoraggio periodico delle zone di produzione e stabulazione volto alla rilevazione di tossine marine nuove o sconosciute sulla base di programma di controllo nazionale elaborati dagli Stati Membri.

5. Regolamento UE 15/2011 della Commissione Europea In particolare:  IN FASE DI PRODUZIONE PRIMARIA: L’Autorità Competente (AC), in caso di positività del mouse test, può effettuare un nuovo campionamento, volto alla conferma con metodo chimico, se richiesto dall’OSA, in caso di contenzioso o qualora indicato espressamente dalla regione. Nel caso di richiesta di conferma con metodo chimico l’AC dovrà sospendere il campionamento per la ricerca di biotossine marine liposolubili fino a quando non riceve l’esito della conferma con metodo chimico.

5. Regolamento UE 15/2011 della Commissione Europea In particolare:  IN FASE DI COMMERCIALIZZAZIONE: l’OSA, titolare del Centro di Spedizione Molluschi (CSM) che ha confezionato il lotto oggetto di prelievo, può richiedere al momento del campionamento la conferma di positività al mouse test con metodo chimico. L’AC che ha prelevato il campione deve acquisire formalmente dal CSM, che ha confezionato il lotto oggetto di campionamento, la volontà o meno di effettuare la conferma col metodo chimico di campioni eventualmente risultati positivi.  NEGLI SCAMBI DI IMPORTAZIONE: I campioni di prodotti oggetto di scambi intercomunitari di importazione, risultati positivi al mouse test, devono essere obbligatoriamente sottoposti a campionamento con metodo chimico.

Procedura:  Si aprono i molluschi fino a raggiungere il peso di 100 gr di corpo intero e si omogenizza il tutto.  Pesare 2 gr +/- 0,05 di omogenato  Aggiungere 9 ml di metanolo al 100%  Vortexare per 3’  Centrifugare a 2000 giri per 10’ a 20°C  Il surnatante è trasferito in un provettone da 20 ml  Aggiungere altri 9 ml di metanolo al 100 %  Vortexare per 3’  Centrifugare a 2000 giri per 10’ a 20°C  Il surnatante è trasferito nel provettone da 20 ml usato precedentemente  Si procede alla determinazione delle biotossine DSP mediante liquido/massa Metodica di estrazione

 Prelevare n°5 aliquote, tutte di almeno 1 Kg di peso  Tutti i prodotti oggetto di indagine devono essere mantenuti alle temperature stabilite dal presente Decreto Modalità di campionamento per l’analisi delle Biotossine DSP e PSP. Reg. UE n°15 del che modifica il Reg. CE

 I campioni possono essere accettati e quindi processati dal laboratorio solo se le matrici sono integre e conservate in modo da preservare l’analita  Le aliquote devono essere contenute in contenitori idonei ed integri  Le aliquote devono essere correttamente identificate e sigillate, in modo da garantire la massima inviolabilità  I campioni, durante il trasporto, non devono essere capovolti  I campioni devono essere congelati e consegnati al laboratorio di analisi entro le 48 ore dal prelievo Modalità di Trasporto dei campioni

Si ringrazia