ELEMENTI DI ANALISI CHIMICA E STRUMENTALE FABIO MURENA

Analisi qualitative e quantitative Indicano se una specie chimica è presente o meno in una matrice ambientale Analisi qualitative Danno anche l’informazione sulla quantità di specie presente (concentrazione) Analisi quantitative

1 2 3 Schema di un metodo di analisi Si misura una proprietà fisica (es. assorbimento o emissione di luce, conducibilità, corrente) o chimica (ossidabilità o riducibilità) Il risultato dell’analisi (RISPOSTA O SEGNALE) dipende dalla NATURA e dalla CONCENTRAZIONE dell’analita 2 Si usa una relazione matematica (calibrazione) per ottenere dalla RISPOSTA la CONCENTRAZIONE dell’analita. 3

Il risultato di un’analisi chimica è un’informazione costituita da: • valore numerico • unità di misura incertezza …. T,P e tempo di mediazione per analisi gas

Precisione Accuratezza Incertezza Incertezza = media / dev standard Variazione intorno alla media di più misure ripetute espressa come deviazione standard Precisione o ripetibilità  Differenza tra media delle misure e valore reale Accuratezza o Esattezza  Incertezza = media / dev standard Per determinare l’accuratezza di un metodo analitico si può ricorrere a: - materiali di riferimento certificati - confronto con altri metodi d’analisi standard - intercalibrazione tra laboratori diversi

Campo o Intervallo di misura Campo di misura  Intervallo tra concentrazioni nominali minima e massima che l’analizzatore può misurare Il campo di misura è delimitato da: Limite di rilevabilità (inferiore) Saturazione o abbassamento della sensibilità (superiore) Il campo di misura NON va da 0 a … ma va da Limite di Rilevabilità a ….

Campo o Intervallo di misura Strumento di misura: righello Campo di misura : da 1 a 140 mm

Altre caratteristiche di un metodo di misura o un analizzatore Capacità di un metodo analitico di non risentire della presenza d’interferenti o d’altri componenti diversi dall'analita in esame. Selettività  Frequenza di analisi/campionamento  Numero di campionamenti / analisi nell’unità di tempo [Hz] Tempi caratteristici …..

Definizione di bianco e standard bianco  campione a concentrazione nulla della specie da analizzare standard  campione a concentrazione nota della specie da analizzare Il bianco va possibilmente realizzato con la stessa matrice del campione da analizzare ma privo dell’analita. Ad esempio: soluzione acquosa soluzione organica terreno delle stesse caratteristiche ……

Limite di rilevabilità Definizione La minima concentrazione di analita che produce un segnale significativamente diverso da quello del bianco ovvero la concentrazione corrispondente al minimo segnale significativo Segnale significativo è un segnale vicino a quello del bianco, ma da esso significativamente differente, e quindi assegnabile con certezza all'analita sulla base di un criterio specifico

Definizione dei limiti inferiori del campo di misura In funzione del criterio scelto per definire il limite di rilevabilità se ne possono valutare diversi MDL  Livello minimo per la rilevabilità (minimum detection limit) della specie RDL  Livello minimo per la valutazione (reliable detection limit) della concentrazione della specie QDL  Livello minimo per la valutazione (quantifiable detection limit) quantitativa della concentrazione della specie con il medesimo livello di incertezza del metodo

Limite di rilevabilità E’ la misura più piccola per la quale si verifica che = media delle misure sia maggiore in maniera statisticamente significativa di = media delle misure di “bianco = dev standard dei campioni di bianco NB Note media e dev standard delle misure di bianco il risultato non è univoco: dipende da: livello di probabilità (t) e da n° di misure del campione t = variabile t-student n1 = misure di bianco n2 = misure del campione

Valutazione del Limite Minimo di Rilevabilità (MDL) da misure di bianco si fanno n1 misure di bianco 2. si calcola la media e la dev standard delle misure di bianco 3. si stabilisce un intervallo di confidenza in corrispondenza del quale si vuole valutare il limite minimo di rilevabilità 4. si calcola il MDL in funzione del numero di analisi che si vuole fare (n2)

Media bianco = 0.33 mg/L Dev. standard bianco = 0.89 mg/L + 0.33 = 3.8 mg/L MDL + 0.33 = 2.1 mg/L MDL

Calcolo di MDL e QDL in genere si assume: MDL  bm + 3 sb QDL  bm + 10 sb Dove: bm = media del bianco dall’esercizio precedente risulta MDL = bm + 2 ÷ 3.9 sb

