Laboratorio n° 1: La fitotossicità

Indice della lezione Sezione teorica 1.1. Origine della fitotossicità 1.2. I sintomi della fitotossicità 1.3. Metodi di misura della fitotossicità Attività di laboratorio 3.1. Biosaggi di germinazione e sopravvivenza con plantule di Lepidium sativum 3.1.1. Produzione di estratti acquosi di residui organici a diverse concentrazioni 3.1.2 Utilizzo del carbone attivo come “controllo” 3.2. Allestimento dell’esperimento 3.3. Rilievo ed elaborazione dei dati

La fitotossicità  Stress di tipo abiotico  E’ determinato da alterazioni a livello cellulare (nella maggior parte dei casi a livello della membrana plasmatica)  Può essere indotto da una grande varietà di molecole sia inorganiche che organiche  La risposta è tipicamente concentrazione-dipendente, con effetti negativi tanto più marcati quanto è maggiore la concentrazione

Origine della fitotossicità

Risposta concentrazione-dipendente  La risposta è tipicamente concentrazione-dipendente, con effetti negativi tanto più marcati quanto è maggiore la concentrazione

I sintomi della fitotossicità

I sintomi della fitotossicità  Macroscopico: Inibizione del processo di germinazione e allungamento radicale, necrosi a livello radicale (in particolare dell’apice e Appassimento delle plantule e delle piante adulte a causa dell’arresto dell’assorbimento idrico a livello radicale Se presente a concentrazioni non letali, può determinare a livello cronico una riduzione dello sviluppo delle piante

Plantule di Calluna di 7 d Plantule di Calluna di 40 d Controllo Estratti fogliari 6 mm Plantule di Calluna di 40 d

Metodi di misura della fitotossicità

Metodi di misura della fitotossicità  Utilizzo di biosaggi (organismi biologici) particolarmente sensibili alle tossine (piante superiori, alghe ecc)  Gli esperimenti prevedono sempre un gradiente di concentrazione al fine di individuare la concentrazione che determina un’inibizione del 50% (LD50) DEFINIZIONE DI LD 50: In tossicologia il termine LD 50 sta per "Lethal Dose, 50%" e si riferisce alla dose di un materiale, somministrato in una volta sola, in grado di uccidere il 50% (cioè la metà) di un popolazione campione di cavie (generalmente ratti, ma anche altri mammiferi come cani, quando il test riguarda la tossicità nell'uomo). Allo stesso modo viene definito l' LD 90, in relazione al 90% di una popolazione di cavie. Questa misurazione fu proposta come tentativo di trovare un modo per stimare la potenzialità tossica di medicine e sostanze chimiche in generale. Questa misurazione, dato il modo di somministrazione, è un modo per testare il potenziale tossico di una sostanza solo a breve termine (tossicità acuta) e non dice niente rispetto alla tossicità a lungo termine (cioè dovuta a contatto con modiche quantità di una certa sostanza per lunghi periodi). L' LD 50 viene espresso di solito come quantità di sostanza somministrata rispetto al peso dell'animale usato come campione, normalmente mg/100g o, più spesso, in mg/kg, ovvero in milligrammi di sostanza per 100 grammi (per piccoli animali) o per chilogrammi (per animali più grandi) di peso vivo.

Il test con Lepidum sativum  Il Lepidium sativum è una crucifera particolarmente sensibile nella fase di germinazione alle tossine  Viene comunemente utilizzata per rilevare e quantificare la fitotossicità  L’esperimento consiste nel porre a germinare semi di Lepidium in capsule petri in presenza delle sostanze da saggiare. Successivamente (dopo 36-48 ore) si rileva la % di germinazione e la lunghezza della radice. Questi dati sono poi utilizzati per calcolare l’indice di germinazione come segue: Indice Germinazione = (% Semi Germinati Campione X Lunghezza media radici campione / % Semi Germinati Controllo X Lunghezza media radici controllo ) X 100

Utilizzo del carbone attivo e della soluzione nutritiva come controlli  Il controllo: tesi in cui il biotest è posto a germinare in assenza di sostanze potenzialmente fitotossiche (acqua)  Controllo “carbone attivo”: tesi in cui il biotest è posto a germinare in presenza di sostanze potenzialmente fitotossiche e di carbone attivo (capace di trattenere le molecole organiche fitotossiche). Se il carbone attivo ripristina la crescita a livelli del controllo, si può affermare che l’inibizione osservata è imputabile a fitotossicità

Allestimento dell’esperimento  Preparazione delle soluzioni da saggiare a tre concentrazioni (5%, 1,5% e 0,5% p/v) per compost e torba e la molecola purificata (acido p-idrossibenzoico: 20 mM, 2 mM e 0.2 mM)  Preparazione delle piastre con i semi di Lepidium  Avvio dell’esperimento applicando il carbone attivo (0.2 g / piastra) e le diverse soluzioni alle piastre con i semi di Lepidium

Disegno sperimentale  Materiali e compositi da testare: n° 3; - compost - torba - acido p-idrossibenzoico  Tesi da allestire (12 + 2 controlli): - 3 concentrazioni per i materiali organici e quattro per la molecola pura - presenza / assenza carbone per ogni materiale - tre repliche per ogni materiale - 25 semi per ogni piastra  Computo materiali: - compost e torba - beute per le soluzioni - 60 piastre - falcon (15 ml) per le diluizioni - marker - semi di Lepidium - carta da filtro - carbone attivo

Disegno sperimentale  Tesi da allestire (n=20) per un totale di 60 piastre: 1 – controllo (acqua) (x 3) 2 – controllo (acqua) + carbone (x 3) 3 - Torba 5% (x 3) 4 - Torba 1.5% (x 3) 5 – Torba 0.5% (x 3) 6 – Torba + carbone 5% (x 3) 7 - Torba + carbone 1.5% (x 3) 8 - Torba + carbone 0.5% (x 3) 9 - Compost 5% (x 3) 10 - Compost 1.5% (x 3) 11 - Compost 0.5% (x 3) 12 - Compost + carbone 5% (x 3) 13 - Compost + carbone 1.5% (x 3) 14 - Compost + carbone 0.5% (x 3) 15 – Acido p-idrossibenzoico 20 mM (x 3) 16 - Acido p-idrossibenzoico 2 mM (x 3) 17 - Acido p-idrossibenzoico 0.2 mM (x 3) 18 - Acido p-idrossibenzoico + carbone 20 mM (x 3) 19 - Acido p-idrossibenzoico + carbone 2 mM (x 3) 20 - Acido p-idrossibenzoico + carbone 0.2 mM (x 3)