Allergia alimentare vera: i corretti percorsi diagnostici Riccardo Asero Clinica San Carlo Paderno Dugnano (MI)

CLASSIFICAZIONE E TERMINOLOGIA IN USO IN EUROPA

ALLERGIA ALIMENTARE: PRINCIPI Ogni alimento può contenere diversi allergeni: alcuni specifici, altri omologhi ad allergeni di alimenti diversi e quindi potenzialmente cross-reagenti. Gli allergeni presenti in un certo alimento possono presentare caratteristiche chimico-fisiche diverse. La reazione clinica ad un alimento dipende in buona parte dalle caratteristiche chimico/fisiche dell’allergene rilevante.

1. LE REATTIVITA’ CROCIATE TRA ALIMENTI Sono causate dal co-riconoscimento di epitopi omologhi presenti su proteine di fonti allergeniche DIVERSE, da parte di IgE specifiche. Si verificano perché diverse proteine allergeniche sono altamente conservate dal punto di vista filogenetico. “Cross-reactivity is a function of Ab-accessible epitopes + conserved proteins.”(H. Breiteneder)

Structural Families of Allergens Fagales group 1: PR-10, plant steroid hormone transporter Alpha and Beta protein, mainly antiparallel beta-sheets. Fold: beta-alpha-beta(4)-alpha Bet v 1 Aln g 1 Car b 1 Cas s 1 Cor a 1 Fag s 1 Que a 1 Pollen Birch, alder, hornbeam, chestnut, hazel, beech, oak Fruits, vegetables Pru av 1 Api g 1 Dau c 1 Mal d 1 Pru ar 1 Pyr c 1 Legumes, nuts, seeds Cor a 1.04 Gly m 4 Vig r 1 Ara h 8 Bet v 1 Pru av 1 By kind permission of F. Ferreira, Univ. Salzburg, Austria

2. CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE La resistenza/suscettibilità a calore e digestione degli allergeni è legata a: CARATTERISTICHE DELL’EPITOPO Gli epitopi conformazionali (dipendenti dalla conservata struttura tridimensionale della molecola proteica) sono più sensibili a calore e digestione peptica degli epitopi lineari. STRUTTURA TERZIARIA DELLA PROTEINA I legami S-S stabilizzano fortemente la molecola (es. LTP); Mal d 1 è priva di ponti S-S.

RILEVANZA DELLA STABILITA’ DEGLI ALLERGENI ALLERGENI GASTROLABILI  SOA ALLERGENI TERMOLABILI sintomi solamente se consumati crudi. ALLERGENI GASTRO/TERMORESISTENTI raggiungono l’intestino in forma pressoché immodificata reazioni sistemiche (ma anche SOA!!).

OBIETTIVI DELL’ALLERGOLOGO 1. DIAGNOSI: Identificare la fonte allergenica responsabile della sensibilizzazione Identificare la proteina allergenica responsabile 2. PREVENZIONE: Determinare la potenziale severità di una allergia alimentare Identificare possibili indici prognostici negativi Prevenire reazioni inattese da CROSS-REAZIONI. 3. NON COMPROMETTERE LA QoL: Evitare restrizioni dietetiche immotivate

ELEMENTI NECESSARI PER LA DIAGNOSI DI FOOD ALLERGY Storia clinica suggestiva Identificazione della origine IgE-mediata della reazione mediante: SPT positivo (alimento fresco e/o estratto) e/o presenza di IgE specifiche per alimenti (o componenti molecolari) DBPCFC

STORIA CLINICA La sintomatologia è compatibile? Quanto tempo è trascorso dall’ingestione? E’ stato ingerito un solo alimento o più di uno? L’alimento sospetto era crudo, cotto o altrimenti processato? Si sono verificati fenomeni analoghi in passato? Coesiste allergia respiratoria?

