Come si clona un gene Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Torino Alberto Piazza
Base biochimica nota Gene ignoto Clonaggio per posizione Prodotto Localizzazione cromosomica nota Prodotto genico Test funzionale Idea patogenesi Modelli animali Clonaggio per posizione e per candidati Clonaggio funzionale Clonaggio per geni candidati
Clonaggio funzionale A) Purificazione parziale di un prodotto genico B) Saggio di complementazione (test funzionale)
Purificazione parziale di un prodotto genico Clonaggio funzionale Purificazione parziale di un prodotto genico A) Frammenti di geni (oligonucleotidi) ottenuti mediante sequenziamento proteico dopo isolamento di consistenti quantità di proteina Esempio: clonaggio del gene dell’Emofilia A (FVIII) B) Anticorpi specifici Esempio: clonaggio del gene fenilalanina idrossilasi (fenilchetonuria, 1982)
Clonaggio funzionale Saggio di complementazione (test funzionale) Complementazione di un fenotipo cellulare patologico con frammenti di DNA o di cromosomi umani normale Esempio: Anemia di Fanconi (1992), AR-1/350000
Saggio di complementazione FA-A FA-A FA-B Fusione Fusione FA fenotipo wt fenotipo
Clonaggio funzionale Libreria di cDNA Trasfezione Selezione con Mitomicina C Cellule FA-C Isolamento del cDNA che complementa Gene FAC, 9q22.3
Clonaggio per posizione Localizzazione iniziale Analisi di linkage Perdita di eterozigosità Anomalie cromosomiche
Clonaggio per posizione Analisi di linkage: definizione della regione critica Saturazione della regione con nuovi marcatori Identificazione dei ricombinanti (cross-over) Linkage disequilibrium
cM D10S548 1.4 15 D10S595 14 13 5.6 12 11.2 D10S572 0.1 D10S197 2.2 D10S1775 0.2 D10S593 0.2 D10S1639 2.8 D10S1732 0.9 D10S213 3.3 D10S208
Trombocitopenia D22S277 D22S1142 D22S683 D22S283 D22S1177 D22S445
Clonaggio per posizione Identificazione dei geni nella regione critica Mappe di trascrizione Isole CpG Zoo Blotting cDNA selection Exon trapping Sequenziamento del DNA Assemblaggio di EST Progetto Genoma e relativi database
Clonaggio per posizione: Progetto Genoma
Clonaggio per posizione: Progetto Genoma
Clonaggio per posizione: Progetto Genoma
Clonaggio per posizione Anomalie cromosomiche Traslocazioni e inversioni Duplicazioni e delezioni
Clonaggio per posizione Anomalie cromosomiche Traslocazioni e inversioni Clonaggio del punto di rottura Fluorescent In Situ Hybridization
Clonaggio per posizione Anomalie cromosomiche Duplicazioni e delezioni Microdelezioni evidenziabili molecolarmente
133 202 160 244 183 170 217 164 228 127 169 135 194 150 250 179 170 219 164 234 120 157 133 202 154 252 185 170 217 164 224 120 167 133 204 156 244 195 170 229 164 234 114 153 Crom 15 133 202 160 244 183 170 217 164 228 127 169 133 164 234 114 153 D15S210 D15S128 D15S122 D15S11 GABR3 D15S97 D15S156 D15S219 D15S165 D15S98 D15S87 135 194 150 250 179 170 219 164 228 127 169 133 202 154 252 185 170 217 164 224 120 167
Clonaggio per posizione Esempi: Mediante linkage e traslocazioni X-autosoma: Distrofia di Duchenne (DMD) Mediante linkage e traslocazioni bilanciate: Neurofibromatosi (NF1) Mediante mappatura e linkage disequilibrium: Fibrosi cistica (FC)
Identificazione di un gene malattia Funzione proteica (proteomica) Terapia Farmacologica Identificazione di mutazioni Diagnosi molecolare Espressione genica Terapia genica