Definizione dei limiti rilevabilità come multipli di sb si assume come minimum detection limit (MDL) il valore pari a 3sb (c’è un significativo overlap delle due pdf) si assume come Reliable Detection Limit (RDL) = 6sb (l’overlap delle due pdf è limitato) si assume come quantifiable detection limit (QDL) 10sb (non c’è overlap)

TARATURA e CALIBRAZIONE La taratura è una tipologia di caratterizzazione di uno strumento di misura che ha come scopo la definizione delle caratteristiche metrologiche di uno strumento di misura. Questo avviene tramite un confronto di misure con uno strumento di riferimento, definito campione. La calibrazione è l'operazione in cui uno strumento di misura viene regolato in modo da migliorarne l'accuratezza. L'operazione richiede il confronto con delle misure di riferimento prodotte utilizzando uno strumento campione. È necessario evitare di confondere la taratura con la calibrazione: mentre la taratura è un'operazione che permette di definire tutte le caratteristiche metrologiche di uno strumento, la calibrazione ha come obiettivo di rendere lo strumento più accurato (avvicinare la misura al valore reale).

TARATURA: caratteristiche metrologiche Le caratteristiche metrologiche sono tutte quelle caratteristiche proprie di un sistema di misura che: definiscono i limiti entro i quali è possibile fare una misura; concorrono nella definizione della precisione strumentale. Al primo gruppo si possono ascrivere ad esempio: il campo di misura, la temperatura di funzionamento, la risposta caratteristica … Al secondo gruppo appartengono tutte quelle caratteristiche che possono contribuire nella definizione dell'incertezza di misura del sistema e dunque, in generale, la sua precisione; esempio: l'accuratezza; la ripetibilità; la linearità; l'isteresi; la stabilità; la risoluzione.

Taratura per sostituzione METODOLOGIE di TARATURA Taratura per confronto In questa metodologia, al tarando è fatta misurare la medesima grandezza che si fa misurare al campione. La precisione del tarando è desunta dal confronto dei due risultati di misura. Esempio: Un manometro può essere tarato collegandolo ad un circuito idraulico dove è stato installato anche un manometro "campione". In questo caso la medesima grandezza, la pressione, è misurata dai due strumenti, e l'analisi delle differenze dei due rilievi permette di valutare la precisione del tarando. Taratura per sostituzione In questa metodologia di taratura, lo strumento campione è o genera direttamente la grandezza che si fa misurare al tarando. La precisione del tarando è desunta dal confronto tra il valore nominale della grandezza generata e i risultati di misura del tarando. Esempio: Una bilancia può essere tarata effettuando delle misure su dei pesi "campione". In questo caso il campione stesso genera una grandezza di valore nominale, il peso, e la valutazione della precisione del tarando scaturisce dall'analisi della differenza tra la lettura sulla bilancia e il peso nominale del campione.

TECNICHE DI CALIBRAZIONE standard esterno standard interno o aggiunto

standard esterno Soluzioni/miscele che contengono quantità note e differenti di analita. Vengono analizzati separatamente dal campione Vengono utilizzati per costruire le curve di calibrazione che si ottengono riportando in grafico la grandezza misurata (segnale strumentale) per una serie di soluzioni di standard a concentrazione nota. Può essere utilizzato quando: i componenti della matrice del campione non causano interferenza si conosce la composizione della matrice (si possono preparare le soluzioni standard in matrici simili a quelle da analizzare)

Tecnica dello standard esterno CALIBRAZIONE Tecnica dello standard esterno 1 Si crea un diagramma “risposta strumento vs concentrazione” attraverso una serie di analisi di miscele standard (a concentrazione nota) 2 La relazione viene espressa mediante un’equazione in molti casi lineare y=a+bx

Tecnica dello standard esterno CALIBRAZIONE Tecnica dello standard esterno NO! estrapolazione 3 Mediante un’analisi di regressione (minimizzazione degli scarti quadratici) si calcolano i parametri a (intercetta) e b (pendenza) se la relazione è lineare 4 Ottenuta la curva di calibrazione si fa un’analisi e si determina la concentrazione incognita dalla equazione della curva di calibrazione Segnale letto C misurata

ESEMPIO : Costruzione di una curva di calibrazione Analizzare soluzioni di benzene con concentrazioni attese di 100-200 ppm Si preparano e analizzano 6 soluzioni standard di benzene con concentrazione da 40 a 300 ppm C (ppm) Risposta (mA s) 40 0,5 60 1 100 1,9 160 2,4 210 3,1 300 5,1 Retta di calibrazione

ESEMPIO : Utilizzo di una curva di calibrazione Si analizza una soluzione di cui si vuole valutare la concentrazione di Benzene Il risultato dell’analisi è 1,9 (mAs) Dalla equazione della retta di calibrazione C (ppm) Risp (mA s) 40 0,5 60 1 100 1,9 160 2,4 210 3,1 300 5,1 N.B non abbiamo usato il dato sperimentale a 1.9 mAs

