Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico A.A. 2016-2017 Anno di Corso II Integrato: Fisiopatologia Nefrologia: metodologia clinica e terapia farmacologica e strumentale Docente: dott Giorgio Canepari Lezione n°5 L’ESAME DELLE URINE

L’ESAME DELLE URINE . ECMU= Esame Chimico-fisico e Morfologico delle Urine include di norma alcuni o tutti i seguenti tipi di indagine e relativi parametri: ispezione visiva: colore ed aspetto; analisi fisiche: volume (nelle raccolte temporizzate), concentrazione (densità relativa/conduttività/osmolalità) analisi chimiche: proteine, albumina, glucosio, chetoni, bilirubina, urobilinogeno, emoglobina, esterasi, nitriti, pH, creatinina, acido ascorbico conteggio e morfologia della componente corpuscolata: su analizzatori automatici e/o in microscopia per emazie, leucociti, cellule epiteliali, cilindri, batteri, cristalli, miceti, lipidi, parassiti, contaminanti, protozoi, cellule atipiche Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Possiamo suddividere i parametri dell’ECMU in quattro categorie: · Parametri irrinunciabili analiticamente o di indubbia utilità clinica: proteine/albumina, creatinina, concentrazione urinaria (densità relativa, conduttività, osmolalità), emoglobina, pH. · Parametri utili e di verifica analitica per il Laboratorio: esterasi, nitriti, ed ascorbato. · Parametri utili solo in particolari condizioni cliniche: glucosio, chetoni, · Parametri non utili: bilirubina, urobilinogeno Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

CORRETTA RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE URINARIO Igiene accurata senza alcol o detergenti. Possibilmente la prima minzione del mattino Mitto intermedio. (il primo getto serve per lo studio dell’uretra ). Scartare campioni troppo diluiti (PS <1015). Recipiente pulito (sterile). Analizzare l’urina entro ½ ora dalla raccolta. Conservabile a 4° per max. 2 ore. Dopo l’emissione l’urea si scinde in ammoniaca aumenta la proliferazione batterica , si innalza il pH l’eventuale glucosio viene metabolizzato e gli elementi figurati diventano irriconoscibili.

ASPETTO Piuria: si chiarifica dopo centrifugazione. LIMPIDO : normale. TORBIDO: Piuria: si chiarifica dopo centrifugazione. Alte concentrazioni di urati : si chiarifica dopo alcalinizzazione. Alte concentrazioni di ossalati : si chiarifica dopo acidificazione. Alte concentrazioni di fosfati : si chiarifica dopo ac acetico. Lattescente: chiluria. Si chiarifica dopo etere. Molto dopo l’emissione (per alcalinizzazione)= precipitazione di urati ( deposito laterizio rosa) e fosfati (deposito cotonoso biancastro).

Colorazioni insolite

Colorazioni insolite

Modificazioni della densità urinaria Densità, Peso Specifico PS : 1015-1022 ( 1001-1040) Striscia Reattiva: il metodo utilizzato nei pad reattivi dei dipstick si basa sulla determinazione degli ioni (massimamente Na+, Cl-, K+, NH4-), non viene invece rilevata la presenza di altre sostanze non ioniche (glucosio, proteine, mezzi di contrasto radiologici). Modificazioni della densità urinaria Iperstenuria : con oliguria = disidratazione. : con poliuria = diuresi osmotica ( es. diabete). Ipostenuria : con oliguria = digiuno. : con poliuria = iperidratazione,diabete insipido alcolismo acuto. Isostenuria : = IRC , pielonefrite cronica , intossicazione da piombo.

pH urinario Varia tra 4,5 e 8,5. L’uso diagnostico del pH urinario richiede che le urine siano sterili. Normalmente acido, ma dipende dalla dieta e dal momento della giornata. Per il clinico ha importanza nelle infezioni urinarie, e nella valutazione della funzionalità tubulare. ll pH urinario può influenzare la conservazione degli elementi figurati, ad esempio a pH alcalino si può avere lisi delle cellule e mancata formazione dei cilindri per interazione con la loro matrice proteica La determinazione con Dipstick ha una scarsa accuratezza Cause di urine acide. Dieta iperproteica, attività fisica, febbre, alcolismo, digiuno. Cause di urine alcaline. Dieta vegetariana ( + agrumi). Infezioni delle vie urinarie (batteri ureasi produttori).