LA DIAGNOSTICA IN-VIVO: SPT

DIAGNOSTICA IN-VITRO: IL DOSAGGIO DELLE IgE SPECIFICHE

Principle of ImmunoCAP™ assay Principle of ImmunoCAP™ assay. A) The allergen is immobilized on the solid phase and the sample is incubated on the solid phase. B) Secondary antibody conjugated with b-galactosidase reacts with the primary antibody. C) A substrate to b-gal is added which results in D) a chemiluminescent signal.  

Estratti Alimenti freschi Molecole Negli ultimi 15 aa sono stati identificati, clonati e sequenziati moltissimi allergeni. Molti sono già disponibili per la diagnostica (CAP & ISAC). In futuro si renderanno disponibili altri allergeni ricombinanti. In uso da > 100 anni con buoni risultati, ma … Contengono molte molecole allergeniche e non allergeniche. La concentrazione di ogni allergene può variare da un lotto all’altro. Alcuni possono essere assenti. Non danno informazioni circa l’allergene responsabile della sensibilizzazione.

ALLERGENI ED EPITOPI RICOMBINANTI NELLA DIAGNOSI DI ALLERGIA ALIMENTARE

PERCHE’ USARE I RICOMBINANTI PER LA DIAGNOSI DI ALLERGIA ALIMENTARE? Perché identificano la reattività ad allergeni potenzialmente cross-reagenti. Perché ogni fonte allergenica può contenere molti allergeni e la potenziale severità della reazione clinica dipende dalle caratteristiche chimico/fisiche dell’allergene. Perché alcuni allergeni si associano a reazioni cliniche particolari (FDEIA, Asma, etc.). ALLERGENI GASTROLABILI  SOA ALLERGENI TERMOLABILI sintomi solamente se consumati crudi. ALLERGENI GATRO/TERMORESISTENTI raggiungono l’intestino in forma pressoché immodificata reazioni sistemiche.

Dau c 1 Will the allergen reach the intestinal tract in unmodified form or is it digested to peptides? Pru p 3

CRD Thousands of allergens described so far 750 ALLERGENS RECORDED IN WHO/IUIS CRD Thousands of allergens described so far Available diagnostic panels are incomplete. We still need extracts & fresh foods ! 112 ALLERGENS AVAILABLE IN ROUTINE

ALLERGENI ALIMENTARI VEGETALI: Classificazione biologica Da: Breiteneder H & Radauer C; JACI 2004 Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003 Teuber SS, et al. Curr Allergy Asthma Rep. 2003 Ferreira F, et al. Allergy 2004. Successivi aggiornamenti

PROFILINE

LTP

PR-10 Vicilin 2S-albumin Legumin LTP Profilin

Qual è il valore aggiunto di ISAC 112? Kiwi Homologous to other PR-10 Pru p 4, Cor a 14 Legumin Manca qualcosa rispetto al CAP ? Low prevalence, performance issues Very similar to Ara h 2, increases sensitivity

Systemic symptoms HEAT-RESISTANCE + - LTP (Pru p 3) Peamaclein (Pru p 7) Profilin (Pru p 4) PR-10 (Pru p 1) + PEPSIN-RESISTANCE - Mild local symptoms (OAS)

APPLE ? HEAT-RESISTANCE Systemic symptoms + - LTP TLP Profilin Mal d 1 PEPSIN-RESISTANCE - Mild local symptoms (OAS)

HAZELNUT (Bet v 1) (Bet v 2) PR-10 (Cor a 1) Profilin (Cor a 2) Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc Pan allergen pollens fruits vegetables PR-10 (Cor a 1) Profilin (Cor a 2) Labile allergens Peach Rosaceae Walnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Cor a 8) Vicilin (Cor a 11) 2-S albumin (Cor a 14) Peanut Walnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Peanut Cashew Walnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Cor a 9) Peanut Cashew Walnut Sesame Soy, Mustard Sesame Peanut

Component-resolved diagnosis possible (Bet v 1) (Bet v 2) HAZELNUT Component-resolved diagnosis possible (Bet v 1) (Bet v 2) Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc Pan allergen pollens fruits vegetables PR-10 (Cor a 1) Profilin (Cor a 2) Labile allergens Peach Rosaceae Walnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Cor a 8) Vicilin (Cor a 11) 2-S albumin (Cor a 14) Peanut Walnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Peanut Cashew Walnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Cor a 9) Routine diagnostic Tool missing !! Peanut Cashew Walnut Sesame Soy, Mustard Sesame Peanut

