Focalizzazione isoelettrica (IEF) Separa le proteine in base al loro pI, che può variare anche solo 0.01 unità di pH. Anfoliti = acidi poliammino-policarbossilici sintetici Molecole anfotere a basso peso molecolare Sottoposte ad un campo elettrico migrano a seconda della loro carica fino al pI Per la loro elevata capacità tamponante in ogni punto del gel il valore di pH sarà bene preciso

(ISOELECTRIC FOCUSING) IEF (ISOELECTRIC FOCUSING) La separazione viene condotta secondo un gradiente di pH, stabilito tra due elettrodi e stabilizzato dalle anfoline La continua produzione di H3O+ e OH- agli elettrodi causa un’innalzamento del pH al catodo (-) e una caduta all’anodo (+) anodo (+) (-) catodo pH

A- A+ Distanza A è una molecola anfoterica con pI=pH’ pH > pH’ = A- anodo (+) (-) catodo In corrispondenza del pI (pH’) si forma un piccolo plateau di pH pH’ anodo (+) (-) catodo Con diverse sostanze anfoteriche, o anfoline, il gradiente di pH si linearizza Distanza anodo (+) (-) catodo

Isoelettrofocalizzazione in gradienti di pH immobilizzati Le IMMOBILINE sono derivati della acrilammide, contenenti catene laterali con capacità tamponanti , che vengono polimerizzate nel gel insieme alla acrilammide. Le immobiline hanno la struttura generale O CH2=CH-C-NH-R dove R contiene sia gruppi carbossilici che amminici. La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pKa in diversa concentrazione permette di creare dei gradienti preformati di pH all'interno del gel. =

Per ogni pH diverso dal punto isoelettrico (pI) le proteine portano una carica netta e quindi potranno migrare in un campo elettrico pH < pI pH = pI pH > pI Una proteina in soluz con pH < pI acquista carica positiva e migrerà verso il catodo (-) Una proteina in soluz con pH > pI migrerà verso l’anodo (+) pH<pI + - pH>pI pH=pI le proteine possiedono una carica netta nulla, quindi non migrano più Gradiente di pH

Focalizzazione isoelettrica (IEF) di proteine con attività perossidasica di foglie di pioppo (Populus deltoides x maximowiczii, clone I-214, res, e Eridano, sens) esposte a 60 ppb di ozono per 5 h al giorno per 15 giorni (O3) o ad aria filtrata (C). C O3 C O3 RES SENS anodo (+) catodo (-)