Valutazione del dato elettroforetico Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI Direttore della Sezione 4^ della Banca Dati Nazionale del DNA giuseppe.iacovacci@carabinieri.it

Elettroforesi Per risolvere i frammenti di DNA (alleli) prodotti dalla Multiplex PCR occorre un metodo capace di separarli in base alla taglia (lunghezza in bp). L’elettroforesi basandosi sulla capacità di risolvere specie cariche (e il DNA è carico negativamente) fornisce la tecnica d’elezione. La scelta del mezzo (sostanza interposta tra catodo e anodo) dipende dalla taglia dei frammenti da separare e dalla accuratezza necessaria.

Agarosio Vs PoliAcrilammide I gel di agarosio grazie alla loro porosità consentono di separare grossi frammenti di DNA con un bassa risoluzione. I gel di PA invece possono risolvere con una risoluzione al bp frammenti di DNA fino a 500 -1000 bp

Lastra di gel La preparazione della lastra prevede diverse fasi: Pulizia della piastre in vetro; Preparazione della soluzione che gelificherà; Colatura della soluzione e apposizione del pettine che formerà i pozzetti; Attesa della polimerizzazione e rimozione del pettine. Caricamento dell’amplificato con la soluzione di corsa nei pozzetti. Tutte queste fasi espongono l’operatore all’esposizione con la PA (che è riconosciuta NEUROTOSSICA) ed inoltre sono soggette ad errori e generano variabilità nel risulto finale. Le elevate tensioni necessarie alla corsa producono, a causa del riscaldamento indotto, fenomeni di deformazione delle bande fin’anche alla fusione del gel.

Capillare Permette di sviluppare sistemi automatici di caricamento del gel (che in questo caso assume il nome di Performance Optimyzed Polymer); Risente meno del riscaldamento indotto dalla EF; Consente di iniettare il campione in modo automatico applicando un altissimo voltaggio prima di trasferire il capillare nel buffer catodico ed effettuare la corsa. In ultima analisi risulta più sicuro e più riproducibile. Lo svantaggio iniziale legato al basso throughput è stato superato con sistemi che lavorano con array di capillari (8-24-96)

Il processo di interpretazione dei risultati Segnali analitici (picchi) I dati grezzi della corsa elettroforetica vengono acquisiti, elaborati e memorizzati in formato .hid (file «grezzi») dal software Ai file in formato .hid vengono applicati criteri di analisi e requisiti di accettabilità («soglie») impostati nel software GeneMapper® ID-X Software v. 1.4 (Life Technologies, Foster City, CA) Valutazione del tracciato elettroforetico da parte dell’analista  genotipo Interpretazione dei tracciati in accordo al modello biologico e/o al modello probabilistico Alleli/artefatti Genotipi Significato informativo e valenza identificativa dei genotipi rispetto ai confronti

Le soglie su GeneMapper® ID-X Software GeneMapper® ID-X Software v. 1.4 acquisisce file .hid e, per analizzarli, applica criteri di analisi e requisiti di accettabilità (soglie) dei segnali allelici preimpostati dal laboratorio e preferibilmente derivanti da attività sperimentali di validazione. Metodi di analisi impostati sul software GeneMapper® ID-X Software v. 1.4   Parametro analitico Metodo di analisi standard Metodo di analisi LT DNA Soglia analitica o limite di rilevabilità (AT, LoD, LDT, etc.) ? Soglia effetti stocastici (Altezza minima picchi omozigoti) Valore massimo dell’altezza dei picchi 30000 RFU Valore soglia bande stutter (Stutter ratio and distance) Locus specifico – dalla letteratura Valore Soglia sbilanciamento allelico 60% 30%

Stima empirica delle soglie Per ogni sistema di tipizzazione necessario: Rivalutare nuove soglie analitiche (AT, limiti di rilevabilità) impiegando non i controlli negativi (di PCR o di EC), ma DNA a diluizioni scalari in accordo a Bregu et al., 2013a Stabilire le soglie stocastiche (ST)b,c,d Stabilire nuove soglie bande stutterb [Analytical thresholds and sensitivity: establishing RFU thresholds for forensic DNA analysis. Bregu J, Conklin D, Coronado E, Terrill M, Cotton RW, Grgicak CM. J Forensic Sci. 2013 Jan;58(1):120-9]. STR-validator: an open source platform for validation and process control. Hansson O, Gill P, Egeland T. Forensic Sci Int Genet. 2014 Nov;13:154-66. DNA commission of the International Society of Forensic Genetics: Recommendations on the evaluation of STR typing results that may include drop-out and/or drop-in using probabilistic methods. Gill P, Gusmão L, Haned H, Mayr WR, Morling N, Parson W, Prieto L, Prinz M, Schneider H, Schneider PM, Weir BS. Forensic Sci Int Genet. 2012 Dec;6(6):679-88. The low-template-DNA (stochastic) threshold--its determination relative to risk analysis for national DNA databases. Gill P, Puch-Solis R, Curran J. Forensic Sci Int Genet. 2009 Mar;3(2):104-11.