WALNUT (Bet v 1) (Bet v 2) PR-10 (Jug r ? ) Profilin (Jug r 5) Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc Pan allergen pollens fruits vegetables PR-10 (Jug r ? ) Profilin (Jug r 5) Labile allergens Peach Rosaceae Hazelnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Jug r 3) Vicilin (Jug a 2) 2-S albumin (Jug a 1) Peanut Hazelnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Peanut Cashew Hazelnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Jug r 4) Peanut Cashew Hazelnut Sesame Soy, Mustard Sesame Peanut

WALNUT (Bet v 1) (Bet v 2) PR-10 (Jug r ? ) Profilin (Jug r 5) Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc Pan allergen pollens fruits vegetables PR-10 (Jug r ? ) Profilin (Jug r 5) Labile allergens Peach Rosaceae Hazelnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Jug r 3) Vicilin (Jug a 2) 2-S albumin (Jug a 1) Peanut Hazelnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Peanut Cashew Hazelnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Jug r 4) Peanut Cashew Hazelnut Sesame Soy, Mustard Sesame Peanut CRD missing

PEANUT (Bet v 1) (Bet v 2) PR-10 (Ara h 8) Profilin Labile allergens Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc PR-10 (Ara h 8) Profilin Pan allergen pollens fruits vegetables Labile allergens Peach Rosaceae Walnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Ara h 9) Vicilin (Ara h 1) 2-S albumin (Ara h 2) Hazelnut Walnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Hazelnut Cashew Walnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Ara h 3-4) Hazelnut Cashew Walnut Sesame Soy, Mustard Sesame Hazelnut

PEANUT (Bet v 1) (Bet v 2) PR-10 (Ara h 8) Profilin Labile allergens Rosaceae Apiaceae Tree nuts Etc PR-10 (Ara h 8) Profilin Pan allergen pollens fruits vegetables Labile allergens Peach Rosaceae Walnut Maize etc Stable allergens (Pru p 3) LTP (Ara h 9) Vicilin (Ara h 1) 2-S albumin (Ara h 2) Hazelnut Walnut Sesame Cashew Soy Brazil nut Hazelnut Cashew Walnut Sesame Mustard Castor bean Oleosin Legumin (Ara h 3-4) Hazelnut Cashew Walnut Sesame Soy, Mustard Sesame Hazelnut CRD missing

Kiwi Act c 8 (Bet v 1-like) Act c 9 (profilina) Act c 5 Act c 1 (Actinidin) Act c 3 (40 kDa) Act c 2 (TLP)

ALLERGIA ALLA SOIA NEL BAMBINO Le IgE anti- Gly m 5 e Gly m 6 identificano l’allergia primaria alla soia (frequente nel bambino)(Ito K; JACI 2011) Gly m 4 identifica la reattività crociata con Bet v 1. Gly m 4 è l’unico allergene per il quale siano segnalate reazioni sistemiche nel paziente allergico a betulla.

ALLERGIA AL FRUMENTO

Serine-protease inhibitor Globuline TLP PROTEINE DEL FRUMENTO a-amylase inhibitors (Famiglia con identità di sequenza del 30-95%) (Cross-reattività tra grano, orzo e segale) Albumine Perossidasi Tioredoxina Sale-solubili 15-20% LTP Serine-protease inhibitor Globuline TLP FRAZIONI PROTEICHE a/b Gliadine (monomeriche) g w Sale-insolubili (Prolamine) 80% LMW Glutenine (polimeriche) HMW

Serine-protease inhibitor Globuline TLP Maggiormente associate a sintomi respiratori PROTEINE DEL FRUMENTO a-amylase inhibitors (Famiglia con identità di sequenza del 30-95%) (Cross-reattività tra grano, orzo e segale) Albumine Perossidasi Tioredoxina Sale-solubili 15-20% LTP Serine-protease inhibitor Globuline TLP FRAZIONI PROTEICHE a/b Gliadine g w Sale-insolubili (Prolamine) 80% Glutenine Maggiormente associate ad allergia alimentare

