Tecniche di Cristallizzazione

HANGING DROP 4 μl soluzione 2 μl proteina 2 μl soluzione precipitante vetrino silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

SITTING DROP vetrino 2 μl proteina + 2 μl soluzione precipitante silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

SANDWICH DROP 10 μl proteina + 10 μl soluzione precipitante vetrino silicone ~ 1 ml di soluzione precipitante

BATCH vetrino silicone proteina + soluzione precipitante

MICROBATCH 1 μl proteina + 1 μl soluzione precipitante olio di paraffina

membrana semipermeabile DIALISI membrana semipermeabile elastico proteina bottone da dialisi agente precipitante

DIFFUSIONE LIBERA ALL’INTERFACCIA capillare agente precipitante proteina cera

INSEMINAZIONE L'inseminazione è un metodo che separa fisicamente i processi di nucleazione e crescita del cristallo, così che le condizioni per la crescita possono essere ottimizzate indipendentemente da quelle per la nascita del seme. Quest'ultimo viene introdotto in soluzioni in cui la concentrazione dell'agente precipitante è tale da non indurre nucleazione spontanea. L’inseminazione può essere: omogenea eterogenea incrociata epitassiale

Nell’inseminazione omogenea si usano semi della stessa proteina che si vuole cristallizzare, in quella eterogenea i semi derivano da fonti diverse. L’inseminazione eterogenea si dice incrociata, quando il seme viene da una proteina omologa già cristallizzata, o epitassiale, quando il seme non possiede nessuna relazione con la macromolecola da cristallizzare, ma fornisce solo una superficie che catalizza la nucleazione dei cristalli.

INSEMINAZIONE Micro-inseminazione Macro-inseminazione Trasferimento di cristalli microscopici ad una soluzione di proteina con un livello di soprasaturazione più basso di quello necessario per la nucleazione. I microcristalli che vengono usati come semi si ottengono frantumando, in una soluzione stabilizzante, 3-4 piccoli cristalli dopo averli lavati in una soluzione che li scioglie leggermente. Si ottiene la soluzione stock. L'inseminazione può essere effettuata usando un sottile capillare in vetro o un micropuntale in plastica. Macro-inseminazione Prevede l'introduzione di un cristallo singolo in una soluzione prequilibrata per la crescita del cristallo in condizioni che evitino la nucleazione. In questa procedura il cristallo singolo prima di essere trasferito nella soluzione di proteina viene lavato e la superfice viene parzialmente disciolta in una soluzione a più bassa soprasaturazione.

precipitati microcristallini OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO precipitati gocce limpide gel aghi precipitati microcristallini separazioni di fase piastre cristallo

RICERCA DELLE CONDIZIONI DI CRISTALLIZZAZIONE La cristallizzazione di una proteina può essere affrontata usando un approccio basato sulla conoscenza del comportamento di proteine simili e delle proprietà della proteina in esame. Tuttavia non è ancora possibile predire le condizioni di cristallizzazione di una proteina a partire dalle sue proprietà chimico-fisiche. D'altra parte il numero totale di possibili condizioni da provare è così grande da rendere impossibile un'indagine completa. Sono stati elaborati due tipi di approcci sistematici per la ricerca delle condizioni di cristallizzazione. fattoriale completo fattoriale incompleto

FATTORIALE COMPLETO La maggior parte dei tentativi di cristallizzazione di macromolecole consistono nella realizzazione di ampie matrici di cristallizzazione. Per matrice si intende un numero (nxm) di prove, in cui due parametri (pH, concentrazione della proteina, concentrazione dell'agente precipitante, aggiunta di additivi etc.) sono variati rispettivamente n e m volte, mantenendo costanti tutti gli altri. Le matrici vengono realizzate sia utilizzando il metodo della diffusione in fase vapore, nei "plates" adatti per la tecnica "hanging drop" o per la tecnica “sitting drop", sia utilizzando il metodo del microbatch sott'olio. Questo metodo prevede il consumo di discrete quantità di proteina (nell'ordine di centinaia di milligrammi).

MATRICE DI CRISTALLIZZAZIONE 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 A B C D Proteina pH 4.6 pH 5.0 pH 5.5 5% 10% 15% Agente precipitante pH 4.2 1 2 3

FATTORIALE INCOMPLETO Consiste nel progettare statisticamente un numero minimo di esperimenti che permettano di variare simultaneamente in maniera casuale molte delle variabili che influenzano la cristallizzazione (matrice sparsa). Un'analisi statistica dei risultati (incipiente precipitazione, precipitato amorfo, precipitato microcristallino etc.) permette poi di individuare le condizioni più favorevoli per programmare esperimenti successivi, fino a trovare le condizioni che danno luogo alla crescita dei cristalli di proteina. Con un numero limitato di saggi è possibile testare l'effetto di un'ampia gamma di fattori, riducendo la quantità di campione da utilizzare.

La qualità del cristallo deve essere controllata prima di effettuare l’esperimento di diffrazione. Spesso si impiega l’analisi con il microscopio, a volte con luce polarizzata, che può evidenziare la presenza di difetti… geminazioni…

A Temperatura ambiente

almo0 NCI, Macromolecular Crystallography Laboratory, Synchrotron Radiation Research Section @ ANL

Twinning

Crystal consisting of several domains Pyramids Crystal consisting of several domains Pyramid Bipyramid Pyramid

Crystal consisting of several domains Domains regular Crystal consisting of several domains Domain 1 Twin Domain 2

Crystal consisting of several domains Domains irregular Crystal consisting of several domains Domain 1 Twin Domain 2

Crystal consisting of several domains Twinning and disorder Crystal consisting of several domains Domain 1 If size of domains Is larger than koherence length of X-rays, addition of intensities = twinning >>  If size of domains Is smaller than koherence length of X-rays, addition of amplitudes = disorder Twin Domain 2

almo0 NCI, Macromolecular Crystallography Laboratory, Synchrotron Radiation Research Section @ ANL

almo1 NCI, Macromolecular Crystallography Laboratory, Synchrotron Radiation Research Section @ ANL

almo2 NCI, Macromolecular Crystallography Laboratory, Synchrotron Radiation Research Section @ ANL

Water radiolysis reactions, forming radicals, electrons and H atoms

Glutamate (a, b) and methionine(c, d) residues x-ray induced damage in a cryo-cooled crystal of apoferritin during sequential data sets collections; solid layer represent supposed structure while reticulates refers to electrons density which, as shown, fades out as dose rises up.

Putative reaction scheme for Cys radicals formation induced by X-ray

Reaction mechanisms for the X-ray irradiation of N2OsaturatedMet solutions in the absence and presence of oxygen

a 100 K