Stima empirica delle soglie Per ogni sistema di tipizzazione rivalutare nuove soglie analitiche (limiti di rilevabilità) impiegando non i controlli negativi (di PCR o di EC), ma DNA a diluizioni scalari per realizzare curve di calibrazione in accordo a Bregu et al. (2013) perché: i segnali aspecifici (soprattutto rumore di fondo) sono anche funzione del DNA stampo presente in PCR che, quando aumenta, può portare alla comparsa di artefatti e prodotti incompleti di PCR campioni «ricchi» di DNA generano un incremento dei segnali aspecifici il metodo dei controlli negativi sottostima il reale contributo a picchi osservati derivante dai segnali aspecifici problema nei casi di miscele genetiche in cui i contributi maggioritari appaiono rilevanti (e.g.  incremento di segnali aspecifici falsamente attribuibili ad ulteriori contributori)

Definizione delle soglie (thresholds) I Soglia analitica (AT) Valore, espresso in RFU, che permette di discriminare, con idoneo grado di confidenza un segnale analitico (allele) dal rumore di fondo; in altri termini AT rappresenta il valore minimo che un segnale analitico deve assumere per poter essere affidabilmente considerato un allele Soglia che consente l’attribuzione di un valore al segnale analitico nell’elettroferogramma AT Calcolata dal laboratorio con DNA a diluizioni scalari in 175 RFU per questo colore/kit

Definizione delle soglie (thresholds) II Soglia stocastica Valore, espresso in RFU, al di sopra del quale è ragionevole assumere, con idoneo grado di confidenza (es. 99%), che gli effetti stocastici e, soprattutto, il fenomeno del drop-out allelico non si sono verificati Soglia che fornisce informazioni circa la “qualità” del segnale analitico nell’elettroferogramma ed il suo valore informativo ST

Stima empirica delle soglie stocastiche Teoria del metodo utilizzato per stabilire le soglie stocastiche Gli eventi di drop-out sono da considerarsi variabili casuali di tipo dicotomico o binario  P(Do)=0 oppure P(Do)=1 La relazione tra P(Do) (Y) ed altezza in RFU dell’allele presente ai loci eterozigoti (x o predittore) è approssimata dalla funzione di regressione logistica logit Quanto migliore è l’approssimazione tanto più affidabili sono i parametri bo (intercetta) e b1 (pendenza) La bontà dell’approssimazione è valutata mediante test chi-quadro di Hosmer-Lemeshow (goodness-of-fit test) (p<0.05  scarso adattamento)

Stima empirica delle nuove soglie stocastiche Teoria del metodo utilizzato per stabilire le soglie stocastiche Tre DNA differenti da: soggetto A: DNA da saliva su ForensiX (Prionics AG, Zurich, Switzerland) soggetto B: DNA da saliva su ForensiX (Prionics AG, Zurich, Switzerland) 2800M DNA (Promega Co, Madison, WI, USA): DNA “Nudo” estratti con BioRobot EZ1® Advanced XL e quantificati con Quantiplex HYres Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Diluizioni seriali secondo la tabella per un totale di oltre 160 campioni Tipizzazione in triplicato con AmpFlSTR NGM Select™ PCR amplification kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) (29 cicli) e 3500 XL Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) Analisi di regressione logistica sulla curva empirica tra probabilità di drop-oup [P(Do)] (Y) ed altezza del picco presente nei loci eterozigoti (RFU) (x) Valutazione della bontà di adattamento della curva di regressione logistica mediante test chi-quadro di Hosmer-Lemeshow (p<005  scarso adattamento) Stima della soglia stocastica associata ad un determinato livello di confidenza o «rischio» (es. 99%) DILUIZIONI SCALARI DNA 500 pg 250 pg 157.28 pg 125.8 pg 125 pg 100.6 pg 80.52 pg 64.4 pg 62.5 pg 50.754 pg 41.232 pg 33 pg 31.25 pg 26,4 pg 21.06 pg 15.625 pg 7.8125 pg 3.91 pg

Stima empirica delle nuove soglie stocastiche Risultati: stima soglia stocastica associata al «rischio» (99% confidenza) Osservati eventi di drop-out fino a oltre 800 RFU Mediana degli eventi di drop-out nella banda blu e rossa ~ 200 RFU Mediana degli eventi di drop-out nella banda verde e gialla ~ 300 RFU

Stima empirica delle nuove soglie stocastiche Risultati: stima soglia stocastica associata al «rischio» (99% confidenza) Osservati eventi di drop-out rilevanti per altezze ~≤ 500 RFU

Stima empirica delle nuove soglie stocastiche Risultati: stima soglia stocastica associata al «rischio» (99% confidenza) Osservati eventi di drop-out osservati per quantità di DNA ~≤ 65 pg

Stima empirica delle nuove soglie stocastiche Linea-guida laboratorio Soglia stocastica per tutte le tipologie di campioni e per tutte le bande spettrali pari a 800 RFU con un livello di drop-out atteso stimato all’1% Soglia stocastica per tutte le tipologie di campioni e per tutte le bande spettrali pari a 1000 RFU per aspettarmi, con una confidenza del 99%, un livello di drop-out stimato <1% Possibilità di stimare empiricamente (non tramite simulazioni virtuali) il valore di P(Do) in elettroferogrammi da tracce ignote

Definizione delle soglie (thresholds) III Soglia bande stutter Valore, espresso in termini relativi (%), al di sopra del quale è ragionevole assumere, con idoneo grado di confidenza (es. 99%), che gli artefatti stutter non vengano rilevati (segnali in posizione stutter > tale soglia sono da considerarsi veri segnali allelici) Soglia che consente di discriminare i veri segnali allelici dagli stutter (che rappresentano la categoria più frequente di artefatti nella tipizzazione di loci STR) Gli stutter presentano una intensità locus/allele/kit/procedura dipendente è la soglia del 15% non sempre appare adeguata

Definizione delle soglie (thresholds) IV Valore Massimo di Detection Valore, espresso in termini relativi (%), al di sopra del quale il sistema non riesce più a risolvere i singoli colori Oltre tale soglia si verifica i problema del Trasbordo Cromatico Esempio di superamento del VMD su sequenziatore 3100 con produzione del trasbordo cromatico sul giallo.-