Tri a 14 LTP Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 27 Tiol-reduttasi Tri a Peroxidase Tri a 40 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 30 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 32 Peroxiredoxina Tri a 14 LTP Tri a 12 profilina Tri a 25 Thioredoxin Tri a 29 Inib alfa-amilasi Tri a 39 Inib serin-proteasi Tri a 15 Inib alfa-amilasi Tri a TLP Tri a 18 Agglutinina Hevein-like Tri a 28 Inib alfa-amilasi Tri a 37 Purotionina Tri a 35 deidrina Tri a 20 g-gliadina Tri a 36 LMW Glutenin Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 33 Serpina Tri a 21 a,b-gliadina Tri a 23 Leucine-rich Repeat protein Tri a 26 HMW glutenin Tri a 34 GAPDH Tri a 31 Triosofosfato isomerasi Tri a 10 kDa

Tri a 14 LTP Tri a 19 w-5-gliadina DISPONIBILI PER LA DIAGNOSI Tiol-reduttasi Tri a Peroxidase Tri a 40 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 30 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 32 Peroxiredoxina Tri a 14 LTP Tri a 12 profilina Tri a 25 Thioredoxin Tri a 29 Inib alfa-amilasi Tri a 39 Inib serin-proteasi Tri a 15 Inib alfa-amilasi Tri a TLP Tri a 18 Agglutinina Hevein-like Tri a 28 Inib alfa-amilasi Tri a 37 Purotionina Tri a 35 deidrina Tri a 20 g-gliadina Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 36 LMW Glutenin Tri a 33 Serpina Tri a 21 a,b-gliadina Tri a 23 Leucine-rich Repeat protein Tri a 26 HMW glutenin Tri a 34 GAPDH Tri a 31 Triosofosfato isomerasi Tri a 10 kDa

Baker’s asthma Tri a 14 LTP Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 27 Tiol-reduttasi Tri a 40 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 30 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a Peroxidase Tri a 32 Peroxiredoxina Tri a 14 LTP Tri a 12 profilina Tri a 25 Thioredoxin Tri a 29 Inib alfa-amilasi Tri a 39 Inib serin-proteasi Tri a 15 Inib alfa-amilasi Tri a TLP Tri a 18 Agglutinina Hevein-like Tri a 28 Inib alfa-amilasi Tri a 37 Purotionina Tri a 35 deidrina Tri a 20 g-gliadina Tri a 36 LMW Glutenin Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 33 Serpina Tri a 21 a,b-gliadina Tri a 23 Leucine-rich Repeat protein Tri a 26 HMW glutenin Tri a 34 GAPDH Tri a 31 Triosofosfato isomerasi Tri a 10 kDa

WDEIA Tri a 14 LTP Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 27 Tiol-reduttasi Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 30 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 32 Peroxiredoxina Tri a Peroxidase Tri a 14 LTP Tri a 12 profilina Tri a 25 Thioredoxin Tri a 29 Inib alfa-amilasi Tri a 39 Inib serin-proteasi Tri a 15 Inib alfa-amilasi Tri a TLP Tri a 18 Agglutinina Hevein-like Tri a 28 Inib alfa-amilasi Tri a 37 Purotionina Tri a 35 deidrina Tri a 20 g-gliadina Tri a 36 LMW Glutenin Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 33 Serpina Tri a 21 a,b-gliadina Tri a 23 Leucine-rich Repeat protein Tri a 26 HMW glutenin Tri a 34 GAPDH Tri a 31 Triosofosfato isomerasi Tri a 10 kDa