CALIBRAZIONE – tecnica dello standard interno Si sceglie una sostanza (standard interno) che verrà aggiunta in quantità nota ai campioni da analizzare Si effettuano delle misure di campioni in cui sono presenti in quantità nota sia lo standard interno che i composti che vogliamo analizzare Si ottengono delle curve di calibrazione sia dei composti da analizzare che dello standard interno Composti da analizzare segnale Standard interno Composto da analizzare Concentrazione

CALIBRAZIONE – tecnica dello standard interno Note le rette di calibrazione si possono definire dei fattori di risposta sia dei composti da analizzare che dello standard interno F = fattore di risposta, S= segnale s = standard interno, i = composto da analizzare Rapportando le due espressioni si ottiene Si può definire un fattore di risposta relativo tra standard e composto i

CALIBRAZIONE - standard interno Noto il fattore di risposta relativo Fsi si analizza il campione incognito nel quale si è aggiunta una quantità nota di standard esterno si conoscono quindi Cs, Si e Ss e si riutilizza la formula precedente per calcolare la concentrazione Ci In quanto tutti gli altri termini sono noti

CALIBRAZIONE – tecnica dello standard interno Caratteristiche dello standard interno: dal punto di vista chimico deve essere sufficientemente diverso dall’analita (o analiti), in modo da poter essere determinato, nel medesimo esperimento, senza interferire nella misura dell’analita (o analiti): Vantaggi standard interno vs standard esterno: Il risultato analitico non è affetto da eventuali variazioni che possono verificarsi tra l’analisi effettuata su standard e analisi su campione in quanto sono analizzati insieme Svantaggi standard interno vs standard esterno: Maggiore manipolazione dei campioni da analizzare Contaminazione dei campioni da analizzare

Curve di calibrazioni non lineari Non sempre la migliore curva di calibrazione è una retta. In questo caso i dati sono fittati meglio da una relazione quadratica

La risposta è meno buona Sensibilità La risposta è meno buona Se la curva di calibrazione non è una retta la risposta dello strumento cambia nel campo di misure effettuato

SENSIBILITA’ media sensibilità nulla SENSIBILITÀ definizione: la pendenza della curva di calibrazione in corrispondenza della concentrazione a cui si sta lavorando. alta Se la curva di calibrazione è una retta La sensibilità è costante in tutto il campo di analisi

CALIBRAZIONE SPAN Misura di controllo molto frequente fatta su un campione standard con concentrazionedell’analita pari a 80-90% del limite superiore di analisi Si effettua in genere all’inizio e alla fine di una serie di analisi Se la misura dello span si discosta poco dalla curva di calibrazione la procedura di analisi non necessita di una nuova calibrazione

Frequenza delle operazioni di calibrazione NO OK Analisi Calibrazione OK NO Risultati validi Risultati analisi Non validi

Frequenza delle operazioni di calibrazione La calibrazione in genere viene fatta su almeno 5 punti La calibrazione SPAN è fatta su un solo punto (80-90% limite superiore del campo di misura La frequenza delle operazioni dipende dalla stabilità della procedura di analisi o dell’analizzatore Una calibrazione va fatta prima e dopo una serie di analisi

Frequenza delle operazioni di calibrazione Regole generali Nel monitoraggio dell’inquinamento atmosferico si fa una calibrazione SPAN ogni 24 ore In laboratorio si fa una calibrazione SPAN ad inizio e fine giornata La calibrazione a 5 punti va fatta con frequenza che dipende dalla procedura di analisi o dall’analizzatore (settimanale, mensile, annuale) e dopo che una calibrazione di SPAN abbia dato esito negativo non rimediabile

ESEMPIO Calcolo MDL - Determinazione del limite di rivelabilità per la quantificazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess). Viene misurata l’assorbanza a 534 nm di 10 campioni indipendenti del bianco. I valori di assorbanza sono: A1 = 0,005; A 2 = 0,004; A 3 = 0,006; A 4 = 0,011; A 5 = 0,008; A6 = 0,007; A 7 = 0,013; A 8 = 0,012; A 9 = 0,005; A 10 = 0,007; Dai dati risulta: Per cui la assorbanza che corrisponde al limite di rilevabilità è Da una retta di calibrazione ottenuta mediante regressione lineare dei minimi quadrati dei risultati dell’analisi di 11 soluzioni standard (intervallo di concentrazione: 7,7.10-7 M – 5,8.10-5 M) risulta una pendenza di 4,79x104 L/mole