Glucosio Limite fisiologico: 71 mg / 24 ore. Glicosurie iperglicemiche. = diabete mellito. Glicosurie normoglicemiche = a) Glicosuria renale idiopatica (0.5- 1% della popolazione). b) Tubulopatie complesse (glicosuria + aminoaciduria + fosfaturia etc) falsi negativi si possono avere in presenza di ascorbato e nel caso di infezione del tratto urinario, falsi positivi si osservano in presenza di sostanze ossidanti e nelle urine particolarmente acide. Il glucosio può essere determinato in chimica liquida utilizzando un metodo enzimatico specifico (ad esempio esochinasi o glucosio ossidasi Negli ultimi anni l’utilità clinica della determinazione del glucosio nelle urine è stata fortemente ridimensionata; nelle linee guida internazionali, i diabetologi non fanno più alcun riferimento a questo test per la diagnosi ed il monitoraggio del diabete, ormai totalmente basati su test eseguiti su siero (glicemia ed emoglobina glicata) In pazienti con normale funzione renale una glicosuria significativa compare per glicemie superiori a 180 mg/dL.

Emoglobina Tutti i metodi in dip-stik si basano sulla attività pseudoperossidasica dell’anello tetrapirrolico completo dell’atomo di ferro centrale (protoporfirina IX); la sensibilità è di circa 0.03 mg/dL, corrispondente a circa 10 emazie/microlitro. Il test risulta reattivo sia per emoglobina che per mioglobina. La sensibilità non supera l’80-90%; pertanto, non è possibile escludere la presenza di ematuria con l’utilizzo del solo dip-stick, ma è indispensabile che ad esso venga sempre associata la valutazione microscopica e/o strumentale (sedimento automatizzato) Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Proteine Rapporto tra positività allo Stick Urine e dosaggio proteinuria Clin J Am Soc Nephrol 3: 616-623, 2008.

Proteine I dipstick dosano l’albumina in valore assoluto, senza alcuna correlazione con la concentrazione del campione; pertanto, urine molto diluite possono dare Albuminurie falsamente negative e, al contrario, urine fortemente concentrate possono rilevare un’albuminuria significativa senza che questa in realtà superi i limiti fisiologici. Per ovviare a questo problema, sono state recentemente immesse nel commercio strisce reattive in grado di rilevare la ratio albumina/creatinina.

NITRITI Alcuni batteri (prevalentemente Enterobatteriacee ma non altri importanti patogeni urinari come gli enterococchi) sono in grado di convertire in nitriti i nitrati normalmente presenti nelle urine. I nitrati sono introdotti nell’organismo con una dieta ricca in vegetali freschi e la loro riduzione a nitriti da parte del metabolismo batterico richiede un lasso di tempo variabile in funzione della quantità e del tipo di batteri in causa. Pertanto, la mancata assunzione di nitrati con la dieta o la ridotta permanenza delle urine in vescica sono le ragioni per cui, anche in caso di infezioni sostenute da batteri in grado di ridurre i nitrati a nitriti il test dei nitriti nelle urine può risultare negativo. Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Esterasi leucocitaria: E’ un enzima presente nei granuli azzurrofili dei granulociti ma non nei linfociti. La presenza di leucocituria significativa può indicare la presenza di una infezione o di una flogosi delle vie urinarie. La positività dei dip-stick si verifica in presenza di esterasi rilasciata dai leucociti in corso di degenerazione. Pertanto, come per l’emoglobina, la determinazione dell’esterasi leucocitaria deve essere associata alla ricerca dei leucociti con la microscopia e/o con strumentazione automatica Tutti i dip-stick del commercio rilevano l’esterasi leucocitaria, con una sensibilità equivalente a circa 20-25 leucociti/microlitro. Tale sensibilità è minore di quella rilevata dagli analizzatori automatici (2-3 elementi/microlitro) e ai limiti di riferimento per i leucociti (10-15/ microL) Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Esame batteriologico. Urocoltura. Determinazione quantitativa della carica batterica patogena La quantità di germi viene espressa come n° di colonie per ml: CFU/ml (colony forming unity/ml) Batteriuria contaminante: < 10.000 CFU/ml Infezione delle urine: >100.000 CFU /ml  antibiogramma