Orticaria/anafilassi Tri a 27 Tiol-reduttasi Tri a 40 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 30 Inib alfa-amilasi Inib tripsina Tri a 32 Peroxiredoxina Tri a Peroxidase Tri a 14 LTP Tri a 12 profilina Tri a 25 Thioredoxin Tri a 29 Inib alfa-amilasi Tri a 39 Inib serin-proteasi Tri a 15 Inib alfa-amilasi Tri a TLP Tri a 18 Agglutinina Hevein-like Tri a 28 Inib alfa-amilasi Tri a 37 Purotionina Tri a 35 deidrina Tri a 20 g-gliadina Tri a 36 LMW Glutenin Tri a 19 w-5-gliadina Tri a 33 Serpina Tri a 21 a,b-gliadina Tri a 23 Leucine-rich Repeat protein Tri a 26 HMW glutenin Tri a 34 GAPDH Tri a 31 Triosofosfato isomerasi Tri a 10 kDa

ALLERGIA AL FRUMENTO (Makela M. FAAM Venezia 2011) Tri a 19 (omega-5-gliadina) è un marker predittivo di allergia al frumento nell’infanzia Correla con la severità e persistenza dell’allergia e con la compara di asma Marker di FDEIA nell’adulto

DIAGNOSTICA DELLE ALLERGIE AD ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE MEDIANTE RICOMBINANTI

Qual è il valore aggiunto di ISAC 112? Gal d 4 Covered by Gad c 1 Manca qualcosa rispetto al CAP ? Covered by Pen m 1

Asero R et al. Int Arch Allergy Immunol. 2011; 157(1):3-10. 14 20 30 43 94 67 1 2 3 4 5 6 CROSTACEI Reattività IgE molto variabile di alcuni sieri di riferimento

Allergia ad alimenti ANIMALI: utilità della CRD. UOVO OVOMUCOIDE (Gal d 1; 28 kDa): Termo- e gastrostabile, associato con persistenza dell’allergia nel bambino (Jarvinen KM, et al Allergy 2007), reattività all’uovo cotto e sintomi molto severi (Benhamou AH et al. Allergy 2010) OVALBUMINA (Gal d 2; 45 kDa) OVOTRANSF. (Conalbumin;Gal d 3; 78 kDa) LISOZIMA (Gal d 4; 14 kDa) ALFA-LIVETINA (Tuorlo; Gal d 5): albumina sierica di pollo. Parzialmente termolabile. Responsabile di sensibilità per via aerea (Bird-egg syndrome).(Szepfalusi. JACI 1994).

Allergia ad alimenti ANIMALI: utilità della CRD. LATTE Le IgE anti-Caseina (Bos d 8) hanno il miglior valore predittivo nell’identificare l’allergia al latte rispetto alle IgE-a-latte intero, e il rischio di una patologia persistente (Ito K. FAAM Venezia 2011)

Ipersensibilità ad ALFA-GAL, ovvero le sorprese del sistema immunitario

SENSIBILIZZAZIONE AD ALFA-GAL: CRONISTORIA Alta prevalenza IgE-a-alfa-gal nelle prealpi friulane (Villalta D, et al. CEA) Chung CH (N Engl J Med) identifica IgE-a-oligosaccaride su Fab di cetuximab mediante ImmunoCAP Casi di Orticaria/Anafilassi da Cetuximab in AK, TN, e NC (USA) ma non MA o NY. Alla prima infusione!! (O’Neill J Clin Oncol) Riscontro di anafilassi ritardata da carne rossa in soggetti con IgE-a-Alfa-gal (Commins SP, et al. JACI) Identificazione di alfa-gal nell’intestino di Ixodes ricinus (Hamsten C, Allergy) 2006-2007 2008 2009 2011 2013 2015 Riscontro di IgE-a-cetuximab in popolazione generale sana degli USA del sud ma non del nord: le IgE-a-cetuximab sono preesistenti. Identificazione della causa della produzione di IgE-a-alfa-gal (Commins SP, et al. JACI) Primo caso descritto in Italia (Calamari AM et al. Eur Ann ACI) Un pz ha anafilassi 4 h dopo hamburger x 4 volte!! Enorme incremento dei cervi in Virginia

BAT: UN TEST FUNZIONALE

GRAZIE ! Bet v 1 Api g 1 Bet v 2