Valutazione della frazione corpuscolata delle urine mediante strumentazione automatizzata. Gli analizzatori per la valutazione e quantificazione automatizzata della frazione corpuscolata delle urine sono classificabili in tre categorie in base al principio di funzionamento: · Microscopia automatizzata · Cattura di Immagini · Citofluorimetria Vantaggi degli analizzatori automatici: Esaminano urina nativa (no centrifugazione): Maggiore standardizzazione, minore variabilità analitica, minore tempo Risultati quantitativi espressi in numero di particelle per unità di volume Svantaggi: Non riconoscono bene i cilindri Non riconoscono bene i lipidi, i protozoi, numerosi cristalli segnalando generici allarmi Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Microscopia automatizzata: Il più diffuso analizzatore mediante automazione della microscopia (Cuvettebased microscopy - CBM) è l’analizzatore SediMAX (Menarini) a cui di recente si aggiunto un sistema denominato Cobas 6500 (Roche). L’analisi richiede un volume minimo di campione di 2 mL. Una aliquota di 200 μL viene iniettata all’interno di una particolare cuvetta che, una volta centrifugata, permette la formazione di un sottile film liquido su cui avviene la lettura con videocamera microscopica mediante illuminazione del campione tramite led verde ad elevata potenza. Per ogni campione possono essere analizzati più campi microscopici a 400X, visualizzati attraverso 15 fotografie. Una speciale rete neurale, supportata da un database contenente migliaia di immagini del sedimento, individua gli elementi in base alle loro caratteristiche morfologiche. Fonte: proposte per la creazione di linee guida GIAU (Gruppo Intersocietario Esame Urine)

Cattura di Immagini: Il primo analizzatore con tecnologia a cattura di immagini è stato l’analizzatore Iris iQ200 di Beckman, ora ci sono altri due sistemi, FUS 100 e 200 (Dirui) Tali sistemi incorporano un microscopio automatizzato con ottica focalizzata su cella planare a flusso laminare, nella quale le particelle contenute nel campione vengono focalizzate idrodinamicamente. Il flusso laminare consente di presentare il campione all'interno del piano focale dell'obiettivo del microscopio. Una lampada stroboscopica illumina con una frequenza di 24 flash al secondo il campione che transita attraverso la cella a flusso, consentendo ad una camera digitale miniaturizzata di riprendere, isolare e di memorizzare un elevatissimo numero di fotogrammi per campione. Ad ogni singola immagine viene sottratto il valore di fondo (background, sfondo), ripreso e digitalizzato precedentemente, esaltando in questo modo la morfologia della particella ripresa ed il suo confronto con il medium liquido. Le singole immagini di una particella sono isolate all'interno di ogni fotogramma. Il software di riconoscimento delle particelle analizza con una rete neurale ogni elemento e lo confronta con oltre 26.000 immagini univoche; quindi considerando le caratteristiche di dimensione, forma, contrasto e contenuto interno, lo classifica

Citofluorimetria: L’unico analizzatore automatizzato della frazione corpuscolata delle urine mediante citofluorimetria è l’analizzatore Sysmex UF. Combina la tecnologia impendenziometrica con la citofluorimetria ed utilizza come fonte luminosa un laser a diodi. Il campione urinario (0,8 –1,2 mL) viene sottoposto ad un processo di colorazione con due fluorocromi polimetinici in grado dilegarsi agli acidi nucleici. Dopo un processo di focalizzazione idrodinamica, il campione viene fatto passare attraverso due celle a flusso, una dedicata all’analisi dei microorganismi e l’altra dedicata all’analisi di tutti gli altri elementi corpuscolati. Il passaggio delle singole particelle viene riconosciuto con metodica impedenziometrica, che ne permette l’ accurata quantificazione e fornisce indicazioni circa le loro dimensioni. Inoltre il passaggio delle particelle sospese nel flusso laminare devia il fascio di luce laser e genera un segnale di diffrazione che viene letto da rilevatori. I parametri misurati vengono convertiti in segnali elettrici che, analizzati attraverso algoritmi matematici, permettono l'identificazione dei diversi elementi presenti nell'urina. Per caratterizzare il campione, viene inoltre misurata la conduttività della soluzione, che è indice della concentrazione di elettroliti nelle urine. Il canale dei batteri funziona analogamente a quello degli altri elementi su specifiche orientate al conteggio e differenziazione dei microrganismi presenti nelle urine

del sedimento urinario (metodica tradizionale) Esame microscopico del sedimento urinario (metodica tradizionale)

Sedimento urinario L’esame del sedimento è essenziale nella valutazione di una nefropatia: mostra elementi non riscontrabili allo stick, eritrociti e leucociti, cristalli, cilindri, cellule epiteliali. Piccole quantità di cristalli, batteri, cellule o cilindri possono essere presenti nel sedimento di individui sani anche se mancano dati certi sui limiti della normalita: problemi tecnici, notevole variabilità individuale, variabilità del numero di cellule distrutte durante la centrifugazione e quindi non contate. 0-4 GB p.c. 0-2 GR p.c. 1 cilindro ogni 10 – 20 campi Cristalli di acido urico, calcio ossalato o fosfati Esame 30 – 60 minuti dalla minzione.

Sedimento urinario: esecuzione Prima minzione del mattino Corretta igiene dei genitali esterni Scartare il primo getto dell'urina emessa. Urine fresche (eseguire entro 1 h circa) Urina del mattino: ha soggiornato durante la notte, o almeno per 3-4 ore, in vescica. È più acida e concentrata: gli elementi cellulari e i cilindri si conservano meglio. L'abbondante risciacquo elimina i residui che possono inquinare il campione; scartare il primo getto dell'urina emessa evita l'inquinamento del campione da parte delle cellule di sfaldamento e dei batteri presenti nel primo tratto dell'uretra. Eseguire l’esame in tempi rapidi perché gli elementi cellulari ed organizzati possono andare incontro ad una rapida distruzione; il pH si altera e vi è crescita batterica.

Raccolta non corretta: urine con tappeto di cellule di sfaldamento di epitelio pluristratificato (c. uroteliali superficiali) e vaginali

Sedimento urinario: esecuzione Il campione deve essere centrifugato per 10 minuti a velocità moderata, in genere una velocità compresa fra 1.000 e 1.200 rpm L'osservazione microscopica inizia utilizzando un basso ingrandimento (100 x) e poi con un maggior ingrandimento (400 x). Nel referto, normalmente, viene riportata l'indicazione del numero medio di elementi presenti in alcuni campi microscopici esaminati a forte ingrandimento (in genere 400 x).

Sedimento urinario: esecuzione Dopo la centrifugazione, è necessario eliminare accuratamente il sovranatante e si risospende, agitando delicatamente, il sedimento in modo da non danneggiare gli elementi presenti. A questo punto, il sedimento risospeso può essere osservato direttamente o dopo opportuna colorazione. In entrambi i casi, una piccola goccia del campione viene posta al di sopra di un vetrino portaoggetto che si copre poi con un vetrino coprioggetto, evitando la formazione di bolle.

Variabili più difficilmente standardizzabili : Variabili pre-analitiche e analitiche standardizzabili : Il tempo intercorso dalla emissione del campione all'analisi, Il volume del campione centrifugato, La velocità di centrifugazione, Il volume del sovranatante, La quantità del colorante e della goccia di urina sul vetrino. Variabili più difficilmente standardizzabili : La corretta raccolta del campione da parte del paziente La concentrazione urinaria.

Quadri morfologici Esame condotto in campo chiaro. In contrasto di fase. Possibile ricorso a colorazioni.

Elementi figurati Emazie, Cellule nucleate (epiteli delle vie urinarie, cellule renali e leucociti), Cilindri, Cristalli Batteri. Normalmente gli elementi osservati vengono quantificati utilizzando una delle due scale, numerica o nominale; in genere è consigliabile ricorrere alla scala numerica, espressa come numero di elementi per campo microscopico. Scala numerica 1 - 4 5- 10 10 - 20 20 - 30 > 30 Scala nominale rari pochi alcuni numerosi tappeto

Si indica come limite normale la presenza di un eritrocita, di 1-2 leucociti e di un occasionale cilindro ialino per campo microscopico. Oltre ad un'ampia variabilità individuale esiste, però, anche la possibilità che un certo numero, difficilmente valutabile, di questi elementi vada incontro ad una lisi spontanea nel periodo di tempo che intercorre tra l'emissione del campione e l'analisi.

Ematuria Lo stick evidenzia 1-2 GR per campo ed è sensibile al pari dell’esame microscopico del sedimento. Sono più frequenti i falsi positivi. Globuli Rossi dismorfici, di origine renale

Ematuria Diagnosi differenziale della provenienza delle emazie su base morfologica Ematuria di tipo urologico. Tipiche emazie non glomerulari : membrana cellulare integra, profilo regolare o dentellato. Biconcave. Integre con rigonfiamento. “Fantasmi”. Raggrinzite.

Emazie mal conservate (glomerulari ) Polimorfismo. Frattura. Frammentazione. Estrusione del citoplasma. Pigmentazione irregolare

Ballon-shaped red cells, all of similar appearance (calculi in the renal pelvis) (400x)

Hematuria: the cells are clearly abnormal (glomerulonephritis) Hematuria: the cells are clearly abnormal (glomerulonephritis). Findings of this kind indicate the red cells have almost certainly come from the glomerulus (400x)

Fungi. Considerable variation in the form of the cells Fungi. Considerable variation in the form of the cells. Abundant bacteriuria (400x)

FUNGI :different sizes of the cells, sometimes showing budding or chain formation, are considerable help in recognition (400x)

Small air bubbles trapped under the coverslip; note their refractile appearance (400x)

Droplets of exogenous fat due to inadequate cleaning of the slide Droplets of exogenous fat due to inadequate cleaning of the slide. Note their refrectile appearance, tipical arrangement in rows and the different sizes of the cells (400x)

CONTA DI ADDIS METODO : MICROSCOPIA CON CAMERA CONTAGLOBULI CLINICA : Ematuria. Leucocituria. Cilindruria. (Valutazione quantitativa). RACCOLTA : Urine 24 h. Rimescolare. Calcolare diuresi. CAMPIONE : Minimo 20 ml. Stabile 8 ore a +4°C. V.N. : Eritrociti : fino a 1.000.000/24h Leucociti : fino a 2.000.000/24h Cilindri : fino a 10.000/24h NOTE : Consegnare il campione entro 2 ore dalla raccolta.

Leucocituria Semplice ed economico screening per Infezione Vie Urinarie, ma può evidenziare leucociturie sterili: nefrite interstiziale, TBC, nefrolitiasi. WBC (arrowheads) are larger, colorless and more granular than the redder smaller RBC (arrows), which have no internal texture ù(although appear slightly biconcave).

Granulocytes 'of compact appearance' Granulocytes 'of compact appearance'. The morphology of the nucleus is unrecognizable 14 –16 micron (400x)

Piociti , fino a 30 micron

Cellule tubulari : nucleo eccentrico e brush border

Two transitional cells from the deep layers of the epithelium of the urinary tract (400x)

Cells from the surface and middle layers of transitional epithelium (250x)

Tipo di cilindri Descrizione Significato clinico Formazioni clindriche di aspetto gelatinoso, formate da una matrice proteica (proteine tubulari di Tamm-Horsfall) e da detriti cellulari o cellule di origine renale Tipo di cilindri Descrizione Significato clinico Ialini Matrice mucoproteica secreta dai tubuli Febbre, esercizio fisico, scompenso cardiaco cong., glomerulopatie Cerei Proteine sieriche, si formano nel nefrone distale (larghi! Insufficienza renale avanzata Ematici Matrice proteica con eritrociti (rossi!) Patognomonici di glomerulonefrite Cell. epiteliali tubulari Matrice proteica con cellule tubulari Necrosi tubulare (tossici), rigetto trapianto Leucocitari Matrice proteica con leucociti Pielonefrite acuta e glomerulonefrite Misti Cilindri ialini con cellule varie Glomerulonefrite, nefrite interstiziale

Cilindruria ialino Ialino-granuloso, con inclusi cellulari granuloso eritrocitario

Mixed hyaline cellular cast with fatty droplets (160x)

Cilindri cerei

Cilindro eritrocitario/pigmentario

Hyperpigmented red cell granular cast and numerous erythrocytes Hyperpigmented red cell granular cast and numerous erythrocytes. Early stages of acute glomerulonephritis (100x) (136K, jpg)

Cristalluria Cristalli pH urine Solubilità e commenti Ossalato di calcio acido e neutro Forma di “busta”; solubili in urine acidificate (HCl) Fosfato amorfo alcalino Granuli incolori solubili in urine acidificate (ac. acetico o HCL); se abbondanti  infezione Urati Varie forme, giallini, solubili in urine alcalinizzate; se abbondanti (con ac. urico)  gotta o esaltato catab. nucleico Carbonato di Granuli incolori a coppie e tetrametri; sol. in ac. acetico con effervescenza Aminoacidi (cistina, tirosina, leucina) Aminoaciduria in corso di malattie del metabolismo di specif. aa.

Uric acid: clusters of cystals (100x) (96K, jpg)

Calcium carbonate crystals may be found isolated or joined together to form dumb-bells. In the latter case they look like oxalate crystals(160x)

Monohydrate calcium oxalate (whewellite): typical biconcave disks (160x) (62K, jpg)

Dihydrate calcium oxalate (400x)

Magnesium ammonium phosphate: tipical prism-like 'coffin-lid' crystals

Plaques and prisms of calcium phosphate (100x) (89K, jpg)

Hexagonal cystine crystals (400x) (43K, jpg)

PARASSITI

Trichomonas vaginalis

Uovo di schistosoma